一種黑葡萄穗霉菌單端孢霉烯族a類毒素菌株的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于真菌毒素菌株檢測領(lǐng)域，具體涉及一種黑葡萄穗霉菌(^tachybo trysChartarum)單端孢霉稀族A類毒素菌株的分子檢測方法，本發(fā)明可用于谷物、飼料、食品安全和環(huán)境中黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)單端孢霉烯族A類毒素的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]黑葡萄穗霉(51于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，絲抱目(Hyphomycetales),暗色抱科(Dematiaceae)，葡萄狀糖霉屬{Stachybotrys^.黑葡萄穗霉廣泛存在于環(huán)境中并對人類生活造成嚴(yán)重影響，黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)單端毒素具有極強(qiáng)的致癌性和廣泛的污染性，并且難以去除，是單端毒素的監(jiān)測與控制已成為影響食品工業(yè)安全的重要因素之一。
[0003]目前，國內(nèi)外有關(guān)黑葡萄穗霉及其代謝產(chǎn)物的檢測方法包括以下幾個方面: ①免疫學(xué)方法:Van等采用黑葡萄穗霉中獲得的穗霉菌溶血素制備抗體，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來分析人血清和環(huán)境樣品中穗霉菌溶血素；②熒光探針及PCR的應(yīng)用Haugland等應(yīng)用TaqMan熒光探針系統(tǒng)實(shí)時檢測PCR產(chǎn)物來定量測定空氣樣品中黑葡萄穗霉孢子，在定量檢測不同污染房屋空氣樣品中黑葡萄穗霉孢子時，該法與直接計(jì)數(shù)結(jié)果一致，R0e等也采用TaqMan熒光探針實(shí)時檢測PCR產(chǎn)物，用來分析室內(nèi)粉塵樣品中產(chǎn)毒真菌種類；③氣相色譜P質(zhì)譜聯(lián)機(jī):Gao等應(yīng)用氣相色譜P質(zhì)譜研究黑葡萄穗霉產(chǎn)生的特殊生物揮發(fā)性有機(jī)化合物，發(fā)現(xiàn)對于一個特定菌株，在不同培養(yǎng)基上可產(chǎn)生明顯不同的揮發(fā)性有機(jī)化合物，因此，可應(yīng)用標(biāo)記的特殊揮發(fā)性有機(jī)化合物作為指紋圖譜來鑒別室內(nèi)環(huán)境中真菌；④指示微生物=Zaichenko等在研究中發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞的藍(lán)綠菌對他們研究的所有葡萄狀穗霉毒素高度敏感，認(rèn)為藍(lán)綠菌可作為檢驗(yàn)這類毒素的指示微生物。
[0004]在毒素產(chǎn)生之前，從黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)毒素產(chǎn)毒菌源頭進(jìn)行監(jiān)控，將是控制毒素污染的有效方式。免疫學(xué)方法、熒光探針及PCR方法、氣相色譜P質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法、高效液相色譜法等可以鑒定毒素種類、孢子濃度和真菌種類，但操作繁瑣，過程復(fù)雜。指示微生物法雖然可以作為檢測毒素菌株的方法，但是缺乏唯一性，其他傳統(tǒng)方法因其繁瑣費(fèi)時費(fèi)工、靈敏度差等缺點(diǎn)而無法滿足現(xiàn)代工業(yè)實(shí)時快速檢測訴求；因此，開展黑葡萄穗霉菌(5:Chartarum)產(chǎn)毒菌菌株快速分子檢測方法的研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在提供一種黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)單端孢霉烯族A類毒素菌株的分子鑒定方法，能夠解決傳統(tǒng)培養(yǎng)法、發(fā)酵產(chǎn)生毒素、高效液相色譜法檢測、核磁共振和質(zhì)譜等方法和過程的繁瑣、費(fèi)時、費(fèi)工等缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)鑒定方法相比，分子鑒定具有簡單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可為產(chǎn)毒真菌危害的早期預(yù)警提供可靠的技術(shù)支持，對有效防控真菌毒素污染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是針對黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)單端孢霉A類毒素，通過Tri5基因信息設(shè)id^ —對特異性引物，從黑葡萄穗霉菌(5: Chartaruni)分離得到單端孢霉烯族A類毒素菌株的特異性片段(其長度為460bp)，而不產(chǎn)單端孢霉烯族A類毒素的黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)中不能擴(kuò)增到該特異片段，采用PCR反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，直接根據(jù)產(chǎn)物片段的有無及大小，即可確定某一黑葡萄穗霉菌(5:是否產(chǎn)單端孢霉烯族A類毒素。具體步驟為:1)根據(jù)Tri5基因信息設(shè)計(jì)一對高度特異性引物，上游引物tri5Sl:5’ -CCTCACCCTCAGATGTTGACATAC-3’和下游引物tri5S2:5’-TCCTTGTAGAAGGACATGAGGTCG-3’ ;2)利用該引物對黑葡萄穗霉菌的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，分離得到長度為460bp的條帶的單端孢霉烯族A類毒素菌株的特異性片段；4)根據(jù)產(chǎn)物片段的有無，或者能得到的條帶片段的長度是否為460bp，即可確定某一黑葡萄穗霉菌是否產(chǎn)單端孢霉烯族A類毒素。
