本發(fā)明屬于藥物分離制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種膠孢炭疽菌中分離的化合物及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)，即老年性癡呆，是一種漸進性的、神經(jīng)衰退疾病，伴有記憶喪失和認知障礙等特征，隨著老齡化的速度加快，阿爾茨海默病患者的人數(shù)急劇增加，并逐漸上升為一個社會問題，阿爾茨海默病的治療也成為了科學(xué)界亟待解決的問題。如今，阿爾茨海默病的病因及發(fā)病機制尚未闡明。目前，國內(nèi)外臨床研究表明，乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療ad最有效的藥物，因為對乙酰膽堿酶有抑制的藥物，可顯著提高ad病人腦內(nèi)的乙酰膽堿水平，起到預(yù)防和治療ad的作用。乙酰膽堿酯酶(ache)是特異性水解乙酰膽堿(ach)的酶，主要存在于膽堿能神經(jīng)元、神經(jīng)肌肉接頭、紅細胞等組織中。因為中樞乙酰膽堿酯酶(ache)被抑制后能夠增加腦內(nèi)乙酰膽堿含量，而現(xiàn)代病理學(xué)研究顯示：腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)減少，使乙酰膽堿下降是導(dǎo)致阿爾茨海默病(ad)的關(guān)鍵原因，所以臨床上主要使用乙酰膽堿酯酶抑制劑來治療阿爾茨海默病(mayeuxr,sanom.treatmentofalzheimer'sdisease.nejm.,1999,341:1670-1679.)。藥用植物內(nèi)生真菌是一大類剛剛起步研究的新的資源微生物，隨著對藥用植物內(nèi)生真菌的深入研究，從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找新的生物活性成分已成為各領(lǐng)域的研究熱點，如農(nóng)用藥物、污水處理、石油勘探、精細化工、治療藥物、發(fā)酵及食品工程、單細胞蛋白、生物多聚物、酶制劑及人類蛋白質(zhì)遺傳工程等，其中醫(yī)藥和農(nóng)用藥物受到了更為特別的重視。本發(fā)明使用的膠孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)是從鉤藤(uncariatomentosa)上分離得到的一株菌株，本發(fā)明從膠孢炭疽菌中分離出一種化合物——膠孢炭疽菌素甲(colletotrichinea)，并通過改良的ellman法測定了該化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性，測定結(jié)果表明該化合物具有較強的乙酰膽堿酯酶抑制活性，因而該化合物能作為乙酰膽堿酯酶抑制劑用于老年癡呆癥藥物的制備。但是，到目前為止，尚未見關(guān)于從膠孢炭疽菌中分離得到膠孢炭疽菌素甲以及其對乙酰膽堿酯酶抑制活性的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明人通過大量的實驗與創(chuàng)造性的勞動，從膠孢炭疽菌中分離得到一種新的化合物，并且驚奇的發(fā)現(xiàn)，這種化合物具有有效的乙酰膽堿酯酶抑制活性。本發(fā)明的目的在于提供一種膠孢炭疽菌中分離的化合物，所述膠孢炭疽菌中分離的化合物命名為膠孢炭疽菌素甲，分子式為：c15h22o3，結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明的另一目的在于提供膠孢炭疽菌中分離的化合物的制備方法，包括以下步驟：(1)膠孢炭疽菌的發(fā)酵a.菌株活化：取已凍存好的膠孢炭疽菌菌株，在超凈工作臺中接種至pda固體培養(yǎng)基的平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天；b.接種及菌株的一級發(fā)酵：將活化的菌株接種至裝有200mlpdb液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，共設(shè)12瓶，置于28℃恒溫氣浴旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)；c.菌株的大批量發(fā)酵：配制pdb液體培養(yǎng)基共計45l，進行滅菌，滅菌結(jié)束后冷卻培養(yǎng)基至室溫；另無菌水溶解青霉素、鏈霉素各一瓶，加入發(fā)酵罐中；再將菌株一級發(fā)酵培養(yǎng)物接入發(fā)酵罐中，保持28℃，控制通氣量和保持發(fā)酵液循環(huán)，發(fā)酵21天，得菌液；(2)膠孢炭疽菌次級代謝物的提取發(fā)酵結(jié)束后將所得發(fā)酵產(chǎn)物抽濾，分別得到深褐色濾液和黑色菌絲體。發(fā)酵液50l用等體積的有機溶劑萃取三次，合并有機層，減壓濃縮，得到菌液提取物；(3)菌液提取物次級代謝產(chǎn)物的分離a.將粗提物用hpd-100大孔樹脂進行柱層析，配制乙醇體積含量分別為0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇-水洗脫液，依次進行梯度洗脫，然后棄去水洗脫部分，tlc檢測跟蹤合并，得到6個組分，分別記為：fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；b.