可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢桿菌及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢桿菌及其用途。本發(fā)明的液化淀粉芽孢桿菌擁有優(yōu)異的去除玉米烯酮毒素的活性，并且不具有溶血性、不產(chǎn)生腸毒素、能耐酸性與可于膽鹽環(huán)境中生長，更具有聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶與蛋白酶等酵素活性。DSM3211920150817
【專利說明】
可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢桿菌及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種可去除霉菌毒素的生物性方法，尤其是關(guān)于一種可去除霉菌毒 素的液化淀粉芽孢桿菌及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 飼料或是食物原料于農(nóng)作物收獲前后、加工過程、運(yùn)輸或儲存期間，皆有機(jī)會遭 受霉菌感染，并產(chǎn)生具有毒性的二次代謝產(chǎn)物，即霉菌毒素（mycoxtoxin)。霉菌毒素不僅 會導(dǎo)致動物與人類的疾病，也會造成經(jīng)濟(jì)上的損失，包括谷物本身質(zhì)量好壞、飼料與食品 安全的顧慮，以及對谷物市場與貿(mào)易的沖擊。因此，霉菌毒素不僅會引起公共衛(wèi)生問題， 也會產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)與糧食問題。世界各地常見的霉菌毒素危害以曲菌屬（Aspe rgilluS，A.)、 麥角菌屬（Claviceps，C·)、鐮刀菌屬（Fusarium，F(xiàn).)與青霉菌屬（Penicillium，P.)等霉 菌所產(chǎn)生的毒素為主，常見者有黃曲毒素（aflatoxins)、橘曲毒素（citrinin)、赭曲毒素 (ochratoxin)、棒曲毒素（又稱為散毒素、patulin、claviformin、clauacin、clavatin、 expansine、mycotoxinC 等）、麥角生物喊（ergot alkaloid)、伏馬鏡抱毒素（fumonisins)、 新月毒素群（trichothecenes)等，而其中新月毒素群包括T-2毒素（T-2toxin)、嘔吐毒素 (deoxynivalenol、vomitoxin)與玉米稀酬毒素（又稱為 F-2 毒素、zearalenone、F_2toxin) 等。
[0003] McNutt等人于1929年發(fā)現(xiàn)母豬喂飼發(fā)霉飼料后發(fā)生陰戶及乳房腫脹的假發(fā)情 現(xiàn)象，同時(shí)亦有出現(xiàn)陰道和直腸脫出的癥狀。愛爾蘭的McErlean氏于1952年指出豬吃 Fusarium感染過的大麥飼料，產(chǎn)生與McNutt所發(fā)現(xiàn)相同癥狀的現(xiàn)象，但均未能分離出其毒 素。其后在法國、意大利、南斯拉夫、羅馬尼亞、匈牙利、丹麥和加拿大等地均曾有本病發(fā)生 的報(bào)告。Andrew和Stob于1961年正式發(fā)表長在大麥上的Fusarium roseum能產(chǎn)生具有動 情素性的物質(zhì)即玉米烯酮（zearalenone)，且提出其分離方法與化學(xué)構(gòu)造，且又指出該物質(zhì) 具有促進(jìn)合成代謝與動情素的作用，可作為促進(jìn)牛、豬和羊生長的物質(zhì)。
[0004] 容易受玉米烯酮污染的飼料或食物原料為玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥 等，其中又以玉米及小麥最常被玉米稀酮污染。玉米稀酮主要由Fusarium graminearum、 Fusarium oxysporium、 Fusarium moniliforme、 Fusarium culmorum、 Fusarium sporotrichiodes 和 Fusarium equiseti 等菌產(chǎn)生，其中 Fusarium graminearum 為產(chǎn)生此 毒素的主要菌種。玉米烯酮的結(jié)構(gòu)與雌激素類似，會造成動物的繁殖障礙或死亡，并影響豬 只繁殖效率。研究報(bào)告指出飼料中含lppm的玉米烯酮會造成豬只的粗蛋白消化率與飼料 效率下降等不良影響；而含1. lppm的玉米烯酮?jiǎng)t對豬只的生殖、肝臟、腎臟和脾臟等器官 造成損傷。人類若長期攝入玉米烯酮，會造成細(xì)胞分裂時(shí)紡錘絲不正常，導(dǎo)致不孕與不正常 倍體的胚胎。此外，玉米烯酮并會造成女性荷爾蒙過多，以及頭暈、惡心、嘔吐、生殖障礙等 現(xiàn)象。孩童攝入玉米烯酮?jiǎng)t可能導(dǎo)致提早性成熟、男孩胸部增長與早發(fā)性乳腺炎等。此外， 玉米烯酮亦會促進(jìn)人類乳癌細(xì)胞的生長。目前已有許多研究證實(shí)農(nóng)作物具有極高的玉米烯 酮檢出率，如北美、日本與中國玉米的玉米烯酮檢出率分別為29、40與49% ;澳洲小麥的玉 米烯酮檢出率為44%。
[0005] 去除食品或飼料原料中污染的霉菌毒素，以生物法最具有發(fā)展性，因?yàn)樯锓ň?有高效率、專一且對營養(yǎng)成分破壞較小等優(yōu)點(diǎn)。生物法應(yīng)用于受霉菌毒素污染的食品或 飼料原料的方式有二：第一種方式為利用微生物的生物分解作用，例如氧化葡糖酸桿菌 (Gluconobacter oxydans)可降解棒曲毒素 ；Rhodococcus erythropolis 則可降解黃曲毒 素 B-1 ;地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)可移除赭曲毒素 A、玉米烯酮與黃曲毒素 B1。第二種方式為利用微生物細(xì)胞壁吸附霉菌毒素，例如鼠李糖乳酸桿菌（Lactobacillus rhamnosus)可吸附黃曲毒素 B1。
