馬鈴薯中t-2毒素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及T-2毒素的提取方法，尤其涉及馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，屬于 T-2毒素的檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 干腐病是影響馬鈴薯貯藏質(zhì)量的一種真菌病害，其主要致病菌為鐮刀菌。由于窖 藏過程中窖溫高，濕度大，鐮刀菌侵染的薯塊會(huì)出現(xiàn)腐爛變質(zhì)導(dǎo)致"爛窖"，對中國的馬鈴薯 產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在鐮刀菌侵染馬鈴薯的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生大量的單端孢霉烯族 毒素如T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，即嘔吐毒素）、蛇形霉素（DAS)等，其中T-2毒 素主要影響血液、肝臟、腎臟、胰腺肌肉及淋巴細(xì)胞的功能，人和家畜若誤食則會(huì)導(dǎo)致厭食、 嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經(jīng)機(jī)能障礙，甚至死亡。
[0003] 因此，開發(fā)一種新的馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，對于實(shí)現(xiàn)馬鈴薯干腐病中的 T-2毒素的準(zhǔn)確檢測顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，該方法操 作簡便、T-2毒素的提取率高。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明公開了一種馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，包括以下步驟：將馬鈴薯粉碎， 加入樣品提取液，震蕩，離心，取上清液，即得。
[0007] 本發(fā)明中離心后向上清液中加入稀釋液進(jìn)行稀釋，即可用于ELISA檢測。其中，上 清液與稀釋液的體積比為1 :5 ;所述稀釋液為甲醇和水按照體積比10 :90組成的混合液。
[0008] 本發(fā)明馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，按照g/ml計(jì)，馬鈴薯與樣品提取液的比例 為I:10-30 ;優(yōu)選為 1 :20。
[0009] 所述樣品提取液為甲醇和水按照體積比20-80 :20-80組成的混合液；優(yōu)選為甲醇 和水按照體積比50-80 :20-50組成的混合液；最優(yōu)選為甲醇和水按照體積比60 :40組成的 混合液。
[0010] 本發(fā)明對樣品提取液中甲醇的濃度進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，甲醇濃度（即樣品提取液 中甲醇的體積百分比）分別為 10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、80%， 50rpm震蕩3min，3000rpm離心3min，然后進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的提 高，T-2毒素的提取量提高；當(dāng)采用60 %的甲醇溶液提取，針對6種不同的鐮刀菌都具有最 高的提取量；繼續(xù)提高甲醇濃度，T-2毒素的提取量開始下降。其中，針對1-6號(hào)鐮刀菌，采 用60%甲醇溶液提取，T-2毒素的提取量分別比55%甲醇濃度的處理提高40% -146. 2%。 因此，本發(fā)明選擇60%甲醇溶液為樣品提取液，即甲醇和水按照體積比60 :40組成的混合 液。
[0011] 本發(fā)明所述震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為50-200rpm，震蕩的時(shí)間為3-10min;優(yōu)選的，所述震蕩 的轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，震蕩的時(shí)間為5min。所述離心的轉(zhuǎn)數(shù)為3000-4500rpm，離心的時(shí)間為 3-10min;優(yōu)選的，所述離心的轉(zhuǎn)數(shù)為4000rpm，離心的時(shí)間為5min。
[0012] 本發(fā)明在確定了樣品提取液的基礎(chǔ)上，為了提高毒素的獲得量，進(jìn)一步對震蕩的 轉(zhuǎn)數(shù)和震蕩時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)分別為50、100、150、200rpm，時(shí)間分別為3、5、8、 lOmin。結(jié)果表明，優(yōu)化震蕩處理可以顯著提高毒素的提取率，震蕩轉(zhuǎn)數(shù)150rpm條件下，1-6 號(hào)菌的T-2毒素的提取量均高與其他轉(zhuǎn)數(shù)；其中，在震蕩轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，震蕩時(shí)間為5min 條件下，6種不同的鐮刀菌T-2毒素的提取量均最高；與震蕩轉(zhuǎn)數(shù)150rpm，時(shí)間3min條件下 相比，1-6號(hào)菌的T-2毒素提取量分別提高了 7% -21. 4% ;繼續(xù)延長震蕩時(shí)間，1-6號(hào)菌的 T-2毒素提取量開始下降。因此，本發(fā)明選擇震蕩轉(zhuǎn)數(shù)150rpm，震蕩時(shí)間為5min。