本發(fā)明涉及生物技術(shù)工程領(lǐng)域，具體涉及一種蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法。

背景技術(shù)：

蝦仁的腐敗不僅是蝦仁本身的理化變化所致，更是腐敗菌增殖的結(jié)果。不同的水產(chǎn)食品具有不同微生物生態(tài)類群，其獨特的菌相構(gòu)成取決于食品加工所使用的原料、加工參數(shù)和產(chǎn)品的貯藏條件等。在貯藏期內(nèi)的微生物菌相往往不是固定的，這是因為在特定的貯藏環(huán)境中，微生物具有的忍耐力不同。前人對食品的微生物腐敗進行了大量系統(tǒng)的研究，逐步認識到，雖然食品在加工流通過程中會受到多種細菌的侵染，但最終只有少部分細菌大量增殖，在腐敗中占據(jù)主導(dǎo)地位，并且產(chǎn)生腐敗代謝物(臭味、異味、顏色等)，這些菌被稱之為特定腐敗菌(Specific spoilage organisms SSO)。對于新鮮或者初加工的蝦仁，SSO不僅數(shù)量少，而且所占總微生物的比例也非常小，但由于其對貯藏環(huán)境的忍耐力強，能夠在特定的環(huán)境下快速增殖，并在貯藏期中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，到感官拒絕點時，SSO的數(shù)量得到了大量的積累，所占比例也大幅增加，與此同時代謝產(chǎn)物也有了迅速增加和積累，導(dǎo)致了蝦仁的感官不可接受及其腐敗變質(zhì)的發(fā)生。不同的原料、加工工藝、包裝、運輸方式等會導(dǎo)致食品微生態(tài)系統(tǒng)的不同，所以特定腐敗菌也會不同，因此必須針對不同產(chǎn)品進行微生物的菌相分析。

人們對食品貯藏過程中的細菌的研究，多采用傳統(tǒng)的分離、純化和鑒定方法，不僅繁雜耗時，而且受培養(yǎng)條件的影響，所用分離培養(yǎng)基不能滿足所有細菌的營養(yǎng)需求，僅有很少一部分細菌能被分離到。因此傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能全面反映食品貯藏過程中細菌的多樣性與特定腐敗菌的真實情況，結(jié)果準(zhǔn)確性及可靠性差。

PCR-DGGE(PCR-denatured gradient gel electrophoresis)技術(shù)是基于微生物基因所包含的序列不同而對微生物的多態(tài)性進行分析，可對整個菌群多樣性實現(xiàn)動態(tài)分析，并可同時檢測多個樣品，還可對不同樣品進行比較，因而有利于研究不同來源樣品中細菌菌群多樣性的動態(tài)觀察。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能全面、準(zhǔn)確反映蝦仁低溫貯藏過程中的細菌的種群結(jié)構(gòu)、細菌多樣性與特定腐敗菌的問題，本發(fā)明提供了一種蝦仁貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法。

本發(fā)明提供一種蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步驟進行：

(1)、蝦仁樣品的預(yù)處理及菌體收集；

(2)、提取蝦仁樣品中微生物總DNA；

(3)、以提取的微生物總DNA為模板，進行細菌16S rRNA的PCR擴增，并檢測；

(4)、將PCR產(chǎn)物進行DGGE電泳分析；電泳結(jié)束后染色、掃描儀成像，得到DGGE圖譜，在圖譜上標(biāo)記特異條帶，切膠回收；

(5)、回收的DNA條帶重新進行PCR擴增，然后測序，將測得的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對分析，確定細菌的歸屬，然后根據(jù)在DGGE圖譜上標(biāo)記的條帶情況與鑒定出的細菌種類進行分析。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步驟進行：