[0006] 液化淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)多存在于土壤或發(fā)霉的農(nóng)作 物，在分類學(xué)上屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae)的芽孢桿菌屬（Bacillus)，為兼性厭氧的 革蘭氏陽性菌，受外界壓力刺激后會產(chǎn)生內(nèi)孢子，菌體具周鞭毛而可移動，最適生長溫度為 30至40°C，無法在低于15°C或高于50°C的環(huán)境生長。此菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株（type strain) 為 Bacillu amyloliquefaciens ATCC 23350(Fukomoto strain F)。液化淀粉芽抱桿菌已 廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)淀粉酶與蛋白酶。然而，于美國國家生技信息中心（National Center for Biotechnology Information ；NCBI)網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的 PubMedline 數(shù)據(jù)庫或于科學(xué)引用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Science Citation Index Expanded ;SCIE) 中檢索，目前并無任何科學(xué)論文指出液化淀粉芽孢桿菌具有分解霉菌毒素的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 由上述的問題，本發(fā)明提供一種可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢桿菌 DSM32119。
[0008] 本發(fā)明亦提供一種液化淀粉芽孢桿菌用于去除玉米烯酮毒素的用途，其中該液化 淀粉芽孢桿菌DSM32119。
[0009] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，該液化淀粉芽孢桿菌DSM32119是與含有玉米烯酮毒素物 質(zhì)接觸有效時(shí)間，且其中該有效時(shí)間為24-36小時(shí)。在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中，該有效時(shí) 間為24小時(shí)，該玉米烯酮降解率為100%。
[0010] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，該含有玉米烯酮毒素物質(zhì)包含被玉米烯酮污染的玉米、小 麥、大米、大麥、小米或燕麥。
[0011] 在本發(fā)明另一實(shí)施例中，該液化淀粉芽孢桿菌DSM32119添加于食物、食材或飼料 中。
[0012] 本發(fā)明另提供一種可去除玉米烯酮毒素的組成物，包含液化淀粉芽孢桿菌 DSM32119,。
[0013] 本發(fā)明所提供的液化淀粉芽孢桿菌DSM32119,除了該菌株的分解霉菌毒素的能力 以外，并證實(shí)其具有聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶與蛋白酶等酵素活性，且不具有溶 血性、不產(chǎn)生腸毒素等，故適合用于受玉米烯酮毒素污染的食物或飼料中，以去除玉米烯酮 的危害。
【附圖說明】
[0014] 圖1是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119的菌落形態(tài)；
[0015] 圖2是Bacillus菌種別間親緣樹（phylogenetic tree)關(guān)系圖；
[0016] 圖3是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株于含有5ppm玉米烯酮的 LB培養(yǎng)液中的生長情形；
[0017] 圖4是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株移除LB培養(yǎng)液中的玉米 烯酮的能力；
[0018] 圖5是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株移除磷酸鹽緩沖溶液中的 玉米稀酮的能力；
[0019] 圖6是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株于含有5ppm玉米烯酮的 玉米粉培養(yǎng)基的菌數(shù)變化；
[0020] 圖7是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株移除玉米粉培養(yǎng)基中的玉 米稀酮的能力；
[0021] 圖8是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株的耐酸性；
[0022] 圖9是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株耐膽鹽試驗(yàn)；
[0023] 圖10是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株對淀粉、聚木糖、羧甲基 纖維素與脫脂乳的酵素?cái)U(kuò)散活性分析；
