本發(fā)明涉及一種肺癌miRNA標(biāo)志物的聯(lián)合檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：肺癌是一種常見的惡性腫瘤，目前在全世界的發(fā)病率和死亡率都高居其它惡性腫瘤之首。2015年在美國，大約有86380名男性和86380名女性死于肺癌。2015年在中國，肺癌的發(fā)病率和死亡率分別為0.0733％和0.061％，在癌癥相關(guān)疾病中排名第一。由于早期肺癌患者的癥狀不明顯，大多數(shù)病人確診時(shí)已處于中晚期階段，因此在肺癌的預(yù)防和治療中，提高肺癌的早期診斷起著至關(guān)重要的作用。目前肺癌的早期診斷主要依賴影像技術(shù)和腫瘤標(biāo)志物的檢測。低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(LDCT)具有較高的靈敏度，是最常見的肺癌篩查和診斷手段。但CT假陽性較高、檢測費(fèi)用高，并且輻射對人體還有潛在的傷害。血清腫瘤標(biāo)志物的檢測因其安全無害，費(fèi)用低且簡單可行，在早期肺癌的篩查和診斷中具有重要的作用。微小RNA(miRNA)是一類高度保守、內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA,其長度約為19～25nt，主要參與基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,可調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附和死亡等，與癌癥的形成和演變密切相關(guān)。miRNA會(huì)因?yàn)榧?xì)胞的死亡或者細(xì)胞主動(dòng)分泌進(jìn)入到血液循環(huán)中，其作為腫瘤標(biāo)志物檢測具備以下優(yōu)點(diǎn)：在癌癥細(xì)胞中miRNA會(huì)異常表達(dá)，miRNA在血漿或血清中很穩(wěn)定，因此可以通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測。miRNA在癌癥疾病過程中可能發(fā)揮著促癌或抑癌基因的作用。大量研究表明，miRNA可以有效用于肺癌的早期診斷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，首次提供了mir-141和mir-193b聯(lián)合檢測用于肺癌篩查的試劑盒和檢測方法。本發(fā)明首先提供了一種肺癌的篩查試劑盒，它包括SEQIDNO.1～2所示逆轉(zhuǎn)錄引物，以及SEQIDNO.3～4和SEQIDNO.5～4所示引物對。其中，所述試劑盒還包括SEQIDNO.6所示逆轉(zhuǎn)錄引物，以及SEQIDNO.7～8所示引物對。本發(fā)明還提供了SEQIDNO.1～2所示逆轉(zhuǎn)錄引物，以及SEQIDNO.3～4和SEQIDNO.5～4所示引物對在制備肺癌篩查用試劑中的用途。其中，所述試劑還包括SEQIDNO.6所示逆轉(zhuǎn)錄引物，以及SEQIDNO.7～8所示引物對。本發(fā)明還提供了一種肺癌的篩查方法，它包括如下步驟：a，提取樣本RNA：提取待檢樣本中的RNA；b，基因擴(kuò)增：用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增；c，結(jié)果檢測：對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。步驟a所述的樣本為肺組織。本發(fā)明選擇聯(lián)合檢測了mir-141、mir-193b，并以U6為檢測內(nèi)參，通過設(shè)計(jì)莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄引物，反復(fù)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，實(shí)現(xiàn)了用一份RNA同時(shí)完成以上兩個(gè)miRNA和U6基因的混合逆轉(zhuǎn)，用熒光定量PCR檢測這兩個(gè)miRNA指標(biāo)后能顯著區(qū)分肺癌組織和正常組織，并且通過測序驗(yàn)證，表明所得PCR產(chǎn)物均為特異性擴(kuò)增，結(jié)果可靠。同時(shí)，本發(fā)明方法和試劑盒的檢測靈敏度高，特異性好，可用于指征肺癌的發(fā)生發(fā)展，輔助臨床早期肺癌的篩查，臨床應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1熒光定量PCR溶解曲線圖2熒光定量PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖3測序鑒定結(jié)果圖4不同組織的mir141以及mir193b的表達(dá)水平，A肺癌遠(yuǎn)端組織、C肺癌組織、F肺癌旁組織。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明檢測方法一、實(shí)驗(yàn)方法1材料1.1樣本待測組織樣本取自四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科收治病人，其中肺癌組織10個(gè)，肺癌遠(yuǎn)端正常組織10個(gè)，癌旁組織10個(gè)，已通過病理學(xué)確診。1.2主要儀器與試劑Bio-RadCFX96熒光定量PCR儀、analytikjena-scandrop100、EastepTMSuper總RNA提取試劑盒(Promega)、GoScriptTMReverseTranscriptionSystem(Promega)、Bia-RadEvagreenmix1.3引物設(shè)計(jì)根據(jù)miRNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，檢測的miRNA包括miR-141(miRBaseReferenceSequence：MIMAT0000432-uaacacugucugguaaagaugg)、miR-193b(miRBaseReferenceSequence：MIMAT0002819-aacuggcccucaaagucccgcu)，選擇U6(NCBIReferenceSequence：NR_004394.1)作為定量內(nèi)參，使用莖環(huán)法設(shè)計(jì)以上miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物，U6引物通過primer5軟件設(shè)計(jì)，逆轉(zhuǎn)錄引物見表1，熒光定量PCR引物見表2，理論上熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大?。