本發(fā)明涉及一種試劑盒及其應(yīng)用，尤其涉及一種快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牛支原體(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)和不孕等疾病。1961年，美國(guó)人Hale等首次從在患乳房炎奶牛的牛奶中分離出牛支原體。1976年牛支原體被描述為致呼吸道疾病的主要病因，之后，牛支原體及其相關(guān)疾病迅速擴(kuò)散至世界各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的牛群，對(duì)世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展造成了極大的威脅和了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2008年以來(lái)，我國(guó)多地相繼發(fā)生并廣泛流行的以發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕為主要癥狀，以壞死性肺炎為主要病變的牛呼吸道傳染病亦被確定為牛支原體感染所致的牛支原體肺炎，由于該病常規(guī)藥物療效不佳，且無(wú)有效疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此給我國(guó)的養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

由于牛支原體肺炎臨床癥狀無(wú)特殊性，臨床上極易與其他呼吸道疾病相混淆，因此，目前牛支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等。其中，病原學(xué)診斷最為確實(shí)，但卻需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。而血清學(xué)診斷方法中常規(guī)的抗體檢測(cè)方法診斷牛支原體肺炎靈敏度低，非特異性高。因此，快速、靈敏和特異的牛支原體檢測(cè)方法的建立對(duì)牛支原體肺炎的及時(shí)、準(zhǔn)確診斷和有效控制具有重要意義。

PCR方法敏感性和特異性較好，是臨床病原學(xué)診斷中較為普遍的一種方法。但是傳統(tǒng)的PCR方法從樣品的裂解、DNA提取、PCR擴(kuò)增到電泳檢測(cè)需要5小時(shí)以上。而細(xì)菌分離培養(yǎng)到純化及DNA提取擴(kuò)增至少需要3～4天才能做出初步鑒定。因此普通的PCR方法和分離鑒定方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果也不準(zhǔn)確，而且敏感性差，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果，不利于養(yǎng)殖戶和規(guī)?；髽I(yè)快速準(zhǔn)確診斷病原，立即采取相應(yīng)的疫苗和藥物來(lái)進(jìn)行及時(shí)的治療以減少損失的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提出的一種快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒及其應(yīng)用，樣品簡(jiǎn)單處理，直接擴(kuò)增，快速反應(yīng)，整個(gè)過(guò)程1小時(shí)內(nèi)完成，檢測(cè)迅速，靈敏性佳。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案解決技術(shù)問(wèn)題：一種快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒，包含以下試劑：PCR擴(kuò)增試劑，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

上述所述PCR擴(kuò)增試劑含有2×Direct PCR Mix 10μl、10pM正向引物1μl、10pM反向引物1μl、5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl、加滅菌ddH₂O至19μl。所述正向引物為PF：5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’，所述反向引物為PR：5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’。

本發(fā)明提供的試劑盒能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出牛肺炎支原體?？蓪?duì)牛肺炎支原體感染的單個(gè)樣品檢測(cè)，也可對(duì)臨床病例中混合感染的檢測(cè)，可用于牛支原體肺炎病原普查、分子流行病學(xué)調(diào)查及疫苗篩選和監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟：

第一步、樣品的采集，分為病料和鼻咽拭子采集，所述病料采集為無(wú)菌條件下采集病料10mg～100mg，裝入無(wú)RNA酶污染的離心管中備用，所述鼻咽拭子采集為采集鼻咽液，裝入無(wú)RNA酶污染的離心管中備用；

第二步、樣品處理，鼻咽拭子中加入200μl滅菌ddH₂O，擠壓后棄掉拭子，病料研磨后的固體狀樣品2mg，加入20μl滅菌ddH₂O，震蕩混勻；快速渦旋5秒，取1μl上清作為模板。

第三步、直接PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，取處理后的樣品上清1μl，加入PCR擴(kuò)增試劑19μl，充分混勻，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別取1μl加入19μl PCR擴(kuò)增試劑，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8℃30s；然后35個(gè)循環(huán)：98℃5s，55℃5s，72℃5s；最后72℃1min；