[0024] 圖11是液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株的胞外聚木糖酶、羧甲基 纖維素酶、淀粉酶與蛋白酶的酵素比活性。
[0025] 【生物材料寄存】
[0026] 萊布尼茨研究所DSMZ-德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)收集中心；地址：德國布倫瑞克 市38124因霍芬大街7B ;2015年8月17日，菌株編號DSM32119。拉丁命名Bacillus amyloliquefaciens〇
【具體實(shí)施方式】
[0027] 定義
[0028] 本發(fā)明說明書中所稱「液化淀粉芽孢桿菌DSM32119」，是為寄存于萊布尼茨研究 所DSMZ-德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)收集中心，寄存編號為DSM32119的菌株，亦簡稱為「菌株 DSM32119」。
[0029] 本發(fā)明的分離出液化淀粉芽孢桿菌DSM32119的方法是參考Petchkongkaew et al. (2008)自發(fā)霉玉米樣本中分離，此樣本是取自臺灣大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場。將樣本以生理食 鹽水（0.85%)稀釋后，接種于 LB(Luria-Bertani)瓊脂盤（Difco Laboratories, USA)，在 37 °C培養(yǎng)24小時(shí)后，挑取單一菌落接種于含有5ppm玉米烯酮的LB培養(yǎng)液中，再于37 °C以 250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，測定LB培養(yǎng)液中的玉米烯酮?dú)埩袅俊Ｔ谒袦y試菌落中， 以本發(fā)明的液化淀粉芽孢桿菌DSM32119具有最高的玉米烯酮移除能力。另外，于本發(fā)明 實(shí)施例中使用液化淀粉芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株（type strain) ATCC 23350做為對照菌株，該 菌株購自食品工業(yè)研究所生物資源保存中心（新竹）。
[0030] 為觀察液化淀粉芽孢桿菌DSM32119的菌落形態(tài)，將菌株接種于LB瓊脂盤 (Merck, Germany)，于37 °C培養(yǎng)24小時(shí)后觀察菌落形態(tài)。而菌體形態(tài)的觀察，是將菌 株DSM32119接種于LB培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，以5000g離心收集菌體，以革蘭 氏染色套組（Sigma-Aldrich Co.，USA)進(jìn)行染色后，以顯微鏡進(jìn)行觀察。菌體另以乙 醇固定后，依Waldeck et al. (2006)的方法，將菌體進(jìn)行4'，6_二脒基-2-苯基吲哚 (4'，6-diamidino_2-phenylindole ;DAPI)染色，再以焚光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0031] 液化淀粉芽孢桿菌DSM32119的菌落形態(tài)如圖1所示。其表面圓滑突起并帶有黏 性。將菌體細(xì)胞內(nèi)核酸以DAPI染劑染色后，以位相差及熒光顯微鏡觀察菌體形態(tài)，可知菌 株DSM32119的菌體呈桿狀，為單一細(xì)胞或由數(shù)個(gè)細(xì)胞連接成鏈狀，具有移動性且可產(chǎn)生內(nèi) 孢子。DSM32119菌體經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下呈紫色，為革蘭氏陽性菌。上述有關(guān)菌株 DSM32119 的菌落與菌體形態(tài)特征，與 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vos et al.，2009)所描述的液化淀粉芽孢桿菌特征相符。
[0032] 使用API 50 CHB套組（bioMerieux Inc.，USA)進(jìn)行液化淀粉芽孢桿菌DSM32119 的生化分析。生化分析結(jié)果如表一所示。菌株DSM32119與液化淀粉芽孢桿菌ATCC 23350菌 株主要差異在于對D-木糖（D-xylose)、D_半乳糖（D-galactose)、D_葡萄糖（D-glucose)、 D-甘露糖（D-mannose)、半乳糖醇（dulcitol)、D_ 乳糖（D-lactose)、蜜二糖（melibiose) 與N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine)等的利用性。經(jīng)由API分析軟件比對此二菌 株的相似性，結(jié)果顯示兩菌株具有99. 8%的相似性。
[0033] 表一液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350的生化特性

[0036] 根據(jù)Weisburg et al. (1990)的方法進(jìn)行菌株DSM32119的分子鑒定。以DNA萃 取套組（Qiagen Inc.，USA)抽取DSM32119菌株的基因組DNA。再利用引物對16S-27f(SEQ ID NO :1)以及 16S-1492r(SEQ ID NO :2)，進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)（polymerase chain reaction ;PCR)擴(kuò)增菌株DSM32119的16S rRNA基因序列。將PCR產(chǎn)物定序后，再取菌株 DSM32119的16S rRNA基因的第54至510號位置的核苷酸序列（其包含VI至V3高度變 異區(qū)）與其他菌種進(jìn)行比對。序列比對的軟件為BioEdit Sequence Alignment Editor program (Hall, 1999)，并以鄰接法（neighbor-joining method)構(gòu)筑系統(tǒng)關(guān)系樹，以 TreeView軟件繪圖。
