一種提高團花遺傳轉(zhuǎn)化瞬時表達效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。具體設(shè)及一種提高團花遺傳轉(zhuǎn)化瞬時表達效率 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 團花（Neolamarckia cadamba)，又稱黃梁木，為我國南方鄉(xiāng)±闊葉樹種，由于生長 迅速，樹干通直，因而被譽為"奇跡樹"，早在20世紀70年代就受國內(nèi)外普遍關(guān)注。其材性 與杉木相當(dāng)，速生性與按樹、楊樹相近，是較好的用材和紙漿原料樹種；樹皮含有豐富的生 物堿類，其中3 a -二氨卡丹賓和3 0 -二氨卡丹賓為治療高血壓藥物"鉤藤總堿"的有效 成分，具有強而持久的降壓作用，其效價已經(jīng)接近利血平巧ndo K,化hima Y, Kikuchi H, et al. Hypotensive principles of Uncaria hooks. Planta medica. 1983, 49(3):188-190)， 該2個生物堿類在鉤藤中僅為微量成分存在，而在團花樹皮中作為僅次于卡丹賓含量的主 要成分存在，是較好藥源樹種；此外，團花也是優(yōu)良的園林綠化樹種、蜜源樹種、飼料樹種。 由于團花用途廣、潛在經(jīng)濟價值大，有著廣闊的開發(fā)前景。雖然團花有較好的速生、豐產(chǎn)特 性，但抗寒性弱，在我國可進行人工栽培的區(qū)域受到制約；利用傳統(tǒng)的常規(guī)育種進行抗性選 育，存在周期長、變異不確定等問題；而利用植物基因工程方法對團花進行遺傳改良，具有 育種目標明確、費用低、操作簡單、重復(fù)性好、育種周期較常規(guī)育種短的優(yōu)點。
[0003] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已廣泛用于獲取新品種或進行種質(zhì)改良的研究，但獲 得轉(zhuǎn)基團植株與再生體系、農(nóng)桿菌株類型和浸染濃度、共培養(yǎng)方法和時間等諸多因素有關(guān)， 該些因素組成一個完整的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，任何一個因素的效率偏低，均會導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化效 率的下降甚至無法獲得轉(zhuǎn)基因植株。
[0004] 目前，采用團花大田枝芽（鄧小梅，詹艷玲，張倩，等.黃梁木組培快繁技術(shù)研 究.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2012, 33 (2): 216-219;林碧珍，張樹河，林加耕.團花樹組培快繁 技術(shù)研究.中國熱帶農(nóng)業(yè).2009 (3): 46-47.)、種子無菌苗子葉或下胚軸（黃浩.黃梁木地 理變異和再生系統(tǒng)的建立.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文，2014.)作為外植體，通過組織培養(yǎng)獲 得再生植株已獲成功，由于鄧小梅等、林碧珍等人采用大田枝芽作為外植體的方法，是通過 直接器官再生方式獲再生植株，該方法并不適合團花進行遺傳轉(zhuǎn)化；而黃浩采用種子無菌 苗子葉或下胚軸為外植體，是經(jīng)過愈傷組織的間接器官再生方式獲得再生植株的方法，正 是普遍用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的再生方法。在前期，我們已利用常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方 法對團花進行了試驗，但瞬時表達效率較低，轉(zhuǎn)化效率很極低。因此，需進一步對團花遺傳 轉(zhuǎn)化方法進行了優(yōu)化，目的是建立一種團花高效遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)，為團花遺傳改良特別是 抗寒、抗蟲的改良提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005] 經(jīng)文獻檢索，尚無團花遺傳轉(zhuǎn)化的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對團花在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中瞬時表達率低，轉(zhuǎn)化效率低的問題， 提供一種提高遺傳轉(zhuǎn)化瞬時表達率的方法。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)雸F花受體細 胞，提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率，建立由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的團花遺傳轉(zhuǎn)化體系。
[0007] 本發(fā)明所述的提高團花遺傳轉(zhuǎn)化瞬時表達效率的方法，包括如下步驟：