篣6為94bp，mir-141和mir-193b為34bp。表1cDNA合成引物序列表表2熒光定量PCR引物序列表2方法2.1肺癌組織總RNA提取組織樣本采用液氮研磨的方式破碎，加入300uL組織裂解液后室溫放置5min，再加入300uL稀釋液繼續(xù)室溫放置5min，以最大轉(zhuǎn)速離心5min，小心吸取上清，加入0.5倍上清體積的無水乙醇，用移液器吹打3-4次，混勻。將混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱中，過柱純化，加600uLRNA洗液，離心棄廢液；按照表3準(zhǔn)備DNaseI孵育液50uL并加入吸附柱膜中央，室溫放置15min，加入RNA洗液洗滌2次后洗脫得到總RNA，存于-80℃。表3DNaseI孵育液準(zhǔn)備表樣品每樣本加入量(uL)10XDNaseI緩沖液5DNaseI5無核酸酶水402.2RNA濃度及純度鑒定用ThermoNanoDrop2000全波長酶標(biāo)儀測定RNA濃度和純度。2.3cDNA合成采用混合逆轉(zhuǎn)錄的方法，用一份RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)內(nèi)參基因U6和2個(gè)miRNA,混合逆轉(zhuǎn)錄體系見表4，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：42℃、15min；70℃、15min，具體操作參照GoScriptTMReverseTranscriptionSystem說明書。表4混合反轉(zhuǎn)錄體系(20ul)2.4熒光定量PCR熒光定量PCR反應(yīng)體系詳見表5，在Bio-RadCFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序詳見表6，循環(huán)數(shù)為40個(gè)，用軟件CFXManager進(jìn)行結(jié)果分析。表5熒光定量PCR反應(yīng)體系(10ul)組分體積(uL)2XEvagreenMix5ulForwardprimer0.5ulReverseprimer0.5ulcDNA2ulNuclease-freewater2ul表6熒光定量PCR反應(yīng)程序2.5測序驗(yàn)證2.5.1T載體構(gòu)建將2.4所得的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑(E.Z.N.AGelExtractionKitD2500-01)進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD19-TVector16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐抗性的LB培養(yǎng)平板上進(jìn)行培養(yǎng)。2.5.2菌落PCR及測序在培養(yǎng)過夜的LB培養(yǎng)平板上隨機(jī)挑選6個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)體系及程序如下表：表7菌落PCR反應(yīng)體系用瓊脂糖凝膠電泳檢測菌液PCR結(jié)果，觀察條帶片段大小鑒定重組子的正確性。條帶大小正確的陽性克隆送至擎科公司測序。3結(jié)果3.1總RNA濃度及純度檢測因?yàn)闃颖玖康南拗?，所提取的總RNA濃度在12-195ng/μL，大多都只夠一次逆轉(zhuǎn)錄的量，A260/A280比值在1.8—2.1之間，所提RNA純度符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。表8總RNA濃度3.2熒光定量PCR特異性鑒定3.2.1熒光定量PCR溶解曲線對混合逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行單個(gè)目的miRNA和內(nèi)參基因的擴(kuò)增，從每個(gè)指標(biāo)的溶解曲線上(圖1)可看，所擴(kuò)增PCR產(chǎn)物均很單一。3.2.2熒光定量PCR產(chǎn)物電泳鑒定隨機(jī)挑選每個(gè)指標(biāo)的幾個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，從圖2表明，每個(gè)指標(biāo)所擴(kuò)增條帶大小也和理論相符。3.2.3PCR產(chǎn)物測序鑒定由于所擴(kuò)得的miRNAPCR產(chǎn)物長度均只有30bp左右，無法直接用PCR產(chǎn)物測序來進(jìn)行驗(yàn)證，因此我們通過將PCR產(chǎn)物和T載體連接后再進(jìn)行測序驗(yàn)證。將菌落PCR鑒定結(jié)果為陽性的克隆子送測序，結(jié)果顯示，T載體上連接序列均和理論的miRNA序列相符，結(jié)果詳見圖3。3.3混合逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物靈敏度檢測為了檢測混合逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的靈敏度，隨機(jī)選取了C3樣品，其RNA濃度為45.08ng/ul，按逆轉(zhuǎn)錄體系，加7.6ulRNA，即342.6ngRNA進(jìn)行混合逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按10的倍比稀釋，最終稀釋至107倍，取不同稀釋比例的cDNA做熒光定量PCR，分別檢測mir-141，mir-193b和u6能檢測到cq值的最大稀釋倍數(shù)。