[0007]本發(fā)明的特點(diǎn)還在根據(jù)Tri5基因全長信息設(shè)計(jì)一對特異性引物，該引物具有高度特異性，引物序列為:上游引物tri5Sl:5-CCTCACCCTCAGATGTTGACATAC-3’和下游引物tri5S2:5 ‘-TCCTTGTAGAAGGACATGAGGTCG-3’。利用該引物對黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)條件為:擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C (10min)-94°C(Imin) -53°C (30snd) -72°C (Imin) -4°C (lOmin)，38 個循環(huán)；利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，分離得到單端孢霉烯族A類毒素菌株的特異性片段(其長度為460bp的條帶)，而不產(chǎn)單端孢霉烯族A類毒素的黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)中不能擴(kuò)增到該特異片段；直接根據(jù)產(chǎn)物片段的有無及大小，即可確定某一黑葡萄穗霉菌(5: Chartarum)是否產(chǎn)單端孢霉稀族A類毒素。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:1.快速準(zhǔn)確；2.適用于黑葡萄穗霉菌(5: CAsriariM?)菌株的篩選，具有高度特異性；3.減少了菌株發(fā)酵生產(chǎn)毒素緩慢的過程和盲目性；4.由于單組毒素種類較多，避免了高效液相檢測的復(fù)雜性和使用標(biāo)準(zhǔn)品過多的現(xiàn)象；5.大大降低了檢測的成本和費(fèi)用；6.方便、操作簡單、省時省工。
【具體實(shí)施方式】
[0009]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0010]根據(jù)黑葡萄穗霉(5: Chartarum)單端孢霉稀生物合成基因tri5全長基因信息，設(shè)計(jì)合成特異引物:上游引物tri5Sl:5’ -CCTCACCCTCAGATGTTGACATAC-3’和下游引物tri5S2:5’ -TCCTTGTAGAAGGACATGAGGTCG-5’。
[0011]黑葡萄穗霉(5: Chartarum)菌株的發(fā)酵培養(yǎng):液體培養(yǎng)基F1D配方:土豆200g，葡萄糖15-20g，蒸餾水1000ml，pH自然。培養(yǎng)條件:用250ml三角燒瓶，盛取80_150miro培養(yǎng)基，置于全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-28°C，轉(zhuǎn)速150-300轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時間4_7天，待菌絲球長成時，用雙層無菌紗布過濾，即可得到新鮮菌絲，菌絲用無菌紗布包裹后，立即用液氮處理研磨成粉末或者暫短置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｆ渲械拇龣z測的生物樣品是受黑葡萄穗霉毒素污染的籽粒、飼料或食品，或是受黑葡萄穗霉毒素病菌侵染的植物的植株和組織。
[0012]DNA提取:使用CTAB法提取黑葡萄穗霉(5: Chartarum)菌株DNA。CTAB法①取0.2g各已保存?zhèn)溆没蛘咭训玫降男迈r菌絲樣品分別用液氮(I)、玻璃砂(II)、氧化鋁(III)研磨；②加入56°C 10倍預(yù)熱的緩沖液C于56°C溫育30min，離心，取上清液加入等體積氯仿-異戊醇(24: I)抽提(室溫，不能低于15°C，否則CTAB會沉淀)，1000g離心15min 取上清液加入1/10倍體積緩沖液D，于室溫下放置15min，再用等體積氯仿-異戊醇(24: I)抽提I次；④上清液加入緩沖液C于室溫下放置6h (或過夜)12000g離心25min，吸去上清液，用70%乙醇洗沉淀2~3次，加入150 μ L緩沖液Ε，存于4°C備用，緩沖液 C (50_1.L-1Tris-HCl，ρΗ8.0，1mmol.L_1EDTA，0.7mol.L-1NaCl, 1%β -巰基乙醇，1%CTAB。緩沖液 D (10%CTAB，0.7mol.L-1NaCl)。緩沖液 E (1mmol.L-1Tris,Immol.L-1EDTA.pH8.0)。
[0013]PCR擴(kuò)增:以提取的樣品DNA為模板，以設(shè)計(jì)合成的特異引物為引物，進(jìn)行毒素基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:10X擴(kuò)增緩沖液1ul,種dNTP混合物各200umol/L，引物各 10~100pmol，模板 DNA0.l~2ug，TaqDNA 聚合酶 2.5u，Mg2+1.5mmol/L,加雙或三蒸水至10ulo 擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C (1min) -94°C (Imin) -53°C (30snd) -72°C (Imin) -4°C(1min)，38 個循環(huán)。
[0014]制備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml):稱取0.7g (0.5g)瓊脂糖置于錐形瓶中，加入70ml (50ml) IXTAE或者TBE，瓶口倒扣小燒杯，微波爐加熱煮沸2~3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。
[0015]膠板制備:取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板，取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子，將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將