第四步、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物直接加到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入DNA Marker(2000bp)對(duì)照,電壓為100V，電泳20min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，如果樣品能擴(kuò)增出1390bp條帶，說(shuō)明樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照也擴(kuò)增出1390bp條帶，陰性對(duì)照沒(méi)有條帶。

上述方法的所述第三步中的反應(yīng)體系為20μl，含有處理后的樣品上清1μl，2×Direct PCR Mix 10μl，10pM正向引物1μl，10pM反向引物1μl，5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl，加滅菌ddH₂O至20μl。充分混合均勻后短暫離心。擴(kuò)增長(zhǎng)度為1390bp。所述第四步中瓊脂糖凝膠電泳時(shí)的凝膠濃度為1.0％，其中含有1％的凝膠染料。

本發(fā)明的方法是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的，檢測(cè)中提供了陰性和陽(yáng)性對(duì)照，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度，降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)幾率，特異性較強(qiáng)，省時(shí)省力，該試劑盒將檢測(cè)時(shí)間縮短至1h，大大提高了工作效率。本發(fā)明特別適合于牛肺炎支原體感染的大量臨床樣本的快速診斷，可以為臨床和科研上牛支原體肺炎的防治和治療提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)提高牛肺炎支原體的檢測(cè)、監(jiān)控、疫苗研制等具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，圖中的Marker為DL 2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，由圖1可知，模板PCR擴(kuò)增片段約為1390bp，證明擴(kuò)增片段為目的片段，符合預(yù)期設(shè)計(jì)大小，1為陽(yáng)性對(duì)照，2為支原體擴(kuò)增的片段，3為陰性對(duì)照。

圖2為試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果，圖中的Marker為DL 2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp。1為陽(yáng)性對(duì)照，2為支原體擴(kuò)增，3～9依次為豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、波氏桿菌、沙門氏菌，均未擴(kuò)增出。由圖2可知，試劑盒特異性好。

圖3為試劑盒敏感性檢測(cè)結(jié)果，圖中的Marker為DL 2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，1為陽(yáng)性對(duì)照，2～7依次為模板10⁰～10^-5稀釋度。由圖3可知，模板稀釋度為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰條帶，證明試劑盒檢測(cè)的敏感度為10^-4，試劑盒敏感性好。

圖4為試劑盒的臨床應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果，圖中的Marker為DL 2000bp，從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp，1為陽(yáng)性對(duì)照，2～22為臨床病料，23為陰性對(duì)照。由圖4可知，試劑盒可以用于臨床病料的檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，文中的百分含量，如沒(méi)有特別說(shuō)明均指重量百分比。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的方法的建立：

(1)PCR擴(kuò)增試劑，含有2×Direct PCR Mix 10μl、10pM正向引物1μl、10pM反向引物1μl、5U/μl Hot Strart Taq酶0.5μl、加滅菌ddH₂O至19μl。其中2×Direct PCR Mix含dNTPs、MgCl₂、PCR buffer、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、藍(lán)色示蹤染料。

(2)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為牛支原體疫苗株，陰性對(duì)照為滅菌ddH₂O。

反應(yīng)體系為20μl，處理后的樣品上清1μl，PCR擴(kuò)增試劑19μl。

包括以下步驟：

(1)樣品的采集：

①病料：無(wú)菌采集病料10mg～100mg，裝入無(wú)RNA酶污染的離心管中備用。

②鼻咽拭子：用鼻咽拭子采集鼻咽液，裝入無(wú)RNA酶污染的離心管中備用。

(2)樣品處理：

①鼻咽拭子中加入200μl滅菌ddH₂O，擠壓后棄掉拭子。

②固體狀的動(dòng)物組織先進(jìn)行研磨，取研磨后的固體狀樣品2mg，加入20μl滅菌ddH₂O。

③震蕩混勻，快速渦旋5秒，取1μl上清作為模板。

(3)直接PCR反應(yīng)：

①PCR反應(yīng)體系為20μl，取處理后的樣品上清1μl，加入PCR擴(kuò)增試劑19μl，充分混勻，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

②PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8℃30s；然后35個(gè)循環(huán)：98℃5s，55℃5s，72℃5s；最后72℃1min；