從表9可見，mir-141和mir-193b直至稀釋至105倍才檢測不到cq值，而u6由于表達(dá)量較高，在稀釋至107倍時(shí)仍能檢測到cq值。按100％的逆轉(zhuǎn)錄效率換算，混合逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA檢測mir-141和mir-193b的檢測限為3.4x10-2ng/ul；u6的檢測限小于3.4x10-5ng/ul，可見混合逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA靈敏度仍較高。表9混合逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物靈敏度檢測3.4待測樣本的檢測根據(jù)法定量分析肺癌組織10例，肺癌遠(yuǎn)端正常組織10例，癌旁組織10例，結(jié)果見圖4，聯(lián)合檢測mir-141和mir193b可以顯著區(qū)分肺癌組織和正常遠(yuǎn)端和近端組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明試劑盒和方法可以通過檢測mir-141和mir193b來篩查肺癌，檢測靈敏度高，特異性好。實(shí)施例2本發(fā)明檢測試劑盒的組成及其使用方法一、檢測試劑盒1、試劑盒的組成逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(50人份)：其中，熒光定量PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(50人份)：組分體積(uL)2XEvagreenMix250ulForwardprimer25ulReverseprimer25ulcDNA100ulNuclease-freewater100ul其中，2、試劑盒的使用方法組織樣本采用液氮研磨的方式破碎，加入300uL組織裂解液后室溫放置5min，再加入300uL稀釋液繼續(xù)室溫放置5min，以最大轉(zhuǎn)速離心5min，小心吸取上清，加入0.5倍上清體積的無水乙醇，用移液器吹打3-4次，混勻。將混合物轉(zhuǎn)移至吸附柱中，過柱純化，加600uLRNA洗液，離心棄廢液；按照表3準(zhǔn)備DNaseI孵育液50uL并加入吸附柱膜中央，室溫放置15min，加入RNA洗液洗滌2次后洗脫得到總RNA，存于-80℃。DNaseI孵育液準(zhǔn)備表樣品每樣本加入量(uL)10XDNaseI緩沖液5DNaseI5無核酸酶水402.2RNA濃度及純度鑒定用ThermoNanoDrop2000全波長酶標(biāo)儀測定RNA濃度和純度。2.3cDNA合成采用混合逆轉(zhuǎn)錄的方法，用一份RNA同時(shí)逆轉(zhuǎn)內(nèi)參基因U6和3個(gè)miRNA,混合逆轉(zhuǎn)錄體系見下表，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：42℃、15min；70℃、15min，具體操作參照GoScriptTMReverseTranscriptionSystem說明書?；旌戏崔D(zhuǎn)錄體系(20ul)2.4熒光定量PCR熒光定量PCR反應(yīng)體系詳見下表，在Bio-RadCFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序詳見下表，循環(huán)數(shù)為40個(gè)，用軟件CFXManager進(jìn)行結(jié)果分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系(10ul)組分體積(uL)2XEvagreenMix5ulForwardprimer0.5ulReverseprimer0.5ulcDNA2ulNuclease-freewater2ul熒光定量PCR反應(yīng)程序綜上，本發(fā)明試劑盒和方法通過同時(shí)檢測組織的mir-141和mir193b來篩查肺癌，檢測靈敏度高，特異性好，可用于臨床肺癌的輔助診斷，為患者采取相關(guān)的治療措施或者決策提供有效的依據(jù)，臨床應(yīng)用前景良好。SEQUENCELISTING<110>四川大學(xué)華西醫(yī)院<120>一種肺癌miRNA標(biāo)志物的聯(lián)合檢測試劑盒<130>GY026-17P1117<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>50<212>DNA<213>mir141ReverseTtranscriptionprimer<400>1gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccatct50<210>2<211>50<212>DNA<213>mir193bReverseTtranscriptionprimer<400>2gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacagcggg50<210>3<211>50<212>DNA<213>mir141Forwardprimer<400>3gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacccatct50<210>4<211>16<212>DNA<213>miRNAReverseprimer<400>4gtgcagggtccgaggt16<210>5<211>50<212>DNA<213>mir193bForwardprimer<400>5gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacagcggg50<210>6<211>20<212>DNA<213>U6ReverseTtranscriptionprimer<400>6aacgcttcacgaatttgcgt20<210>7<211>17<212>DNA<213>U6Forwardprimer<400>7ctcgcttcggcagcaca17<210>8<211>20<212>DNA<213>U6Reverseprimer<400>8aacgcttcacgaatttgcgt20當(dāng)前第1頁1 2 3