[000引 1.材料選擇
[0009] 選擇20~25d的無菌團花幼苗，切取胚軸和帶柄子葉為外植體；
[0010] 選擇帶GUS基因的植物表達載體地I 121，通過化CI2法導(dǎo)入農(nóng)桿菌C58或 LBA4404,獲得菌液C或菌液L菌液C為帶植物表達載體地I 121的農(nóng)桿菌C58菌液，菌液 L為帶植物表達載體地I 121的農(nóng)桿菌LBA4404菌液；
[0011] 植物表達載體地I 121、農(nóng)桿菌C58和LBA4404均由生物公司購買獲得。
[001引 2.菌液制備
[0013] 吸取50 y L的菌液C或菌液L，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量體積濃度比為50mg/L卡那霉素、50mg/ L利福平和25mg/L鏈霉素的100血YEB液體培養(yǎng)基中，于22°C、13化/min振蕩培養(yǎng)至菌液 ODecici值為0. 8,然后于5000r/min離屯、lOmin收集菌體，再用200血DCR液體培養(yǎng)基重懸， 于28°C、130r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液ODe。。值為0. 8~1. 0,此時帶菌液C或菌液L的DCR液 體即為遺傳轉(zhuǎn)化浸染液。
[0014] 所述Y邸培養(yǎng)基成分為；5. Og/L牛肉浸膏，1. Og/L酵母粉，5. Og/L蛋白腺，5. Og/L 庶糖，0. 04g/L M拆O4 ? 7&0,抑值為 7. 0 ;
[0015] 所述DCR培養(yǎng)基成分為；P. K. Gupta和D. J. Durzan于1985年公開發(fā)表的 DCR 配方(P.K. Gupta, D. J. Durzan. Shoot multiplication from mature trees of Douglas-fir(Pseudotsuga menziesii)and sugar pine (Pinus lambertiana). Plant Cell Imports, 1985, 4:177-179)。
[0016] 3.外植體浸染
[0017] 將切取的外植體浸入到裝有步驟2遺傳轉(zhuǎn)化浸染液的=角瓶中，輕輕搖動讓外植 體完全浸泡在浸染液中，密封好S角瓶口，在0. 05Mpa的真空干燥器內(nèi)放置5min ;
[001引 4.外植體共培養(yǎng)
[0019] 將步驟3中浸染后的外植體從遺傳轉(zhuǎn)化浸染液中取出，吸干外植體表面的農(nóng)桿 菌，然后轉(zhuǎn)移到含液體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的濕潤濾紙上共培養(yǎng)；在22°C的黑暗條件下共培養(yǎng) 6d ；
[0020] 所述液體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DCR+2.0mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+20g/L庶糖，抑 5. 2 ~5. 4 ;
[0021] 5.陽性篩選
[0022] 將共培養(yǎng)后的外植體，轉(zhuǎn)移到質(zhì)量體積濃度比為12mg/L卡那霉素和lOOmg/L頭抱 霉素的固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25±2°C、光周期為lOh/d的條件下培養(yǎng)7d ;
[0023] 所述固體分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DCR+2. Omg/L TDZ+0. 05mg/L NAA+20g/L庶糖巧.5g/ L瓊脂，p冊.8~6. 2。
[0024] 6.瞬時表達檢測
[0025] 用滅菌的超純水，將共培養(yǎng)7d后的外植體表面清凈干凈，浸沒于GUS染色液中，于 37°C的恒溫箱中溫育12h，然后轉(zhuǎn)入體積濃度比為70%的己醇溶液中脫色2~3次，每次 lOmin，最后保存于體積濃度比為70%的己醇溶液中；
[0026] 所述GUS染色液成分為：每1000血溶液含15. 601g化畔04,3. 7224g 化2抓TA，211.2mg K4[Fe(CN)e].3H2〇，164.7mg K3[Fe(CN)e]，lmL lYiton.X-lOO'O.Sg X-Gluc ;染色液的抑7. 0 ;X-Gluc在使用前需用二甲基亞諷值MSO)溶解。
[0027] 在適宜的反應(yīng)條件下，0 -葡聚糖巧酶佑U巧可將X-Gluc水解成藍色物質(zhì)，因此， 具有GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色或藍色斑點；由于團花組織和細胞不含有0-葡聚糖 巧酶，沒經(jīng)浸染的團花是無法呈現(xiàn)藍色或藍色斑點的，而經(jīng)過浸染的團花外植體，若經(jīng)GUS 染色液染色后呈藍色，表明GUS基因已轉(zhuǎn)入到團花的細胞中。
[002引浸染步驟中，先在0. 05Mpa的真空干燥器內(nèi)放置5min，然后采用濕潤濾紙共培養(yǎng) 6d的浸染方法，其瞬時表