[0037] 將菌株DSM32119的16S rRNA基因序列以PCR擴(kuò)增及定序后（SEQ ID NO :3)，取 其包含VI至V3高度變異區(qū)的第54至510號位置的核苷酸序列，與其他芽孢桿菌屬的菌種 進(jìn)行序列比對，并以鄰接法（neighbpring-joining method)構(gòu)筑系統(tǒng)關(guān)系樹。結(jié)果如圖2 所示，菌株DSM32119與液化淀粉芽孢桿菌ATCC 23350菌株的關(guān)系最為接近，且其序列相似 性尚達(dá)99. 9 %。
[0038] 綜合上述形態(tài)觀察、生化分析，以及16S rRNA基因的種源分析結(jié)果，菌株 DSM32119于分類學(xué)上應(yīng)屬于液化淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)。
[0039] 以下，將以本發(fā)明所分離出的液化淀粉芽孢桿菌DSM32119進(jìn)行玉米烯酮去除能 力的分析。其中，玉米稀酮濃度的分析是依Urraca et al. (2005)的方法，以高效液相層析 法（high performance liquid chromatography ;HPLC)進(jìn)行分析。使用 C18 逆向?qū)游龉?柱，移動相為含有15mM醋酸胺（ammonium acetate)的乙腈、甲醇與水（10 :55 :35，v/v)混 合液，流速為1.0mL/min，并以焚光檢測器進(jìn)行檢測。激發(fā)波長（excitation wavelength) 及發(fā)射波長（emission wavelength)分別設(shè)定為452及271nm。另以含不同濃度玉米稀酮 (0.5~8ppm)的標(biāo)準(zhǔn)品，以HPLC配合熒光檢測器進(jìn)行檢測，積分后作出檢量線。樣本中的 玉米烯酮濃度即可對照標(biāo)準(zhǔn)品的檢量線估算。
[0040] 為確認(rèn)液化淀粉芽孢桿菌的生長是否受玉米烯酮影響，將隔夜培養(yǎng)的菌株 DSM32119與ATCC 23350菌株分別以1 %的菌元接種量，接種于LB培養(yǎng)液或含有3. 5ppm玉 米烯酮的LB培養(yǎng)液。于37°C以250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)期間，于第0、4、8、 12、24、36、48小時(shí)取樣，量測菌液渾濁度（0D 600)以評估菌體生長的情形。
[0041] 將菌株DSM32119與ATCC 23350菌株分別接種于LB培養(yǎng)液，并于37°C振蕩培養(yǎng)。 二菌株均于24小時(shí)后吸光值達(dá)到最高，分別為1. 90與1. 68。顯示菌株DSM32119于LB 培養(yǎng)液中的生長性較佳。而在含有3. 5ppm玉米稀酮的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，菌株 DSM32119與ATCC 23350菌株的吸光值與在不含玉米烯酮的LB培養(yǎng)液中相同，分別為1.81 與1.62(圖3)。上述結(jié)果顯示玉米烯酮對于菌株DSM32119與ATCC 23350菌株的生長并無 太大影響。
[0042] 實(shí)施例一液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119在LB培養(yǎng)液中去除玉米烯酮的
[0043] 能力
[0044] 為評估菌株DSM32119與ATCC 23350菌株于LB培養(yǎng)液中去除玉米烯酮的能力， 分別將菌株DSM32119與ATCC 23350菌株以1 %的菌元接種量，接種于LB培養(yǎng)液或含有 3. 5ppm玉米烯酮的LB培養(yǎng)液。于37°C以250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)期間，于 第0、4、8、12、24、36、48小時(shí)取樣，并依1^抑〇 &6丨&1.(2005)的方法純化及定量1^培養(yǎng)液 中殘留的玉米烯酮濃度。
[0045] 結(jié)果如圖4所示，菌株DSM32119于培養(yǎng)24小時(shí)后便將LB培養(yǎng)液中的玉米烯酮完 全移除，而ATCC 23350菌株則在36小時(shí)后將LB培養(yǎng)液中的玉米烯酮完全移除。此實(shí)驗(yàn)結(jié) 果證實(shí)菌株DSM32119具有較佳的玉米烯酮移除能力，且于24小時(shí)內(nèi)的玉米烯酮降解率為 100%〇
[0046] 實(shí)施例二液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119在磷酸鹽緩沖溶液中去除玉米烯酮的 能力
[0047] 將隔夜培養(yǎng)的菌株DSM32119與ATCC 23350菌株分別以1%的菌元接種量，接種 于LB培養(yǎng)液。于37°C以250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，以8000g離心20分鐘收集菌 體。再將菌體重新懸浮于含有5ppm玉米烯酮的磷酸鹽緩沖溶液中，并調(diào)整菌體濃度為1010 CFU/mL，于37°C以250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)期間第0、4、8、12、24、36、48小時(shí) 取樣，并依Urraca et al. (2005)的方法純化及定量緩沖溶液中殘留的玉米稀酮濃度。