取50g的mci-gel濕法裝柱，稱取2gfr.4樣品濕法上樣，配制乙醇與水體積比分別為0:100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0的甲醇-水洗脫液，依次進行梯度洗脫，每個梯度用5l洗脫液洗脫，每250ml收集濃縮一次，tlc檢測合并得到7個粗組分，分別記為：fr.4-a、fr.4-b、fr.4-c、fr.4-d、fr.4-e、fr.4-f、fr.4-g；c.選取fr.4-b進行硅膠柱層析，所述硅膠目數(shù)為200～300目，用石油醚-丙酮洗脫液進行洗脫，tlc點板合并，再用sephdexlh-20柱層析,然后用氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫脫色，脫色后用高效液相色譜進行分離，收集tr＝45min的峰得到膠孢炭疽菌素甲。進一步地，步驟(1)b中，所述恒溫氣浴旋轉(zhuǎn)式搖床的轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)時間為10天，發(fā)酵總體積為2.4l。進一步地，步驟(1)c中，所述滅菌是在蒸氣發(fā)生裝置上滅菌，滅菌溫度為115-118℃，滅菌時間為2.5h。進一步地，步驟(1)c中，所述滅菌是在空氣過濾器用滅菌鍋上滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時間為20min。進一步地，步驟(3)c中，所述石油醚-丙酮洗脫液中石油醚與丙酮的體積比為20:1，所述氯仿-甲醇洗脫液中氯仿與甲醇的體積比為1:1。進一步地，步驟(3)c中，所述高效液相色譜的流速為2ml/min，流動相為48％的甲醇，檢測波長為210nm，色譜柱為gemini-nx柱。本發(fā)明的又一目的在于提供膠孢炭疽菌中分離的化合物在制備抗老年癡呆藥物方面的用途。本發(fā)明提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物，通過測定所述化合物的乙酰膽堿酯酶活性，得到所述化合物具有有效的抗乙酰膽堿酯酶活性，是良好的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑；并使用所述化合物對東莨菪堿誘導(dǎo)的癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響進行了進一步研究，結(jié)果顯示所述化合物能明顯改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。另外，所述化合物的制備方法簡單，制備條件易控，可將所述化合物與藥學(xué)上可以接受的載體或其它賦型型相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成經(jīng)口服給藥的內(nèi)用型、非口服給藥的注射劑或其它劑型，在臨床上用于老年癡呆癥(阿爾恣海默癥)的治療。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物膠孢炭疽菌素甲的結(jié)構(gòu)式。圖2是本發(fā)明實施例提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物膠孢炭疽菌素甲的ir光譜圖。圖3是本發(fā)明實施例提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物膠孢炭疽菌素甲的1h-nmr譜圖。圖4是本發(fā)明實施例提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物膠孢炭疽菌素甲的13c-nmr譜圖。圖5是本發(fā)明實施例提供的膠孢炭疽菌中分離的化合物膠孢炭疽菌素甲的dept譜圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。實施例1本發(fā)明的化合物的制備：(1)膠孢炭疽菌的發(fā)酵a.菌株活化：取已凍存好的膠孢炭疽菌菌株，在超凈工作臺中接種至pda固體培養(yǎng)基的平板上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天；b.接種及菌株的一級發(fā)酵：將活化的菌株接種至裝有200mlpdb液體培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，共設(shè)12瓶，置于28℃恒溫氣浴旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)時間為10天，發(fā)酵總體積為2.4l；c.菌株的大批量發(fā)酵：配制pdb液體培養(yǎng)基共計45l，在蒸氣發(fā)生裝置上進行滅菌，滅菌溫度為115-118℃，滅菌時間為2.5h，滅菌結(jié)束后冷卻培養(yǎng)基至室溫；另無菌水溶解青霉素、鏈霉素各一瓶，加入發(fā)酵罐中；再將菌株一級發(fā)酵培養(yǎng)物接入發(fā)酵罐中，保持28℃，控制通氣量和保持發(fā)酵液循環(huán)，發(fā)酵21天，得菌液；(2)膠孢炭疽菌次級代謝物的提取發(fā)酵結(jié)束后將所得發(fā)酵產(chǎn)物抽濾，分別得到深褐色濾液和黑色菌絲體。