(1)、蝦仁樣品的預(yù)處理及菌體收集；

(2)、采用細菌微生物DNA提取液進行蝦仁樣品中微生物總DNA的快速提??；

(3)、以提取的微生物總DNA為模板，采用16S rRNA基因V3高變區(qū)F357-GC和R518區(qū)具有特異性的引物對，進行細菌16S rRNA的PCR擴增，將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(4)、將PCR產(chǎn)物進行DGGE電泳分析；電泳結(jié)束后染色、掃描儀成像，得到DGGE圖譜，在圖譜上標(biāo)記特異條帶，切膠回收；

(5)、回收的DNA條帶重新進行PCR擴增，然后對產(chǎn)物進行測序，將測得的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對分析，確定細菌的歸屬，然后根據(jù)在DGGE圖譜上標(biāo)記的條帶情況與鑒定出的細菌種類進行分析。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(1)的具體操作為：樣品為南美白對蝦，從養(yǎng)殖塘捕撈后放入水泥池充氣暫養(yǎng)一個晚上，捕撈打包并且冰藏后運到實驗室的無菌室，無菌操作去殼與腸腺；稱取10g蝦仁加入到90mL PBS緩沖液中，均質(zhì)器均質(zhì)1min，200目絹布過濾，取濾液1000rpm離心10min，去沉淀，上清液10000rpm離心5min，收集菌體重懸浮于TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(2)中所述細菌微生物DNA提取液的組成為：9g NaCl，0.1g SDS(十二烷基硫酸鈉)，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去離子水。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(2)中所述DNA的快速提取方法為：取樣品菌懸液離心后，倒去上清，加入提取液渦旋，沸水浴加熱，再次離心，上清液即為DNA溶液。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(2)中所述DNA的快速提取方法為：取樣品菌懸液1mL，15000rpm離心1min，倒去上清，加入50μL提取液渦旋混勻，沸水浴加熱2min，15000rpm再次離心1min，上清液即為DNA溶液。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(3)中將PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(3)中引物對F357-GC和R518為：

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)體系為50μl總體積，ddH₂O 41.25μl，10×Buffer(含2.0mM MgCl₂)5μl，dNTP(10mM)1μl，F(xiàn)357-GC(10μM)1μl，R518(10μM)1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，模板DNA 0.5μl。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(3)中反應(yīng)程序為：94℃4min預(yù)變性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min；取PCR產(chǎn)物各3μl，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，120V穩(wěn)壓電泳30min，凝膠成像儀拍照。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(4)的具體操作為：

取樣品各400ng的V3區(qū)PCR產(chǎn)物，采用D-Code突變檢測系統(tǒng)對樣品進行DGGE分析；所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％(丙稀酰胺：雙丙稀酰胺＝37.5︰1)，變性劑濃度從30％～60％(100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺)；在60V電壓下，60℃恒溫，1×TAE中電泳16.0h；電泳完畢后，用超純水沖洗膠，然后將膠放進含EB的染液中，置于搖床上染色30min，并立即進行拍照和切膠用于條帶分析；選取較有代表性(條帶清晰)的條帶，用潔凈的手術(shù)刀片將目標(biāo)DGGE條帶完整的切下并裝入1.5ml離心管中，用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒SK8131方法回收，備用。

進一步地，所述蝦仁低溫貯藏過程中特定腐敗菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步驟(4)中所述電泳儀器為Dcode的基因突變檢測系統(tǒng)，電泳條件為電壓60V，60℃恒溫，電泳16.0h；變性梯度為30％～60％。

本方法的積極效果是能全面準(zhǔn)確的反映蝦仁低溫貯藏過程中細菌的種群結(jié)構(gòu)、細菌多樣性與特異性。與純培養(yǎng)方法相比較，該方法具有操作簡便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)勢，在快速的同時還能比對分析大量樣品，可以對比分析同一種蝦仁不同貯藏溫度以及同一貯藏溫度不同貯藏時間段的細菌群落差異，還能對比分析研究不同貯藏階段的特定腐敗菌及細菌群落差異。采用DGGE分析可以檢測到菌群中相對含量1％以上的菌，并可對微生物圖譜進行分析。

