本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)的LAMP檢測(cè)引物組合及其LAMP檢測(cè)試劑盒和LAMP方法。

背景技術(shù)：

由禾谷鐮刀菌引起的麥類赤霉病是一種毀滅性的病害，在亞洲、歐洲、加拿大和美國(guó)北部等地頻繁爆發(fā)。病菌能在收獲前僅僅幾周的時(shí)間內(nèi)在小麥穗部迅速擴(kuò)展，阻礙種子形成并使麥粒萎縮，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，隨著全球氣候變化和耕作制度改變，發(fā)生區(qū)域不斷擴(kuò)大。赤霉病不僅可造成作物產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，而且其病原物鐮刀菌代謝產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素污染食物和飼料可造成人類和動(dòng)物嚴(yán)重疾病和免疫力下降(Pestka and Smolinski 2005)，阻止真核生物蛋白質(zhì)合成(Ueno et al.，1973)。因此，造成食品安全上的重大隱患。

單端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)是一大結(jié)構(gòu)相似的倍半萜烯類化合物，迄今已發(fā)現(xiàn)有70多種，是鐮刀菌產(chǎn)生的最重要的真菌毒素。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)主要可分為A型和B型兩大類：A型包括二乙酰氧基草鐮刀菌烯醇(Diacetoxyscirpenol，DAS)、T-2毒素和HT2毒素等；B型包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-acetyldeoxynivalenol，3ADON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-acetyldeoxynivalenol，15ADON)和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等。在我國(guó)，禾谷鐮刀菌是小麥赤霉病的主要致病菌，也是產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素的主要病原菌，嚴(yán)重影響了人畜的健康。

目前，真菌毒素的測(cè)定方法主要有生物測(cè)定法、化學(xué)測(cè)定法和免疫學(xué)測(cè)定法。生物測(cè)定法是缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，并且容易受到環(huán)境因素的影響，通常僅能用于定性分析?；瘜W(xué)測(cè)定法是主要的測(cè)定方法，具有準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，但是要依賴于昂貴的科研儀器，并且前期的提取純化步驟繁瑣，技術(shù)要求高，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。免疫學(xué)測(cè)定法與化學(xué)測(cè)定法相比，操作簡(jiǎn)單，快速，但依賴于特異性抗體，僅能檢測(cè)少數(shù)毒素，并且容易受到一些衍生物干擾，假陽(yáng)性率高，測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是鐮刀菌全基因組序列的公布，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家在單端孢霉烯族毒素的合成與調(diào)控方面取得了重要進(jìn)展，解析了毒素合成基因簇中各基因以及多個(gè)相關(guān)調(diào)控基因的功能?；诙舅睾铣杉罢{(diào)控基因的序列信息，開(kāi)發(fā)快速且成本低廉的檢測(cè)方法逐漸成為科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。如：Kim等(2003)利用Tri5、Tri7和Tri13基因序列信息開(kāi)發(fā)了檢測(cè)NIV和DON毒素的PCR檢測(cè)方法，Li等(2005)通過(guò)分析Tri5～Tri6基因間 序列信息，設(shè)計(jì)了區(qū)分NIV和DON的檢測(cè)引物，該方法穩(wěn)定性好，適用于大規(guī)模檢測(cè)。Zhang等(2010)根據(jù)Tri11基因開(kāi)發(fā)了特異性引物組合，能夠在一個(gè)反應(yīng)內(nèi)同時(shí)區(qū)分DON及其兩種衍生物3ADON、15ADON，取得了很好的效果。但是，這些方法都僅限于檢測(cè)部分B型單端孢霉烯族毒素，而無(wú)法檢測(cè)樣品是否含有T2、HT2等A型單族毒素。因此，應(yīng)用范圍受到很大限制，制約了這些方法在食品安全中毒素檢測(cè)的應(yīng)用。而且目前尚沒(méi)有通過(guò)PCR檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)A型與B型單端孢霉烯族毒素的報(bào)道。除此之外，以上檢測(cè)均需要進(jìn)行在PCR儀上完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)儀器要求較高，并且常規(guī)PCR反應(yīng)及時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度也相對(duì)較低。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR的新的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應(yīng)體系中恒溫高效擴(kuò)增，大量合成目的DNA的同時(shí)，產(chǎn)生副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴(kuò)增反應(yīng)依賴于靶DNA的6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，因此特異性非常高，反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，則不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋等能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備即可完成，檢測(cè)成本大大降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，可以在田間進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于LAMP技術(shù)多方面的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在病原物檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛，但在單端孢霉烯族毒素檢測(cè)方面尚無(wú)相關(guān)報(bào)到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)以上存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一組檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，能夠同時(shí)檢測(cè)A型和B型單端孢霉烯族毒素。本發(fā)明的另一目的是提供上述單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述單端孢霉烯族毒素的LAMP檢測(cè)方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的LAMP引物組合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內(nèi)引物FIP，反向內(nèi)引物BIP，正向環(huán)引物L(fēng)B和反向環(huán)引物RB組成，各引物序列如下：

