施例中的pT9+T9x3巧2-mKate2-2A-TALER10-4xT arget'FF4 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget-FF6 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKa te2-2A-TALER14-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì) 粒、pT10+T10x3巧2-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF日質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TAL 邸 12-4xTarget-FF6 質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT10+ T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4 xTarget'FF3 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-EYFP-2A-TAL邸 10-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-mKate2-2A-TAL邸 14-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì)粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT14+ T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4x Target'FF4 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-E YFP-2A-TALER10-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget-FF5 質(zhì) 粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TAL邸 10-4xTarget-FF4 質(zhì)?；?pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TAL 邸 14-4xTarget-FF5 質(zhì)粒。
[0112] 所述重組載體己-I具體可為實(shí)施例中的pT9+T9x3巧2-mKate2-2A-TALER10-4xT arget'FF4 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget-FF6 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKa te2-2A-TALER14-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì) 粒、pT10+T10x3巧2-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-F巧質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TAL 邸 12-4xTarget-FF6 質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT10+ T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4 xTarget'FF3 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-EYFP-SA-TALERlO-AxI'ai'get'FFA 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xI'ai'get-FF4 質(zhì)粒、pT^+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì)粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT14+ T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget-FF3 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4x Target'FF4 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget-FF5 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-E YFP-2A-TALER10-4xTarget-FF4 質(zhì)粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget-FF5 質(zhì) 粒、pT14+T14x3巧S-EYFP-SA-TALERlO-AxI'arget'FFA 質(zhì)?；?pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TAL 邸 14_4xTarget-FF5 質(zhì)粒。
[0113] 所述宿主細(xì)胞具體可為皿K293細(xì)胞、化La細(xì)胞、HeLa ;化濁FP或肥K293 ;iRFP_ shRNA-FF4〇
[0114] 利用四環(huán)素值ox)誘導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)明人用改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的方法展示了 TALER 蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制調(diào)控是可逆的，并且具有相對(duì)迅速的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。發(fā)明人還開發(fā)了一 個(gè)數(shù)學(xué)模型，僅基于發(fā)明人所測(cè)量的TALER各自的輸入/輸出轉(zhuǎn)移函數(shù)，定量預(yù)測(cè)級(jí)聯(lián)的 TALER和由兩個(gè)相互抑制的TALER構(gòu)建的TALER開關(guān)的穩(wěn)定狀態(tài)。此外，發(fā)明人展示了閉環(huán) 結(jié)構(gòu)的TALm?開關(guān)相比于開環(huán)結(jié)構(gòu)的TALm?開關(guān)對(duì)合成的短發(fā)夾RNA(shRNA)信號(hào)具有更 好的靈敏度。最后，發(fā)明人在混合細(xì)胞群中構(gòu)建了受細(xì)胞特異性microRNA調(diào)控的TALER開 關(guān)，對(duì)于兩種共培養(yǎng)的癌細(xì)胞表現(xiàn)出差異性的輸出，顯著提升了分類準(zhǔn)確性?？