本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及PIGR基因在舌鱗癌的診斷、治療中的用途。

背景技術(shù)：

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，以鱗癌最為常見，居口腔癌之首。舌癌多發(fā)生于舌的中三分之一側(cè)緣，惡性程度較高，局部浸潤性強，常累及舌肌，使舌運動受限，影響講話、進(jìn)食以及吞咽功能。盡管在治療方面取得了較大的進(jìn)展，但是舌癌病人的存活率在過去近幾十年內(nèi)并沒有明顯的提高。

目前研究表明，吸煙、飲酒等化學(xué)因素、人乳頭(狀)瘤病毒(human papilloma virus，HPV)以及遺傳因素改變與舌癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然研究者們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)近幾十個瘤基因或抑瘤基因參與了舌癌的發(fā)生和發(fā)展，但到目前為止，舌癌發(fā)病的分子機制還未能明確，可能還存在其它腫瘤相關(guān)基因參與了舌癌的發(fā)病過程。因此，如果能尋找到舌癌特異性相關(guān)基因，這將有助于闡明舌癌發(fā)病的分子機制，也將為舌癌的診斷、治療和預(yù)后提供分子靶標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于舌鱗癌早期診斷的分子標(biāo)志物。相比現(xiàn)有的舌鱗癌的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來診斷舌鱗癌的具有及時性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險，針對風(fēng)險高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測PIGR基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷舌鱗癌的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述檢測PIGR基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測PIGR基因mRNA水平的產(chǎn)品、和/或檢測PIGR蛋白水平的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述檢測PIGR基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片檢測PIGR基因表達(dá)以診斷舌鱗癌的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PIGR基因的引物；所述用實時定量PCR診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PIGR基因的引物；所述用免疫檢測診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：與PIGR蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：與PIGR基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷舌鱗癌的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與PIGR蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與PIGR基因的核酸序列雜交的探針。

所述用實時定量PCR診斷舌鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增PIGR基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述檢測PIGR基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測PIGR基因表達(dá)的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

所述診斷舌鱗癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷舌鱗癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知PIGR基因的異常與舌鱗癌相關(guān)也屬于PIGR基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種診斷舌鱗癌的工具，所述工具包括檢測PIGR基因表達(dá)的試劑；所述試劑包括檢測PIGR基因mRNA的引物和/或探針、檢測PIGR蛋白的抗體。

所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測PIGR基因轉(zhuǎn)錄水平的針對PIGR基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的PIGR蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括PIGR基因在內(nèi)的多個基因(例如，與舌鱗癌相關(guān)的多個基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括PIGR蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與舌鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過將多個與舌鱗癌的標(biāo)志物同時檢測，可大大提高舌鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測PIGR基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括PIGR蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片方法檢測PIGR基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對PIGR基因的引物和/或探針。根據(jù)PIGR基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計出可以用于檢測PIGR基因表達(dá)水平的引物和探針。

所述試紙包括檢測PIGR基因表達(dá)的試劑。

所述高通量測序平臺包括檢測PIGR基因表達(dá)的試劑。

與PIGR基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。

進(jìn)一步，所述PIGR蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述PIGR蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能夠保留與PIGR蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述檢測PIGR基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對。

本發(fā)明還提供了PIGR基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療舌鱗癌的藥物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制PIGR基因表達(dá)的試劑、和/或抑制PIGR基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

進(jìn)一步，所述抑制PIGR基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯的試劑；所述抑制PIGR基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制PIGR基因mRNA的試劑、抑制PIGR蛋白的試劑。所述抑制PIGR基因mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制PIGR蛋白的試劑包括抑制PIGR蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制PIGR蛋白活性的試劑、抑制PIGR蛋白功能的試劑。

進(jìn)一步，抑制PIGR基因mRNA的試劑包括針對PIGR基因mRNA的雙鏈核糖核酸；抑制PIGR蛋白功能的試劑包括PIGR抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制PIGR蛋白功能的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對PIGR基因mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。為了確保PIGR基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)PIGR基因的mRNA序列設(shè)計了siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計原則(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al2004，Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。為了進(jìn)一步提高siRNA片斷的有效性，綜合兩個在線設(shè)計工具的優(yōu)點來設(shè)計用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源性比對(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶效應(yīng)。