[0048] 另評估菌株DSM32119與ATCC 23350菌株于磷酸鹽緩沖溶液中去除玉米烯酮的能 力。將菌體以1010 CFU/mL的濃度懸浮于含有5ppm玉米烯酮的磷酸鹽緩沖溶液中，再測定 培養(yǎng)期間磷酸鹽緩沖溶液中玉米烯酮的濃度變化。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)DSM32119菌體加入 含有5ppm玉米稀酮的磷酸鹽緩沖溶液中（第0小時(shí)），玉米稀酮濃度即下降至3. 28ppm，由 此結(jié)果推測DSM32119菌體具有吸附玉米烯酮的能力；而培養(yǎng)4小時(shí)后，玉米烯酮濃度下降 至0. 36ppm，亦即有89%的玉米烯酮被移除，此結(jié)果則說明菌株DSM32119具有代謝降解玉 米烯酮的能力。在ATCC 23350菌株方面，第0小時(shí)玉米烯酮濃度僅下降至3. 80ppm ;培養(yǎng) 48小時(shí)后，玉米稀酮濃度下降至2. 17ppm，亦即僅有42. 19%的玉米稀酮被移除。上述結(jié)果 證實(shí)液化淀粉芽孢桿菌具有玉米烯酮移除能力，且菌株DSM32119的能力較ATCC 23350菌 株為佳。
[0049] 實(shí)施例三液化淀粉芽孢桿菌DSM32119去除玉米粉中玉米烯酮的效果
[0050] 為評估菌株DSM32119對于玉米中的玉米烯酮清除效果，將40g含有玉米烯酮的玉 米粉懸浮于160mL的蒸餾水中，以121°C、1. 5大氣壓滅菌15分鐘后，測定其玉米烯酮濃度 為1. 56ppm。再接種隔夜培養(yǎng)的菌株DSM32119 (1 %菌元接種量），于37°C培養(yǎng)48小時(shí)，分 別于第〇、12、24、36與48小時(shí)取樣，測定玉米粉中的菌數(shù)及玉米烯酮濃度。實(shí)驗(yàn)中使用的 玉米是購自本地超級市場，再依Paster et al. (1990)的方法制備成受玉米稀酮污染的玉 米粉
[0051] 以含有1. 56ppm玉米烯酮的玉米粉（20% ;w/w)進(jìn)行菌株DSM32119的培養(yǎng)，培 養(yǎng)期間菌數(shù)如圖6所示。菌株DSM32119的初始菌數(shù)為6. 661og CFU/mL，經(jīng)過36小時(shí)培養(yǎng) 后，菌數(shù)增加至8. 231og CFU/mL。顯示菌株DSM32119可在含有5ppm玉米烯酮的玉米粉培 養(yǎng)基中生長。分析玉米烯酮濃度，在接種菌株DSM32119的前，玉米粉培養(yǎng)基中的玉米烯酮 濃度為1. 56ppm，在培養(yǎng)36小時(shí)后，殘余的玉米烯酮濃度為0· 12ppm，亦即92%的玉米烯酮 已被菌株DSM32119代謝去除（圖7)。
[0052] 實(shí)施例四液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119的安全性評估
[0053] 本實(shí)施例主要在評估菌株DSM32119是否具有溶血性、抗生素的敏感性，以及是否 產(chǎn)生腸毒素，以提供此菌株用于食材或飼料中被人體或動物攝入后的安全性。
[0054] 4-1評估菌株DSM32119的溶血性
[0055] 將菌株DSM32119接種于血液瓊脂盤（Merck, Germany)，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后觀 察菌落形態(tài)，確認(rèn)是否發(fā)生溶血現(xiàn)象。
[0056] 觀察液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119培養(yǎng)于血液瓊脂盤上的菌落形態(tài)，其菌落 周圍并無溶血圈出現(xiàn)，證實(shí)菌株DSM32119并不具有溶血性。
[0057] 4-2評估菌株DSM32119的抗生素敏感性
[0058] 依Sorokulova et al. (2008)的方法，將培養(yǎng)隔夜的DSM32119菌液稀釋成菌數(shù) 106CFU/mL，再將菌液涂布于LB瓊脂盤，而后于LB瓊脂盤上放置含有不同抗生素的錠片 (Mast Diagonstic, France)。于37°C培養(yǎng)18小時(shí)后，測量抑制圈直徑，并根據(jù)Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)公告的方法判定抗生素敏感性。
[0059] 以抗生素錠片評估菌株DSM32119的抗生素敏感性，結(jié)果如表二所示，菌株 DSM32119對ampici 11 in與streptomycin不具敏感性，但亦不具有抗性，另對其余18種 抗生素皆具敏感性。在使用具有抗生素抗性基因的微生物時(shí)，其抗藥性基因可能會轉(zhuǎn)移至 腸道病原菌，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，用于生化解毒的菌株以不具有抗藥性者為佳 (Salminen et al. , 1998 ；Temmerman et al.，2002)〇
[0060] 表二液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119的抗生素敏感性試驗(yàn)。
[0061]
[0062] *數(shù)值為三重復(fù)試驗(yàn)并以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。
[0063] 4-3評估菌株DSM32119是否產(chǎn)生腸毒素