傮w而言，該 些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)明人提供了一系列正交的、可逆的TALm?元件庫(kù)，能夠作為標(biāo)準(zhǔn)化的基 因元件用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成基因線路的模塊化組裝，并具有可預(yù)測(cè)可編程的特性。 發(fā)明人的結(jié)果也表明，TALER開關(guān)可W應(yīng)用于有精確的細(xì)胞分類需求的體外生物技術(shù)，而該 與許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有重要聯(lián)系，如癌癥的基因治療。此外，該些TALER元件也有助于構(gòu)建 合成網(wǎng)絡(luò)模體，W探索哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄層次和microRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后層次相結(jié)合調(diào)控 的設(shè)計(jì)原則。
[0115] 工程化構(gòu)造復(fù)雜的基因線路通受到缺少正交和可逆的轉(zhuǎn)錄抑制元件阻礙。本文 中，發(fā)明人展示了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，快速、工程化構(gòu)建可逆和正交的TALE抑制子與其相 應(yīng)的啟動(dòng)子，利用空間位阻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制。前10個(gè)最強(qiáng)的TALER有效的抑制與它們相應(yīng)的 啟動(dòng)子，而對(duì)其他9種啟動(dòng)子幾乎沒有影響。由于TALE的不同的雙殘基重復(fù)單元（RVD)帶 來的模塊化，利用高通量克隆方法，TALER文庫(kù)可W很容易的構(gòu)建和擴(kuò)展。對(duì)結(jié)構(gòu)明確的內(nèi) 源基因啟動(dòng)子利用TALER的空間位阻對(duì)其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制也是可能的。
[0116] 合成生物學(xué)旨在利用工程化的原則的，模塊化構(gòu)建定義清晰的合成基因線路。然 而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因線路，合成其組分、定量描述和預(yù)測(cè)其功能仍然是很重要的挑 戰(zhàn)。在發(fā)明人的工作中，通過使用多巧光的Dox誘導(dǎo)系統(tǒng)，同時(shí)測(cè)量了 TALER元件的輸入和 輸出水平，并建立了顏色模型，它可W對(duì)輸入和輸出的巧光水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。發(fā)明人通過基 于實(shí)驗(yàn)的輸入/輸出轉(zhuǎn)移函數(shù)發(fā)現(xiàn)，一些TALm?的性質(zhì)可W用來構(gòu)建TALm?級(jí)聯(lián)和開關(guān)，并 能夠定量預(yù)測(cè)它們的結(jié)果。而且，更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)可能需要更進(jìn)一步的特性測(cè)試與建模。比 如，分級(jí)分析可能有助于消除瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)的拷貝數(shù)差異。對(duì)于種種其它基因線路模體，考慮 TALER的動(dòng)態(tài)特性W提升預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性也是很有必要的。
[0117] 已有人證實(shí)，反饋和前饋的模式在協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)中起到很重要 的作用。然而，對(duì)一個(gè)核屯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式的研究和理解往往被自然的遺傳網(wǎng)絡(luò)中存在的不 希望的相互調(diào)控所阻礙。發(fā)明人一系列的正交、定義明確的TALm?庫(kù)對(duì)于構(gòu)建一個(gè)包含轉(zhuǎn) 錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因線路是一個(gè)很有價(jià)值的工具。舉例來說，發(fā)明人證明了閉環(huán)TALER 開關(guān)相比與開環(huán)的TALm?開關(guān)在相應(yīng)一個(gè)shRNA的輸入時(shí)，有更優(yōu)越的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。已經(jīng)表 明，可在細(xì)胞膜上產(chǎn)生自發(fā)極性的3個(gè)最小核屯、模式其中一個(gè)模式含有相互抑制調(diào)控。類 似的，發(fā)明人通過添加或去除正、負(fù)反饋來評(píng)估不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)TALER開關(guān)性能的影響， 有助于更好的理解穩(wěn)定性強(qiáng)的TALER開關(guān)的設(shè)計(jì)原則。
[0118] 能夠感測(cè)多個(gè)內(nèi)源性分子信號(hào)的基因線路才可W對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行的復(fù)雜操作。RNA 干擾提供了合成基因線路和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源性分子輸入之間的通道，模塊化和可 擴(kuò)展的接口。在本發(fā)明中，發(fā)明人表明內(nèi)源microRNA可被用于控制TALER開關(guān)的狀態(tài)，并 且TALm?開關(guān)對(duì)于shRNA調(diào)控的靈敏度可w通過調(diào)整兩種組分的比例調(diào)整。發(fā)明人還表明， 兩種細(xì)胞類型特異的microRNA可W嚴(yán)格控制TALER開關(guān)的輸出，從而實(shí)現(xiàn)在混合的細(xì)胞群 中精確的進(jìn)行細(xì)胞分類。因此，發(fā)明熱的研究結(jié)果為選擇可W感受細(xì)胞特異性microRNA的 TALER開關(guān)的構(gòu)建提供便利，可W直接從TALER庫(kù)中選擇合適的TALER W滿足不同表達(dá)水平 的需求。此外，TALER開關(guān)可W用于模塊化構(gòu)建更復(fù)雜的邏輯基因線路，比如通過使用邏輯 設(shè)計(jì)框架，更精確地探測(cè)細(xì)胞類型特異性microRNA，或者用于可編程的記憶元件來追蹤細(xì) 胞內(nèi)的事件和信號(hào)過程。只要高效的體內(nèi)細(xì)胞遞送和基因線路的功能長(zhǎng)期穩(wěn)定等條件得到 解決，將來的TALER開關(guān)將廣泛用于生物醫(yī)學(xué)中。