優(yōu)選地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本發(fā)明還提供了一種用于治療舌鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所述的PIGR基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上的混合。

本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療舌鱗癌的藥劑。

本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動物，其中該哺乳動物優(yōu)選為人類病患。

本發(fā)明的藥物組合物可例如以口服、注射等方式給予至該人類病患體內(nèi)。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療舌鱗癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提到治療的成功率。

在本發(fā)明的上下文中，“PIGR基因”包括PIGR基因以及PIGR基因的任何功能等同物的多核苷酸。PIGR基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中PIGR基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；

優(yōu)選地，PIGR基因的編碼序列包括以下任一一種DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；

(3)與(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PIGR基因的編碼序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本發(fā)明的上下文中，PIGR基因表達(dá)產(chǎn)物包括PIGR蛋白以及PIGR蛋白的部分肽。所述PIGR蛋白的部分肽含有與舌鱗癌相關(guān)的功能域。

“PIGR蛋白”包括PIGR蛋白以及PIGR蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PIGR蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與PIGR的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，PIGR蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數(shù)通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個。

(3)與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又稱為序列同一性)，更優(yōu)選地，與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述PIGR蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是PIGR蛋白的融合蛋白。對于與PIGR蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留PIGR蛋白的生物學(xué)活性即可。

本發(fā)明的PIGR蛋白也包括對SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留PIGR蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷舌鱗癌”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有舌鱗癌、也包括判斷受試者是否存在患有舌鱗癌的風(fēng)險。

在本發(fā)明的上下文中，“治療舌鱗癌”從疾病的狀態(tài)變化來分，可以包括疾病的緩解、疾病的完全治愈，還包括用于評價疾病的治療效果。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了PIGR基因表達(dá)與舌鱗癌相關(guān)，通過檢測受試者組織中PIGR的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有舌鱗癌、或者判斷受試者是否存在患有舌鱗癌的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。

在基因水平上進(jìn)行口腔癌的早期診斷已經(jīng)成為了口腔癌領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，申請?zhí)枮椋?01611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2專利文獻(xiàn)均披露了可以用于口腔癌或者舌鱗癌診斷的基因標(biāo)志物，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-PIGR基因，能夠?qū)崿F(xiàn)舌鱗癌的早期診斷，從而降低舌鱗癌的死亡率。

附圖說明

圖1顯示利用RT-PCR檢測PIGR基因在舌鱗癌組織與正常組織中的表達(dá)差異圖；

圖2顯示利用Western blot檢測PIGR蛋白在舌鱗癌組織與正常組織中的表達(dá)差異圖；

圖3顯示利用Western blot檢測siRNA對PIGR基因表達(dá)的抑制效果圖；

圖4顯示PIGR基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5顯示PIGR基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞遷移的影響圖；

圖6顯示PIGR基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞成瘤的影響圖。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1PIGR基因的差異表達(dá)

1、實驗材料

5例舌鱗癌組織標(biāo)本取自口腔頜面外科手術(shù)病人，其中，高分化鱗癌2例，中分化鱗癌2例，低分化鱗癌1例；包括男性2例，女性3例。同時，選取每一例癌組織癌腫周圍>5cm處正常組織為自身對照。所有患者就診前均未經(jīng)過化療、放療、生物治療及其它針對腫瘤的治療。取材后一部分組織立即放入液氮中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2、RNA提取、cDNA合成

Trizol RNA試劑(Invitrogen公司)抽提總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(ND-1000,NanoDrop公司)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA；按照Qiagen公司說明書,經(jīng)RNeasy MinElute Cleanup Kit純化得到mRNA；mRNA經(jīng)Poly-A RNA Controlkit(Affymetrix公司)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，并純化；

3、生物素標(biāo)記cRNA雜交

以cDNA為模板,應(yīng)用MessageAmpTM II-Biotin Arna Amplification Kit(Ambion公司)體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA，純化后按Affymetrix公司的真核生物表達(dá)譜單輪芯片擴增程序加入5×片段化緩沖液得到大小分布在 35～200nt的片段化cRNA；靶標(biāo)制備完成后,應(yīng)用真核生物Hybridization Control Kit(Affymetrix公司)配制雜交液,注入雜交液的芯片平衡放置于雜交爐中,45℃,60r/min旋轉(zhuǎn)雜交16h(Hybridization Oven 640,Affymetrix公司)，然后在Affymetrix公司提供的洗滌工作站中(Fluidics Station 450，Affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；