[0064] 由于有些與菌株DSM32119同屬的Bacillus菌種，如仙人掌桿菌（Bacillus cereus)和枯草桿菌（Bacillus subtilis)，可能會產(chǎn)生造成食品中毒的腸毒素 (Lindback et al.，2004)，且此些腸毒素基因有可能轉(zhuǎn)移至其它菌株（From et al.，2005)。因此，使用Bacillus菌屬的菌株進(jìn)行生化解毒時(shí)，亦需檢測此些菌株是否具 有腸毒素基因。仙人掌桿菌所產(chǎn)生的腸毒素主要有二型：其一為溶血素 （Hemolysin BL; Hbl)，由hblA、hblB、hblC與hblD等基因所編碼的蛋白質(zhì)HblB、Hbl L1與Hbl L2等次單元 所組成，具有溶血性、細(xì)胞毒性與影響血管通透性等特性（Beecher et al.，2009);另一型 為非溶血性腸毒素 （nonhemolytic enterotoxin ;Nhe)，是由nheA、nheB與nheC等基因所 編碼的NheA、NheB與NheC等次單元所組成，主要會引起腹瀉（Lund and Granum, 1996)。此 外，還有由bceT基因所編碼的腸毒素 enterotoxin T(BceT)，其具有細(xì)胞毒性、改變血管通 透性并引起腹瀉等癥狀（Agata et al.，1995)。為確認(rèn)菌株DSM32119是否會產(chǎn)生腸毒素， 分別以PCR檢測腸毒素基因及免疫套組檢測腸毒素蛋白質(zhì)。并另以購自食品工業(yè)研究所生 物資源保存中心（新竹）的 Bacillus amyloliquefaciens ATCC 2335〇、Bacillus cereus ATCC 11778 與 Bacillus cereus ATCC 33019 等菌株做為對照組。
[0065] 以 PCR 檢測腸毒素基因方面，依 Guinebretifere et al. (2002)與 Ouoba et al. (2007)的方法，以PCR法檢測溶血素基因 hblA、hblB、hblC、hblD、非溶血性腸毒素基 因 nheA、nheB與nheC，以及腸毒素基因 bceT等是否存在。hblA基因所使用的引物對為 HAF(SEQ ID N0:4)與 HAR(SEQ ID N0:5) ;hblB基因所使用的引物對為HBF(SEQ ID N0:6) 與 HBR(SEQ ID N0:7) ;hblC 基因所使用的引物對為 HCF(SEQ ID N0:8)與 HCR(SEQ ID NO: 9) ;hblD基因所使用的引物對為HDF(SEQ ID N0:10)與HDR(SEQ ID N0:11) ;nheA基因所 使用的引物對為NAF(SEQ ID N0:12)與NAR(SEQ ID N0:13) ;nheB基因所使用的引物對為 NBF(SEQ ID N0:14)與 NBR(SEQ ID N0:15) ;nheC 基因所使用的引物對為 NCF(SEQ ID NO: 16)與 NCR(SEQ ID N0:17) ;bceT 基因所使用的引物對為 BTF(SEQ ID N0:18)與 BTR(SEQ ID NO :19)。
[0066] 以免疫套組檢測腸毒素方面，使用由3M公司出品的商業(yè)化芽孢桿菌腸道腸毒素 檢測套組（TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)，并依其使 用說明書檢測菌株DSM32119是否產(chǎn)生Nhe腸毒素蛋白質(zhì)。
[0067] 應(yīng)用于生化解毒的菌株，為確認(rèn)其安全性，故需檢測是否產(chǎn)生腸毒素。以PCR檢測 菌株 DSM32119 是否帶有 NheA、NheB、NheC、HblA、HblB、HblC、HblD 或 BceT 等腸毒素的基 因。結(jié)果如表三所示，液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株皆不帶有上述基因 片段，而做為對照組的仙人掌桿菌ATCC 11778菌株帶有hblA、nheA、nheC，以及bceT基因； 仙人掌桿菌 ATCC 33019 菌株則帶有 hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC 與 bceT 等基 因。另使用芽抱桿菌腸毒素檢測套組（TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)進(jìn)行Nheb腸毒素的NheA次單元的檢測。結(jié)果顯示液化淀粉芽孢桿菌菌 株DSM32119與ATCC 23350菌株均不產(chǎn)生此腸毒素蛋白質(zhì)。
[0068] 表三腸毒素檢測結(jié)果
[0069]
[0070] a+，PCR檢測結(jié)果呈陽性；一，PCR檢測結(jié)果呈陰性。
[0071] b依套組使用說明，分?jǐn)?shù)為3分以下者呈陰性。
[0072] 實(shí)施例五液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119的益生特性
[0073] 使用細(xì)菌進(jìn)行生化解毒時(shí)，菌株隨著食物進(jìn)入宿主的消化系統(tǒng)，必須能抵抗胃部 的酸性環(huán)境與腸道中的膽鹽，才得以于消化道中生存，進(jìn)而分解隨食物進(jìn)入消化道的毒素。 而且，應(yīng)用于生化解毒的菌株，伴隨著飼料或食物攝入動物體內(nèi)，若同時(shí)具有益生特性時(shí)， 則對宿主的腸道健康具有保護(hù)作用。依聯(lián)合國世界糧農(nóng)組織（FA0)的準(zhǔn)則，益生菌必需具 有耐酸、耐膽鹽，以及抗病原菌等活性。
[0074] 5-1耐酸性
[0075] 依Ehrmann et al. (2002)的方法，將隔夜培養(yǎng)的DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液lmL，于4°C以8000g離心20分鐘后，去除上清液，將菌體分別懸浮于10mL的pH 2. 0 或3. 0的磷酸鹽緩沖溶液中，于第0、0. 5、2與3小時(shí)取出0. lmL的菌體懸浮液，序列稀釋至 適當(dāng)倍數(shù)后，以涂布平板法（spread plate)接種于LB瓊脂盤，于37°C培養(yǎng)24小時(shí)后計(jì)算 菌落數(shù)。