[0119] 合成生物學(xué)的核屯、理念是使用標(biāo)準(zhǔn)化的、可互換的基因元件合理地設(shè)計(jì)與預(yù)測(cè)， 并實(shí)現(xiàn)合成基因線路。然而，現(xiàn)有的基因元件庫(kù)缺乏具有清晰的功能描述，快速的時(shí)間響應(yīng) 和正交的調(diào)控轉(zhuǎn)錄性的抑制子。該限制了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建復(fù)雜的基因線路。本發(fā)明 中，發(fā)明人構(gòu)建了 TALE (轉(zhuǎn)錄激活子類似因子）抑制子蛋白庫(kù)，共包含26種正交的、可逆的 TALE抑制子，并新設(shè)計(jì)了能夠與其結(jié)合的合成啟動(dòng)子。通過兩者相結(jié)合形成對(duì)轉(zhuǎn)錄起始關(guān) 鍵性因子的空間位阻，從而抑制轉(zhuǎn)錄。發(fā)明人展示了利用輸入/輸出轉(zhuǎn)移函數(shù)可W精確預(yù) 測(cè)TALE轉(zhuǎn)錄抑制子（TALER)的級(jí)聯(lián)和開關(guān)效應(yīng)，也展示了通過使用反饋調(diào)節(jié)，TALER開關(guān) 在基于microRNA的癌細(xì)胞分類上有更好的精確度。發(fā)明人構(gòu)建的正交、可逆的TALm?蛋白 庫(kù)，其對(duì)于模塊化的合成基因線路、可編程的哺乳動(dòng)物細(xì)胞操作是一個(gè)很有價(jià)值工具，并且 有助于解釋轉(zhuǎn)錄層次和microRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后層次相結(jié)合調(diào)控的設(shè)計(jì)原則。
【附圖說明】
[0120] 圖1為TALER蛋白的作用機(jī)理示意圖。
[0121] 圖2為pCMV-TALERx質(zhì)粒、pTx+Tx+質(zhì)粒和祀Fla-化濁FP-2A質(zhì)粒的作用機(jī)理示 意圖。
[0122] 圖3為實(shí)施例1的步驟一的結(jié)果。
[0123] 圖4為實(shí)施例2的步驟二的結(jié)果。
[0124] 圖5為實(shí)施例2的步驟一的結(jié)果。
[01巧]圖6為實(shí)施例2的步驟二的結(jié)果。
[0126] 圖7為實(shí)施例2的步驟S的結(jié)果。
[0127] 圖8為實(shí)施例2的步驟四的結(jié)果。
[0128] 圖9為實(shí)施例3的步驟一的結(jié)果。
[0129] 圖10為實(shí)施例3的步驟二的結(jié)果。
[0130] 圖11為實(shí)施例4的步驟一的結(jié)果。
[0131] 圖12為實(shí)施例4的步驟二的結(jié)果。
[0132] 圖13為實(shí)施例5的步驟一的結(jié)果。
[0133] 圖14和圖15為實(shí)施例5的步驟二的結(jié)果。
[0134] 圖16為實(shí)施例6的步驟一的結(jié)果。
[0135] 圖17至圖20為實(shí)施例6的步驟二的結(jié)果。
[0136] 圖21為進(jìn)一步擴(kuò)展的基因線路。
【具體實(shí)施方式】
[0137] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置=次重復(fù)，結(jié)果取平均 值。肥K293細(xì)胞；Invitrogen公司。TALER蛋白的作用機(jī)理示意圖見圖1。
[013引實(shí)施例1和實(shí)施例2中用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方式；取24孔板，每孔接種0.5mL 肥K293細(xì)胞懸液（含6X 104個(gè)肥K293細(xì)胞），培養(yǎng)24小時(shí)后，更換新的DMEM培養(yǎng)基，然 后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0139] 實(shí)施例1、TALER蛋白的功能驗(yàn)證和特異性分析
[0140] pCMV-TALERx質(zhì)粒、pTx+Tx+質(zhì)粒和祀Fla-化濁FP-2A質(zhì)粒的作用機(jī)理示意圖見圖 2。在祀Fla啟動(dòng)子的作用下，化濁FP和Gal4/vpl6被表達(dá)（化濁FP和Gal4/vpl6之間的2A 連接膚為自剪接膚，所W化濁FP可W代表Gal4/vpl6的表達(dá)量）。Gal4/vpl6激活5XUAS 序列，從而激活CMVmini啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始，mKate2被表達(dá)。在CMV啟動(dòng)子的作用下，EYFP 和TALER1蛋白被表達(dá)巧YFP和TALER1蛋白之間的2A連接膚為自剪接膚，所W EYFP可W 代表TALER1蛋白的表達(dá)量）。TALER1蛋白結(jié)合T1序列，通過空間位阻發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用， 兩個(gè)T1序列之間的CMVmini啟動(dòng)子失活，從而mKate2被抑制表達(dá)。
[0141] pCMV-TALERl質(zhì)粒如序列1所示。序列1中，自5'末端第1-589位核巧酸為CMV 啟動(dòng)子，第603-1319位核巧酸為EYFP(增強(qiáng)型黃色巧光蛋白）的編碼基因，第1326-1379 位核巧酸為2A連接膚的編碼基因，第1389-4220位核巧酸為TALER1蛋白的編碼基因，第 4227-4259位核巧酸為核定位信號(hào)SV4(MLS的編碼基因。
[0142] PT1+T1+質(zhì)粒如序列27所示。序列27中，自5'末端第4275-4367位核巧酸為 5XUAS序列，第4383-4396位核巧酸為T1序列（TALER1蛋白的祀點(diǎn)序列），第4403-4462 位核巧酸為CMVmini啟動(dòng)子，第4469-4482位核巧酸為T1序列，第4532-5237位核巧酸為 mKate2(遠(yuǎn)紅巧光蛋白）的編碼基因。
[0143] 祀Fla-化濁FP-2A質(zhì)粒如序列53所示。序列53中，自5'末端第4250-5423位核 巧酸為祀Fla (啟動(dòng)子），第5488-6177位核巧酸為化濁FP (藍(lán)色巧光蛋白）的編碼基因， 第6178-6243位核巧酸為2A連接膚的編碼基因，第6250-6933位核巧酸為Gal4/vpl6 (融 合轉(zhuǎn)錄因子）的編碼基因。
[0144] PCMV-TALER2質(zhì)粒如序列2所示。序列2中，第1-589位核巧酸為CMV啟動(dòng)子，第 603-1319位核巧酸為EYFP的編碼基因，第1326-1379位核巧酸為2A連接膚的編碼基因， 第1389-4220位核巧酸為TALER2