4、掃描和分析

應(yīng)用Scanner 3000(Affymetrix公司)掃描儀掃描圖像。掃描圖像首先用Operating Software Version1.4(GCOS 1.4,Affymetrix公司)軟件進(jìn)行圖像到信號值的轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換成原始數(shù)據(jù)文件。然后使用軟件dChip 2006中的invariant set Normalization方法和Model-base ExpressionIndex模型對GCOS輸出結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)在各芯片中檢測到的P值，當(dāng)數(shù)據(jù)集的檢測值Call值(Absolute Call,Abs Call)為不存在A(Absent)或者臨界值M(Marginal)時,被視為不表達(dá),只有Abs Call值為存在P(present)的數(shù)據(jù)集才被用于進(jìn)一步的分析。

5、組織差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因的篩選利用Significant Analysis of Microarray Software(SAM)算法進(jìn)行。

6、結(jié)果

芯片共篩選出859個差異表達(dá)基因。與正常組織相比，舌鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)的基因為517個，表達(dá)下調(diào)的基因為342個。

實施例2差異表達(dá)基因在大樣本中的驗證

1、研究對象

按照實施例1的方法收集舌鱗癌組織標(biāo)本45例，正常組織標(biāo)本50例。

2、RNA提取和cDNA合成

按照實施例1的方法進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。

3、RT-PCR

引物是由引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計，大連寶生物公司與上海英駿公司合成。PIGR基因及內(nèi)參基因所用引物序列如下：

PIGR基因引物序列

5’-AACTATACAGGAAGAATA-3’(SEQ ID NO.3)，

5’-TATTACTATTGGAATCATC-3’(SEQ ID NO.4)；

GAPDH基因引物序列

5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO.5)，

5’-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.6)。

取1μl cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃變性，5min；95℃30s,55℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物擴增后于1％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察，VDS凝膠成像儀上照相。利用凝膠圖像分析軟件Bandleader分析得出PIGR基因和GAPDH PCR產(chǎn)物條帶吸收光度值，然后計算PIGR基因和GAPDH吸收光度值的相對比值，用以表示目的基因的相對表達(dá)強度。

4、細(xì)胞總蛋白的提取

按照EpiQuik全細(xì)胞提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。

5、Western blot檢測

總蛋白用Brandford法定量，取適量與樣品緩沖液混合煮沸5min，冷卻5min；取30pg蛋白上樣到制備好的15％聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳，開始設(shè)為80V恒壓，看見Marker后增加至120V；將電泳后的膠取出，使用Bio.Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于100V轉(zhuǎn)移50min；轉(zhuǎn)膜完畢后，用1xPBS洗一次，浸入封閉液，40℃過夜；倒掉封閉液，加入Western洗滌液洗滌5-10min，加入一抗搖床室溫雜交2h；按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋于封閉緩沖液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL試劑顯影、定影檢測蛋白表達(dá)。

6、統(tǒng)計學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將PIGR蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖1和圖2所示，與正常組織相比，舌鱗癌組織中PIGR的表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實施例3PIGR基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞增殖能力的測定

1、干擾PIGR基因表達(dá)

1.1siRNA合成

根據(jù)PIGR基因的mRNA序列設(shè)計并合成siRNA序列siRNA-PIGR：

正義鏈為5’-AGUACUUCAACAGAUCAUCAA-3’(SEQ ID NO.7)；

反義鏈為5’-GAUGAUCUGUUGAAGUACUUA-3’(SEQ ID NO.8)，

以上siRNA序列與陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)(陰性對照組siRNA與PIGR基因的序列無同源性)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2舌鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人舌鱗癌細(xì)胞株HN4培養(yǎng)于含10％FBS、100U/m L青霉素和100μg/m L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞放在含5％CO₂的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞以2×10⁵/孔接種于6孔板，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，貼壁過夜，待細(xì)胞匯合達(dá)80-90％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換為不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。用250μl DMEM/F12稀釋siRNA(終濃度為33nM)，輕輕吹吸3-5次混勻。輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用250μl DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋5μl脂質(zhì)體2000，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞板中，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。細(xì)胞板置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h換含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3Western blot實驗檢測siRNA-PIGR的干擾效率