[0076] 以pH 2. 0或3. 0的磷酸鹽緩沖溶液模擬動物胃部的酸性環(huán)境，檢測菌株是否具有 耐酸性。結(jié)果如圖8所示，菌株DSM32119于pH 2.0的環(huán)境下，菌數(shù)于2小時(shí)內(nèi)由7.41og CFU/mL降至6. 41og CFU/mL;于pH 3. 0的環(huán)境下，菌數(shù)于2小時(shí)內(nèi)則由10. 31og CFU/mL降 至8. llog CFU/mL，故證實(shí)菌株DSM32119具有良好的耐酸性。
[0077] 5-2耐膽鹽性
[0078] 依Ehrmann et al. (2002)的方法，將隔夜培養(yǎng)的DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液lmL，接種于含有0. 3% oxgall的LB培養(yǎng)液9mL中，于37°C培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)期間分 別于第〇、4、8與12小時(shí)測定菌液于波長600nm的吸光值。
[0079] 以含有0. 3% oxgall的LB培養(yǎng)液模擬腸道中的膽鹽濃度，檢測菌株是否可在此 環(huán)境下生長。結(jié)果如圖9所示，DSM32119于含有0. 3% oxgall的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)12小 時(shí)后，吸光值為1. 38 ;而于不含膽鹽的LB培養(yǎng)液中生長，吸光值為1. 5。此結(jié)果證實(shí)菌株 DSM32119具有耐膽鹽性，可在含有0. 3%膽鹽的LB培養(yǎng)液中生長。
[0080] 5-3抗病原菌活性
[0081] 試驗(yàn)中使用的病原菌包括 Salmonella enteri ATCC 12947、Listeria monocytogenes BCRC 14930、 Listeria monocytogenes BCRC 15338、 Listeria monocytogenes BCRC 15387、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus ATCC 33019 與Escherichia coli 0 157:H7等菌株，均購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存與研究 中心（新竹）。
[0082] 依Yilmaz et al. (2006)的方法，將隔液培養(yǎng)的上述病原菌的菌液分別涂布于LB 瓊脂盤后，再挖出直徑約6mm的孔洞。將隔夜培養(yǎng)的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液于4°C以8000g離心20分鐘后，取出上清液，再以孔徑0. 22 μ m的濾膜過濾除菌，于上 述孔洞中加入40 μ L過濾后的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株的上清液，于37°C培養(yǎng)24 小時(shí)后測量抑制圈的直徑。
[0083] 液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株的抗病原菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 四。液化淀粉芽孢桿菌DSM32119對單核球增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes) BCRC 15338菌株、仙人掌桿菌（B. cereus)ATCC 11778與ATCC 33019皆具有抑制其生長的 特性；而液化淀粉芽孢桿菌ATCC 23350菌株則對試驗(yàn)中所使用的病原菌皆無抑制作用。
[0084] 表四液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350菌株的抗病原菌活性
[0085]
[0086] *NI:未有抑制效果。
[0087] *數(shù)值為三重復(fù)試驗(yàn)并以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。
[0088] 實(shí)施例六液化淀粉芽孢桿菌DSM32119的聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶與蛋 白酶活性
[0089] 用于生化解毒的菌株，若具有產(chǎn)生聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素的 能力，則在降解毒素的同時(shí)，亦可水解纖維與蛋白質(zhì)，提高食物或飼料的消化吸收。
[0090] 將隔夜培養(yǎng)的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株，以1 %的接種量接種至10mL的 LB培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，以5000g于4°C下離心20分鐘，收集上清液，以酵素?cái)U(kuò)散 法與酵素比活性測定法分析聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素活性。
[0091 ] 6-1酵素?cái)U(kuò)散法分析酵素活性