FIP：5’-TATTGTTGGCTACCCCAAGGCACCTTGACTCGAACTTCGCC-3’；

BIP：5’-GTCGGCCTTGGTGGTGTCATAAGGCCTTTGCTGAGATGTACC-3’；

F3：5’-CGCCTTACAAAGCCTTGAGA-3’；

B3：5’-TCCGATTGGAGGAGAACACT-3’；

LF：5’-TCCAGGCAAGAAGGAACACCTT-3’；

LB：5’-CGCAATGCGAGAAAGGGCGA-3’；

所述引物組合在檢測(cè)單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1μM、正向內(nèi)引物FIP 8μM、反向內(nèi)引物FIP 8μM、正向環(huán)引物2μM、反向環(huán)引物2μM；

(2)反應(yīng)液，包含：7mM dNTPs、100mM Tris-HCl，50mM KCl，50mM(NH₄)₂SO₄，40mM MgSO₄、0.5％Triton X-100、5M Betain、40U Bst DNA聚合酶、25mM羥基萘酚藍(lán)；

(3)陽(yáng)性對(duì)照為禾谷鐮刀菌NRRL5883的基因組DNA，陰性對(duì)照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。

所述的檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的LAMP試劑盒在檢測(cè)單端孢霉烯族毒素中的應(yīng)用

一種檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的方法，包括提取待測(cè)材料的總DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP引物組或LAMP試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，觀察反應(yīng)溶液的顏色變化，顯示紫色表示檢測(cè)為陰性，不存在單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽(yáng)性，樣品中存在單端孢霉烯族毒素。

所述的檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的方法，提取待測(cè)樣品的總DNA，取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?0～65℃，時(shí)間為30～50min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

本發(fā)明檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的方法，包括待測(cè)樣品DNA的提取，以DNA為模板，利用所述引物組合進(jìn)行LAMP反應(yīng)。羥基萘酚藍(lán)(Hydroxynaphthol blue，HNB)屬于金屬離子指示劑的一種，是Mg²⁺的滴定及劑，其顏色隨溶液PH改變而變化，因此可以通過(guò)監(jiān)測(cè)Mg²⁺濃度及PH的變化起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加到反應(yīng)液中，溶液呈紫色，反應(yīng)過(guò)程中大量形成副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，使Mg²⁺濃度下降，PH發(fā)生改變，溶液顏色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{(lán)色。因此，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)反應(yīng)體系的顏色變化判斷單端孢霉烯族毒素的有無(wú)。顯示紫色表示檢測(cè)為陰性，不存在單端孢霉烯族毒素，而顯示天藍(lán)色的為陽(yáng)性，樣品中存在單端孢霉烯族毒素。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)之一是單端孢霉烯族毒素的高效特異擴(kuò)增引物序列及其擴(kuò)增方法。為了驗(yàn)證引物序列的特異性，本發(fā)明以18株產(chǎn)生A型和B型單端孢霉烯族毒素毒素的不同種鐮刀菌和9株產(chǎn)生其他類型毒素或不產(chǎn)毒素的不同種鐮刀菌為供試材料(表1)，采用快速DNA提取法提取鐮刀菌基因組DNA。具體方法如下：用已滅菌的牙簽或槍頭在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

當(dāng)發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致濁度上升。通過(guò)HNB顯色反應(yīng)結(jié)果所示，產(chǎn)生A型和B型單端孢霉烯族毒素的鐮刀菌樣品反應(yīng)管里均為天藍(lán)色，其為陽(yáng)性結(jié)果，而產(chǎn)生其他種毒素和不產(chǎn)毒素鐮刀菌樣品管均呈紫色，為陰性結(jié)果。證明設(shè)計(jì)的LAMP引物組合具有特異性。說(shuō)明該引物組合可被用于田間和收獲小麥中單端孢霉烯族毒素快速可靠的檢測(cè)鑒定。當(dāng)用于收獲小麥中單端孢霉烯族毒素檢測(cè)時(shí)，采用快速裂解法提取總DNA，具體過(guò)程如下：將待測(cè)小麥樣品加入2mL離心管，并同時(shí)加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

有益效果：現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在：

1)檢測(cè)范圍廣。與以往報(bào)道僅檢測(cè)一種或幾種B型毒素的PCR檢測(cè)方法相比，本發(fā)明能夠同時(shí)檢測(cè)到A型和B型單端孢霉烯族毒素，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，有利于保障食品安全與糧食安全。

2)特異性強(qiáng)。本發(fā)明針對(duì)鐮刀菌單端孢霉烯族毒素合成關(guān)鍵基因Tri4序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了4條特異引物，對(duì)產(chǎn)毒鐮刀菌進(jìn)行特異性識(shí)別，其特異性強(qiáng)、靈敏度高，使本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確完成單端孢霉烯族毒素的檢測(cè)。