(4)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物直接加到含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入DNA Marker(2000bp)對(duì)照,電壓為100V，電泳20min，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，如果樣品能擴(kuò)增出1390bp條帶，說(shuō)明樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。陽(yáng)性對(duì)照也擴(kuò)增出1390bp條帶，陰性對(duì)照沒(méi)有條帶。將陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，序列見(jiàn)序列表，通過(guò)比對(duì)，與牛支原體HB0801-P180株(Genbank no.CP007591)同源性100％。

快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒的特異性

將已分離鑒定的豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、波氏桿菌、沙門氏菌培養(yǎng)，取單菌落溶于20μl ddH₂O，取1μl加入直接PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增，結(jié)果如圖2均未有擴(kuò)增條帶，只有含牛支原體的陽(yáng)性病料擴(kuò)增出特異性條帶，證實(shí)本實(shí)施例有較好的特異性。

直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒的靈敏性

采集的樣品處理后取1μl上清作為模板，依次10倍稀釋至10^-5，各取1μl作為直接PCR擴(kuò)增，確定其敏感性。如圖3，模板稀釋度為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4時(shí)，均能擴(kuò)增出清晰條帶，證明試劑盒檢測(cè)的敏感度為10^-4。

快速直接PCR檢測(cè)牛肺炎支原體的試劑盒的臨床應(yīng)用

從臨床發(fā)生典型癥狀的病牛采集鼻拭子57份，按照本試劑盒的方法處理，進(jìn)行直接PCR，電泳檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性32份，同時(shí)，提取樣品DNA，進(jìn)行常規(guī)PCR，陽(yáng)性32份，與直接PCR結(jié)果一，如圖4，證實(shí)本試劑盒與常規(guī)PCR符合率100％，適合臨床樣品的快速檢測(cè)。

除上述實(shí)施外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。

序列表

樣品擴(kuò)增序列：CCTTAGGCAGTTTCTTTATAAACCGACTTCGGGCATTACCAGCTCCCATGGTTTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACGTATTCACCGTAGCGTAGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGAAGTCGAGTTGCAGACTTCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTTTGAGGTTTGCTCCATGTCACCACTTCGCTTCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCCACTCGTAAGAGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCCGATTACTCGGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCAACTAAATGGTAGTAACTAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCAGGACTTAACCGAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCATCTGTCATTCTGTTAACCTCCACTATGTCTCCATAGCTTTGCAGAAGATGTCAAGAGTGGGTAAGGTTCTACGCGTAACATCAAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGATCCCCGTCAATTCCTTTAAGTTTTATTCTTGCGAACGTACTACTCAGGCGGATCATTTAATGCGTTAGCTGCGTCGATGAGTTCCCCATCAACTAATGATCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTCTCTCAGTGTCAGTGTATGCCCAGTTAGCTGCCTTCGCCATATTGATGTTCTTCCTTATATCTACGCATTTCACCGCTTCACAAGGAATTCCGCTAACCTCTACATAACTCTAGTCTGCCAGTATCCAACGCGTTTTGGGGTTGAGCCCCAAAATTTAACGCCAGACTTAACAAACAACCTACAGACGCTTTACGCCCAATAATTTCGGATAACGCTTGCAACCTATGTATTACCGCGGCTGCTGGCACATAGTTAGCCGTTGCTTTCTAATCAGGTACCGTCAAGGTAGCATCATTTCCTATGCTACTTTTTCTTCCCTAACCACAGCAGTTTACAACCCATAGGGCCTTCATCCTGCACGCTGTGTCGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAATATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCAATCTCTCAACCCCGCTAAACATCATCGCCTTGGTGGGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGTTGCGCACTCCGATCTTTTAGCGAAGCAAACGCTTCCTTTTATATTACTTTCATGCAAAAATAATAAGTATTCGGTATTATCGGATGTTTCCATCCGCTATCCCAATCTAAAAGGTACGTTGAGTACGTGTTACTCACCCATTCGCCGCTATGATATTGCTATCATCGCTCGACATGCATG

引物序列：PF:5’-CCTTAGGCAGTTTCTTTATAA-3’

PR: 5’-CATGCATGTCGAGCGATGAT-3’