發(fā)酵液50l用等體積的有機溶劑萃取三次，合并有機層，減壓濃縮，得到菌液提取物；(3)菌液提取物次級代謝產(chǎn)物的分離a.將粗提物用hpd-100大孔樹脂進行柱層析，配制乙醇體積含量分別為0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇-水洗脫液，依次進行梯度洗脫，然后棄去水洗脫部分，tlc檢測跟蹤合并，得到6個組分，分別記為：fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6；b.取50g的mci-gel濕法裝柱，稱取2gfr.4樣品濕法上樣，配制乙醇與水體積比分別為0:100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0的甲醇-水洗脫液，依次進行梯度洗脫，每個梯度用5l洗脫液洗脫，每250ml收集濃縮一次，tlc檢測合并得到7個粗組分，分別記為：fr.4-a、fr.4-b、fr.4-c、fr.4-d、fr.4-e、fr.4-f、fr.4-g；c.選取fr.4-b進行硅膠柱層析，所述硅膠目數(shù)為200～300目，用石油醚與丙酮的體積比為20:1的石油醚-丙酮洗脫液進行洗脫，tlc點板合并，再用sephdexlh-20柱層析,然后用氯仿與甲醇的體積比為1:1的氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫脫色，脫色后用高效液相色譜進行分離，高效液相色譜的流速為2ml/min，流動相為48％的甲醇，檢測波長為210nm，色譜柱為gemini-nx柱，收集tr＝45min的峰得到膠孢炭疽菌素甲。實施例2本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)式的確定和驗證：(1)化合物的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)無色油狀，旋光度：30；展開體系為石油醚：丙酮＝2:1，硫酸乙醇顯色為淡黃色斑點。(2)化合物分子式的確定結(jié)合1h-nmr以及13c-nmr數(shù)據(jù)及hresims(實測值273.1466[m+na]+，計算c15h22o3na值為273.1461)，確定其分子式為c15h22o3。(3)化合物結(jié)構(gòu)式的確定如圖2所示，通過ir光譜數(shù)據(jù)顯示化合物中含有羥基以及羰基(νmax＝3406,1724cm-1)。1h-nmr，13c-nmr和dept譜圖(如圖3-圖5所示)顯示三個甲基，三個sp3亞甲基，一個sp2亞甲基，兩個sp3次甲基，一個sp2次甲基，兩個sp3季碳，兩個sp2季碳和一個羰基碳的信號。現(xiàn)已知一化合物2(aspergiketone)，其結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明化合物記作化合物1，將化合物1與化合物2相比較，它們的1h-nmr，13c-nmr波譜極為相似，且兩者具有相同分子式，表明化合物1和化合物2為異構(gòu)體，通過2d-nmr(1h-1hcosy，hmqc，hmbc)的分析，進一步表明兩者為異構(gòu)體。在化合物1的1h-nmr譜中，h-5信號消失并出現(xiàn)四重h-4信號(2.58(q，j＝6.6hz))和雙峰me-14(0.97(d，j＝6.6hz))信號，表明化合物1中的一個羥基在c-5處而不是在c-4處?；衔?與化合物2相比，c-5(δc74.2)出現(xiàn)在較低場，進一步表明化合物1的c-5處有一個羥基相連。在化合物1的hmbc譜中，觀察到h-15/c-5，h-14/c-5的hmbc相關(guān)峰，這進一步表明在c-5處有羥基連接。通過noesy光譜確定了化合物1的相對構(gòu)型，noesy譜(cd3socd3)中5-oh/h-14，1-oh/h-14，1-oh/h-2的相關(guān)峰，表明5-oh，h-14，h-2和1-oh位于同側(cè)。綜上所述，可確定本發(fā)明化合物膠孢炭疽菌素甲的結(jié)構(gòu)如下：本發(fā)明化合物膠孢炭疽菌素甲(記作化合物1)及已知化合物2的nmr數(shù)據(jù)見下表1、表2所示：表1化合物1與化合物2的1hnmr數(shù)據(jù)表2化合物1與化合物2的13cnmr數(shù)據(jù)no.1incdcl32incdcl3no.1incdcl32incdcl3176.174.8951.838.1259.056.110116.5116.4320.3209.611140.2140.2454.174.81218.818.8574.252.61326.626.66147.8145.3147.722.4729.829.415109.4112.6836.436.5實施例3本發(fā)明化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性試驗：(1)本發(fā)明的化合物的乙酰膽堿酯酶抑制活性測定采用改良的ellman法測定化合物膠孢炭疽菌素甲的乙酰膽堿酯酶抑制活性，石杉堿甲作為陽性對照藥，具體實施步驟如下：采用改進的ellman法測定，操作步驟為：在96孔酶標(biāo)板中依次加入140μlpbs(0.1mph＝8.0)，20μl樣品溶液(終濃度為1mg/ml)，15μlache(0.28u/ml,ph＝8.0pbs溶解稀釋)。