附圖說明

圖1為蝦仁樣品在-20℃貯藏過程中PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為蝦仁樣品在-20℃貯藏下細菌總DNA的PCR-DGGE圖譜。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面具體講述本發(fā)明的具體實施步驟：

1、蝦仁樣品的預(yù)處理：

樣品為舟山市浙江華興水產(chǎn)科技有限公司養(yǎng)殖的南美白對蝦，從養(yǎng)殖塘捕撈后放入水泥池充氣暫養(yǎng)一個晚上(為了排掉腸道內(nèi)的糞便)，捕撈打包并且冰藏后運到實驗室的無菌室，無菌操作去殼與腸腺，稱取10g蝦仁加入到90mLPBS緩沖液中，均質(zhì)器均質(zhì)1min，200目絹布過濾，取濾液1000rpm離心10min，去沉淀，清液10000rpm離心5min,收集菌體重懸浮于TE中，-20℃保存?zhèn)溆茫黄溆辔r仁按照每份10g分裝-20℃貯藏，間隔一定時間后按照上述步驟操作進行預(yù)處理后進行細菌DNA的提取。

2、蝦仁樣品中微生物總DNA的提?。?/p>

采用自制的細菌微生物DNA提取液，其配方為：9g NaCl，0.1gSDS，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去離子水。DNA的快速提取方法為：取樣品菌懸液1mL，15000rpm離心1min，倒去上清，加入50μL提取液渦旋混勻，沸水浴加熱2min，15000rpm離心1min，上清液即為DNA溶液。該方法特征在于：DNA提取的步驟中所提取的DNA無需進一步純化，可以直接用于后續(xù)的PCR擴增。

3、PCR擴增：

所用引物為細菌16S rDNA V3高變區(qū)F357-GC和R518(見表1)，反應(yīng)體系為50μl總體積，ddH₂O 41.25μl，10×Buffer(含2.0mM MgCl2)5μl，dNTP(10mM)1μl，F(xiàn)357-GC(10μM)1μl，R518(10μM)1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，模板DNA 0.5μl。PCR擴增反應(yīng)程序：94℃4min預(yù)變性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min。取PCR產(chǎn)物各3μl，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE緩沖液，120V穩(wěn)壓電泳30min，凝膠成像儀拍照。

表1：16S rDNA V3高變區(qū)PCR所用引物

4、PCR-DGGE分析及切膠回收：

取樣品各400ng的V3區(qū)PCR產(chǎn)物，采用D-Code突變檢測系統(tǒng)對樣品進行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％(丙稀酰胺：雙丙稀酰胺＝37.5︰1)，變性劑濃度從30％～60％(100％的變性劑為7mol/L尿素，40％甲酰胺)。在60V電壓下，60℃恒溫，1×TAE中電泳16.0h。電泳完畢后，用超純水沖洗膠，然后將膠放進含EB的染液中，置于搖床上染色30min，并立即進行拍照和切膠，用于條帶分析。選取較有代表性(條帶清晰)的條帶，用潔凈的手術(shù)刀片將目標(biāo)DGGE條帶完整的切下并裝入1.5ml離心管中，用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒SK8131方法回收，備用。

5、PCR擴增與克隆測序

回收的DNA條帶需重新進行PCR擴增，擴增引物為表1中去掉GC夾子的引物，然后將再次擴增的PCR產(chǎn)物送去上海生物工程有限公司進行克隆測序。將測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，確定細菌的歸屬，并登陸NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast同源性比對，比對結(jié)果說明蝦仁在-20℃貯藏過程中芽孢桿菌屬是其特異性腐敗菌，具體比對結(jié)果見表2。

表2.DGGE圖譜分離細菌V3區(qū)序列相似性比較結(jié)果

從上表中可以看出芽胞桿菌、摩根(氏)菌屬、不動細菌屬、寡養(yǎng)食單胞菌是蝦仁凍藏過程中的特異性腐敗菌。

本實例是為便于閱讀者更好理解本發(fā)明的內(nèi)容，提供的一種具體實施方案，而非限制本發(fā)明的保護范圍。