3)操作簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明提供的檢測(cè)單端孢霉烯族毒素的方LAMP法，克服了現(xiàn)有生物與化學(xué)檢測(cè)方法樣品處理繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力及需要PCR熱循環(huán)儀等問(wèn)題。該方法無(wú)需PCR反應(yīng)中的退火、復(fù)性等溫度的變化，30～50min內(nèi)即可完成檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的效率。

4)成本低。本方法無(wú)需昂貴、精密的試驗(yàn)儀器設(shè)備，僅需要恒溫水浴鍋即可完成檢測(cè)，且所用DNA快速提取和PCR過(guò)程均為常規(guī)試劑，價(jià)格低廉。

因此本方法實(shí)用性強(qiáng)，可滿足田間及收獲小麥中單端孢霉烯族毒素快速檢測(cè)，為食品安全提供了保障。

表1 用于檢測(cè)引物特異性的產(chǎn)不同種毒素的鐮刀菌菌株

*菌株產(chǎn)生毒素經(jīng)LC-MS確認(rèn)

(四)附圖說(shuō)明

圖1：LAMP引物組合的特異性驗(yàn)證結(jié)果

圖中菌株編號(hào)與表1相同，圖中顯示1-18反應(yīng)管為產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素鐮刀菌，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，19-27為產(chǎn)生其他毒素或不產(chǎn)毒鐮刀菌，結(jié)果顯示陰性。

圖2：LAMP引物組合的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

1.100ng；2.10ng；3.1ng；4.100pg；5.10pg；6.1pg。圖中顯示25μL反應(yīng)體系內(nèi)含有10pg-100ng DNA均顯示陽(yáng)性，而含有1pg DNA呈陰性，說(shuō)明反應(yīng)靈敏度為10pg。

圖3：收獲小麥中單端孢霉烯族毒素檢測(cè)結(jié)果

1.陽(yáng)性對(duì)照(NRRL5883)；2.江蘇；3.安徽；4.浙江；5.河北；6.河南；7.山東；8.陰性對(duì)照(water)。圖中顯示江蘇與安徽樣品呈陽(yáng)性，含有單端孢霉烯族毒素，而其余樣品呈陰性。

(五)具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受以下實(shí)施例的限制。

實(shí)施實(shí)例1：?jiǎn)味随呙瓜┳宥舅豅AMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證LAMP方法的特異性，以27個(gè)種的鐮刀菌為參試對(duì)象，其中18個(gè)種產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素、7個(gè)種產(chǎn)生伏馬毒素等其他毒素，2個(gè)種不產(chǎn)毒素(表1)。

模板DNA提?。河靡褱缇难篮灮驑岊^在樣品表面上挑取少量菌絲，放入PCR管，加入50μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入50μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心15s，取1μL上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，時(shí)間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，18株產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素菌株反應(yīng)管均顯示天藍(lán)色的陽(yáng)性反應(yīng)，而7株產(chǎn)其他毒素和2株不產(chǎn)毒菌株均呈紫色的陰性反應(yīng)。

實(shí)施實(shí)例2：?jiǎn)味随呙瓜┳宥舅豅AMP反應(yīng)的靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證LAMP方法的靈敏度，提取單端孢霉烯族毒素陽(yáng)性的鐮刀菌菌株NRRL5883(表1)，并采用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度(100ng/μL)，用超純水進(jìn)行10倍梯度稀釋，-20℃保存做模板。分別取各濃度的DNA溶液1μL做模板，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，時(shí)間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。結(jié)果表明(圖2)，加入100ng、10ng、1ng、100pg、10pg DNA的反應(yīng)管呈明顯天藍(lán)色，而加入1pg DNA的反應(yīng)管呈紫色，表明LAMP反應(yīng)的靈敏度達(dá)到10pg基因組 DNA。

實(shí)施實(shí)例3：收獲小麥中檢測(cè)單端孢霉烯族毒素

模板DNA提?。捍郎y(cè)樣品為江蘇、安徽、浙江、河北、河南、山東6個(gè)省份收集的收獲

小麥。將待測(cè)小麥樣品加入2mL離心管，并同時(shí)加入直徑4mm鋼珠，液氮速凍后與Biospec研磨儀高速研磨1min，加入200μL Buffer A溶液(100mM NaOH，2％20)，95℃溫育10min。再加入200μL BufferB溶液(100mM Tris-HCl，2mM EDTA)，振蕩混勻，12000rpm離心30s，取上清液做LAMP擴(kuò)增的模板。

LAMP反應(yīng)：取1μL DNA溶液，加入5μL反應(yīng)液、5μL引物組混合液、14μL滅菌超純水進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，時(shí)間為45min，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顏色變化的觀察。

LAMP檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，采集自江蘇和安徽的小麥樣品呈陽(yáng)性，表明含有單端孢霉烯族毒素，而浙江、河北、河南、山東采集的樣品為陰性，不含有單端孢霉烯族毒素。