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步對離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，離心的轉(zhuǎn)數(shù)分別為3000、3500、 4000、4500rpm，離心時(shí)間分別為3、5、8、lOmin。結(jié)果表明，離心轉(zhuǎn)數(shù)4000rpm、不同離心時(shí)間 條件下，1-6號(hào)菌的T-2毒素的提取量均高于其他轉(zhuǎn)數(shù)；其中，采用離心轉(zhuǎn)數(shù)為4000rpm，離 心時(shí)間為5min，6種不同的鐮刀菌T-2毒素的提取量最高，與離心轉(zhuǎn)數(shù)4000rpm，時(shí)間3min 條件下相比，1-6號(hào)菌的T-2毒素提取量分別提高了 2% -9. 8%;繼續(xù)延長離心時(shí)間，1-6號(hào) 菌的T-2毒素提取量開始下降。因此，本發(fā)明選擇離心轉(zhuǎn)數(shù)4000rpm，離心時(shí)間為5min。 [0014] 綜上，本發(fā)明優(yōu)化了馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，選擇甲醇和水按照體積 比60 :40組成的混合液為樣品提取液，震蕩轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，震蕩時(shí)間為5min，離心轉(zhuǎn) 數(shù)為4000rpm，離心時(shí)間為5min，最終6種不同的鐮刀菌T-2毒素的提取率最高。其 中，黃色鐮刀菌（F.culmorum)感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為I. 23ng/g、燕麥 鐮刀菌（F.avenaceum)感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為3. 04ng/g，擬絲孢鐮刀 菌（F.trichothecioides)感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為0. 81ng/g、擬枝孢鐮刀 菌（F.sporotrioides)感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為4. 12ng/g、接骨木鐮刀菌 (F.sambucinum)感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為1.43ng/g、腐皮鐮刀菌藍(lán)色變種 (F.solanivar.coeruleum(Sacc))感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為0? 94ng/g。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明馬鈴薯中T-2毒素的提取方法，優(yōu)化了薯塊中T-2毒素的提取液濃度、震 蕩條件和離心條件，獲得較好的提取效果；該方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡便快速，經(jīng)濟(jì) 尚效等優(yōu)點(diǎn)，為相關(guān)部門的檢驗(yàn)檢疫及植物病害檢測和實(shí)踐應(yīng)用提供了一種尚效快捷的方 法。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0019] 黃色鐮刀菌（F.culmorum)(記為1號(hào)菌）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum)(記 為2號(hào)菌），擬絲孢鐮刀菌（F.trichothecioides)(記為3號(hào)菌）、擬枝孢鐮刀菌 (F.sporotrioides)(記為4號(hào)菌）、接骨木鐮刀菌（F.sambucinum)(記為5號(hào)菌）、腐皮鐮 刀菌藍(lán)色變種（F.solanivar.coeruleum(Sacc))(記為6號(hào)菌），以上菌種由發(fā)明人實(shí)驗(yàn) 室分離鑒定，根據(jù)閔凡祥和李鳳蘭等人分離鑒定方法進(jìn)行（閔凡祥，王曉丹，胡林雙，魏琪， 董學(xué)志，李鳳蘭，李鶴春，劉偉婷，郭梅，黑龍江省馬鈴薯干腐病菌種類鑒定及致病性，2010， 36⑷：112-115;李鳳蘭，蔣先鋒，史麗娟，韓鋒，魏琪，馮艷忠，崗凡祥，郭梅，李學(xué)湛，兩株 馬鈴薯干腐病病原菌的分離和鑒定，作物雜志，2013,4:125-128。）；
[0020] 馬鈴薯品種為克新13號(hào)；
[0021]T2毒素ELISA檢測試劑盒，購于北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。
[0022] 實(shí)施例1馬鈴薯樣品中T-2毒素的提取
[0023] 取黃色鐮刀菌（F.culmorum)侵染的馬鈴薯薯塊lg，用研缽研磨粉碎后移入50ml 錐形瓶中，用60%甲醇溶液（指甲醇和去離子水按照體積比60 :40組成的混合液）作為樣 品提取液，用量為20ml，沖洗研缽收集樣品殘?jiān)徊⒁迫脲F形瓶中，然后用搖床充分震蕩混 勻，震蕩的轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm，時(shí)間為5min;將錐形瓶中的液體移入到50ml離心管中，離心的轉(zhuǎn) 數(shù)為4000rpm，離心時(shí)間為5min;離心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10 %甲醇溶液 (為甲醇和水按照體積比10 :90組成的混合液）于4ml離心管中，放于冰箱中2-8°C保存以 供ELISA檢測。
[0024] 經(jīng)ELISA檢測，黃色鐮刀菌感染的馬鈴薯中T-2毒素的提取量為I. 23ng/g。
[0025] 實(shí)施例2馬鈴薯樣