步驟同實施例2。

結(jié)果如圖3所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGR的細(xì)胞中PIGR蛋白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2、MTT實驗分析細(xì)胞增殖活性

將已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞24h后接種于96孔板，1×10³個/孔，分別在24、48、72、96h時間點加入20μL MTT(5mg/m L)溶液，每組設(shè)置6個復(fù)孔；孵育箱培養(yǎng)4h后，小心吸去培養(yǎng)液，每孔再加入150μL DMSO；酶標(biāo)儀檢測590nm處吸光度值，實驗重復(fù)三次。

3、實驗結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGR組細(xì)胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述實驗結(jié)果表明，PIGR基因表達(dá)促進(jìn)了舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

實施例4PIGR基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的測定

1、細(xì)胞遷移實驗

將已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞24h后用胰酶消化吹打并充分重懸為單細(xì)胞懸液后，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，將細(xì)胞數(shù)稀釋至5×10⁶個/mL，接種于6孔板中，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后棄去培養(yǎng)液，用滅菌槍頭在6孔培養(yǎng)板底部單層細(xì)胞的中央劃出一劃痕，洗去死細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別于0、24、48h拍照計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

2、細(xì)胞侵襲實驗

采用DMEM/F12將Matrigel稀釋(1∶6)，加入至Transwell小室上室，100μL/孔，細(xì)胞孵育箱放置2h，在下室加入1m L含10％PBS的DMEM培養(yǎng)基，在上室加入1×10⁶個/ml的轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞懸液200μL，常規(guī)培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕柔擦去上室的Matrigel，PBS小心沖洗，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，再用PBS洗去多余的結(jié)晶紫染液，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，實驗重復(fù)3次。

3、實驗結(jié)果

遷移實驗：如圖5所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGR組細(xì)胞遷移數(shù)少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

侵襲實驗：在結(jié)晶紫染色后正置顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為(58±6)個，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGR組穿膜細(xì)胞數(shù)(15±2)。

實施例5PIGR基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞成瘤能力的測定

平板克隆實驗

取已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用胰酶消化并吹打成單個細(xì)胞，計數(shù)，使細(xì)胞在含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中稀釋至1000個/m L并接種于培養(yǎng)皿中，輕輕搖動使細(xì)胞均勻，放入孵箱2～3周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)鏡下可見的30～50個細(xì)胞的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％的多聚甲醛固定15min。去除固定液，加適量的結(jié)晶紫染色10～30min，再用流水洗凈，空氣干燥。顯微鏡下計數(shù)＞30個細(xì)胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率，克隆形成率(％)＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％。

結(jié)果如圖6所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGR組細(xì)胞克隆形成率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> 舌鱗癌診治標(biāo)志物

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2295

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgctgctct tcgtgctcac ctgcctgctg gcggtcttcc cagccatctc cacgaagagt 60