4℃孵育20min后，加10μldtnb(0.075mol/l)及10μlatci(0.01mol/l)。37℃孵育20min，用酶標(biāo)儀在405nm下測定其吸光度值。其中，空白組用20μlpbs(ph8.0)代替20μl樣品溶液；完全抑制組用20μl石杉堿甲(0.125mg/ml)代替20μl樣品溶液。樣品本底組用15μlpbs(ph＝8.0)代替15μlache(0.28u/ml，ph＝8.0pbs溶解稀釋)。所有樣品平行做三次，取其平均值。測得吸光度值，通過以下公式計算其抗乙酰膽堿酯酶抑制率：通過量效關(guān)系和直線回歸法可以計算出樣品對酶的半數(shù)抑制濃度(ic50)，結(jié)果表明該化合物對乙酰膽堿酯酶具有較好的抑制活性，并測定了該化合物的半數(shù)抑制濃度(ic50)，發(fā)現(xiàn)ic50較低，說明具有較強的乙酰膽堿酯酶抑制活性，實驗數(shù)據(jù)見表3。表3化合物對乙酰膽堿抑制活性百分抑制率(50μg/ml)ic50(nm)化合物膠孢炭疽菌素甲73％33.3ug/ml石杉堿甲(陽性藥)100％75(2)morris水迷宮實驗健康wistar大鼠10只為空白對照組、東莨菪堿誘導(dǎo)認知障礙的動物模型50只，隨機分為模型組、陽性對照組(石杉堿甲)、高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組各10只，動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后給藥。本發(fā)明化合物膠孢炭疽菌素甲，石杉堿甲，以生理鹽水調(diào)配后灌胃給藥，給藥劑量：高劑量5mg/kg，中劑量2.5mg/kg，低劑量1.25mg/kg；陽性對照藥石杉堿甲0.15mg/kg，參照臨床成人用量：每天0.3mg/kg；空白對照組給與等容積的生理鹽水，均灌胃給藥(ig)，給藥容量均為10ml/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周后，進行水迷宮檢測，除空白對照組用等體積的生理鹽水灌胃，其他各組均在訓(xùn)練前灌胃給藥東莨菪堿2mg/kg。采用mwm測試法，進行定位航行實驗和空間探索實驗。水迷宮置于房間中間，為一圓形水池，直徑200cm，高100cm，水深30cm，水溫保持在25±1℃。根據(jù)東(e)、南(s)、西(s)、北(n)方位將水池等分為東北(en，象限1)、西北(wn，象限2)、東南(es，象限3)、西南(ws，象限4)四個象限。在en象限(象限1)中心放置一平臺，平臺為圓形，直徑10cm，平臺高29cm，即平臺低于水面1cm，稱隱藏平臺。迷宮正上方高處裝有一個小型攝像機和一條電管，并與錄像機和監(jiān)視器連接，記錄大鼠的游泳軌跡和游泳時間。迷宮水池里倒入適量sio2，使池里水能被均勻染白。水池由一可密閉的布袋密閉，測試程序如下：①定位航行實驗(placenavigation)：共進行5天。mwm實驗的第1天至第6天，進行定位航行試驗。平臺位于第1象限，沒于水下1cm，大鼠入水點為各象限池壁中點，每天分上下午兩個時間段，每一個時間段每鼠訓(xùn)練次，將大鼠面向池壁由個入水點放入次池中，測其120s內(nèi)成功進駐平臺所需時間(即逃避潛伏期，escapelatency)，如在120s內(nèi)大鼠不能成功進駐平臺，則實驗者將其引上平臺并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為120s。②空間搜索實驗：最后一天，撤去平臺，讓大鼠自由游泳，測其尋求次數(shù)，實驗結(jié)果見表4。表4各組mwm行為學(xué)相關(guān)參數(shù)5天均值總體比較組別動物數(shù)(只)潛伏期(s)尋找次數(shù)空白對照組1027.57±17.53**14.85±4.035**模型組1040.34±19.859.22±3.158陽性對照組1029.19±18.56**13.73±3.863**高劑量組1033.25±17.12*11.86±4.175*中劑量組1035.48±15.32*10.31±4.391*低劑量組1037.61±12.759.54±3.812注：與模型組相比，*p﹤0.05，**p﹤0.01。實驗結(jié)果表明：與模型組比較，化合物高、中劑量組的的潛伏期明顯低于模型組，尋找次數(shù)均高于模型組，且跟模型組比均由顯著性差異。說明本發(fā)明化合物膠孢炭疽菌素甲對癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力起到了明顯改善作用，具有抗癡呆作用。因而可將所述化合物與藥學(xué)上可以接受的載體或其它賦型型相結(jié)合，按照常規(guī)方法制成經(jīng)口服給藥的內(nèi)用型、非口服給藥的注射劑或其它劑型，在臨床上用于老年癡呆癥(阿爾恣海默癥)的治療。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12