[0092] 依Waldeck et al. (2006)的方法，將15mL含有1%的聚木糖、羧甲基纖維素或脫 脂奶粉的洋菜膠（1. 5% )倒入培養(yǎng)皿中，凝固后于洋菜膠挖出直徑約6mm的圓形孔洞。再 將隔夜培養(yǎng)的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株，于4°C以5000g離心10分鐘后，取40 μ L 上清液，置入上述洋菜膠的孔洞中，于37°C培養(yǎng)隔夜16小時(shí)后進(jìn)行觀察。于聚木糖或羧甲 基纖維素的洋菜膠表面分別加入10mL的剛果紅溶液（0. 75% )，靜置15分鐘以進(jìn)行染色。 染色后將剛果紅溶液移除，觀察孔洞周圍是否出現(xiàn)淺色透明環(huán)，若有透明環(huán)出現(xiàn)則表示加 入的菌液具有聚木糖酶或羧甲基纖維素酶活性。而含有脫脂乳粉的洋菜膠則可直接觀察孔 洞周圍是否有透明環(huán)產(chǎn)生，若有則表示加入的菌液具有蛋白酶活性。
[0093] 菌株對受質(zhì)作用后的結(jié)果如圖10所示，透明環(huán)的產(chǎn)生是因?yàn)榫陮⒛z體中的受 質(zhì)分解，表示菌株對此受質(zhì)具有酵素活性；而表五為液化淀粉芽孢桿菌DSM32119與ATCC 23350于酵素?cái)U(kuò)散試驗(yàn)中的結(jié)果，結(jié)果顯示兩者對羧甲基纖維素、脫脂乳粉、聚木糖與淀粉 皆具有酵素活性。
[0094] 表五酵素?cái)U(kuò)散分析結(jié)果
[0097] *所有數(shù)值為三重復(fù)試驗(yàn)并以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。
[0098] 6-2酵素比活性測定
[0099] 聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶等酵素活性，是采用Megazyme公司 (Wicklow, Ireland)的套組進(jìn)行檢測。受質(zhì)分別為偶氮聚木糖（azo-xylan)、偶氮羧甲基纖 維素（azo-CMC)，以及偶氮酪蛋白（azo-casein)，并依廠商使用說明書進(jìn)行檢測。將菌株 DSM32119或ATCC 23350菌株的隔夜培養(yǎng)菌液分別于4°C以8000g離心10分鐘，將上清液 以磷酸鈉緩沖溶液（l〇〇mM、pH 7. 0)稀釋10倍后，再進(jìn)行酵素活性的檢測。每一單位的酵 素活性定義為經(jīng)lmL酵素液作用后每分鐘所釋出的1 μ mol染劑。
[0100] 參考Megazyme公司的測定方法進(jìn)行菌株對聚木糖、羧甲基纖維素、淀粉與脫脂乳 粉等受質(zhì)的酵素活性并進(jìn)行定量；實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11，菌株DSM32119對聚木糖、羧甲基纖維 素、淀粉與脫脂乳粉的酵素活性分別為2. 18±0. 01U/mL、3. 39±0. 02U/mL、2. 07±0. 00U/mL 與 3· 13±0· 06U/mL，ATCC 23350 則為 9· 71±0· 01U/mL、3. 60±0· 01U/mL、72. 84±0· 02U/mL 與1. 02±0. 06U/mL。故本發(fā)明的液化淀粉芽孢桿菌DSM32119不僅具有移除玉米烯酮的能 力，更具有產(chǎn)生淀粉酶、聚木糖酶、羧甲基纖維素酶與蛋白酶的能力。
[0101] 經(jīng)由上述實(shí)施例可知，本發(fā)明由發(fā)霉玉米中分離出一株液化淀粉芽孢桿菌 DSM32119。經(jīng)由形態(tài)、生化鑒定，以及16S rRNA基因定序結(jié)果，證實(shí)菌株DSM32119于分類 學(xué)上確實(shí)屬于液化淀粉芽孢桿菌。液化淀粉芽孢桿菌菌株DSM32119不僅具有極佳的玉米 烯酮解毒能力，不具溶血性、不產(chǎn)生腸毒素、可于pH 2或3的酸性環(huán)境中存活、可于含有膽 鹽的培養(yǎng)基中生長，且具有聚木糖酶、羧甲基纖維素酶、淀粉酶與蛋白酶等酵素活性。因此， 液化淀粉芽孢桿菌DSM32119適合用于受玉米烯酮毒素污染的食物或飼料中，以去除玉米 烯酮的危害。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢桿菌DSM32119。2. -種液化淀粉芽孢桿菌用于去除玉米烯酮毒素的用途，其中該液化淀粉芽孢桿菌 DSM32119。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢桿菌DSM32119是與含 有玉米烯酮毒素物質(zhì)接觸有效時(shí)間。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述有效時(shí)間為24-36小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述有效時(shí)間為24小時(shí)，該玉米烯酮降解 率為100%。6. 根據(jù)權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述含有玉米烯酮毒素物質(zhì)包含被玉米烯 酮污染的玉米、小麥、大米、大麥、小米或燕麥。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢桿菌DSM32119添加于 食物或食材中。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢桿菌DSM32119系添加 于飼料中。9. 一種可去除玉米烯酮毒素的組成物，包含液化淀粉芽孢桿菌DSM32119。
【文檔編號】A23L5/20GK105985921SQ201510847191
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年11月27日
【發(fā)明人】劉嚞睿, 鄭光成, 李恩
【申請人】劉嚞睿