cccatatttg gtcccgagga ggtgaatagt gtggaaggta actcagtgtc catcacgtgc 120

tactacccac ccacctctgt caaccggcac acccggaagt actggtgccg gcagggagct 180

agaggtggct gcataaccct catctcctcg gagggctacg tctccagcaa atatgcaggc 240

agggctaacc tcaccaactt cccggagaac ggcacatttg tggtgaacat tgcccagctg 300

agccaggatg actccgggcg ctacaagtgt ggcctgggca tcaatagccg aggcctgtcc 360

tttgatgtca gcctggaggt cagccagggt cctgggctcc taaatgacac taaagtctac 420

acagtggacc tgggcagaac ggtgaccatc aactgccctt tcaagactga gaatgctcaa 480

aagaggaagt ccttgtacaa gcagataggc ctgtaccctg tgctggtcat cgactccagt 540

ggttatgtaa atcccaacta tacaggaaga atacgccttg atattcaggg tactggccag 600

ttactgttca gcgttgtcat caaccaactc aggctcagcg atgctgggca gtatctctgc 660

caggctgggg atgattccaa tagtaataag aagaatgctg acctccaagt gctaaagccc 720

gagcccgagc tggtttatga agacctgagg ggctcagtga ccttccactg tgccctgggc 780

cctgaggtgg caaacgtggc caaatttctg tgccgacaga gcagtgggga aaactgtgac 840

gtggtcgtca acaccctggg gaagagggcc ccagcctttg agggcaggat cctgctcaac 900

ccccaggaca aggatggctc attcagtgtg gtgatcacag gcctgaggaa ggaggatgca 960

gggcgctacc tgtgtggagc ccattcggat ggtcagctgc aggaaggctc gcctatccag 1020

gcctggcaac tcttcgtcaa tgaggagtcc acgattcccc gcagccccac tgtggtgaag 1080

ggggtggcag gaggctctgt ggccgtgctc tgcccctaca accgtaagga aagcaaaagc 1140

atcaagtact ggtgtctctg ggaaggggcc cagaatggcc gctgccccct gctggtggac 1200

agcgaggggt gggttaaggc ccagtacgag ggccgcctct ccctgctgga ggagccaggc 1260

aacggcacct tcactgtcat cctcaaccag ctcaccagcc gggacgccgg cttctactgg 1320

tgtctgacca acggcgatac tctctggagg accaccgtgg agatcaagat tatcgaagga 1380

gaaccaaacc tcaaggtacc agggaatgtc acggctgtgc tgggagagac tctcaaggtc 1440

ccctgtcact ttccatgcaa attctcctcg tacgagaaat actggtgcaa gtggaataac 1500

acgggctgcc aggccctgcc cagccaagac gaaggcccca gcaaggcctt cgtgaactgt 1560

gacgagaaca gccggcttgt ctccctgacc ctgaacctgg tgaccagggc tgatgagggc 1620

tggtactggt gtggagtgaa gcagggccac ttctatggag agactgcagc cgtctatgtg 1680

gcagttgaag agaggaaggc agcggggtcc cgcgatgtca gcctagcgaa ggcagacgct 1740

gctcctgatg agaaggtgct agactctggt tttcgggaga ttgagaacaa agccattcag 1800

gatcccaggc tttttgcaga ggaaaaggcg gtggcagata caagagatca agccgatggg 1860

agcagagcat ctgtggattc cggcagctct gaggaacaag gtggaagctc cagagcgctg 1920

gtctccaccc tggtgcccct gggcctggtg ctggcagtgg gagccgtggc tgtgggggtg 1980

gccagagccc ggcacaggaa gaacgtcgac cgagtttcaa tcagaagcta caggacagac 2040

attagcatgt cagacttcga gaactccagg gaatttggag ccaatgacaa catgggagcc 2100

tcttcgatca ctcaggagac atccctcgga ggaaaagaag agtttgttgc caccactgag 2160

agcaccacag agaccaaaga acccaagaag gcaaaaaggt catccaagga ggaagccgag 2220

atggcctaca aagacttcct gctccagtcc agcaccgtgg ccgccgaggc ccaggacggc 2280

ccccaggaag cctag 2295

<210> 2

<211> 764

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile

1 5 10 15

Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu

20 25 30

Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn

35 40 45

Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn

85 90 95

Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu

100 105 110

Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser

115 120 125

Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu

130 135 140

Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln

145 150 155 160

Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg

180 185 190

Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn

195 200 205

Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp

210 215 220

Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro

225 230 235 240

Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His

245 250 255

Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg

260 265 270

Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala

305 310 315 320

Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly

325 330 335

Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile

340 345 350

Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala

355 360 365

Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp

370 375 380

Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp

385 390 395 400

Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu

405 410 415

Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr

420 425 430

Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu

435 440 445

Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu

450 455 460

Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val

465 470 475 480

Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys

485 490 495

Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly

500 505 510

Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser

515 520 525

Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys

530 535 540

Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val

545 550 555 560

Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala

565 570 575

Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg

580 585 590

Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu

595 600 605

Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser

610 615 620

Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu

625 630 635 640

Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val

645 650 655

Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val

660 665 670

Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn

675 680 685

Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr

690 695 700

Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu

705 710 715 720

Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys

725 730 735

Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr

740 745 750

Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala

755 760

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aactatacag gaagaata 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tattactatt ggaatcatc 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggtcggag tcaacggatt tg 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccatgggtgg aatcatattg gaa 23

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

aguacuucaa cagaucauca a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaugaucugu ugaaguacuu a 21