本發(fā)明屬分子病理診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于準(zhǔn)確定性檢測(cè)與肺癌相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變的引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌癥死因的第一名，1995年全世界有60萬(wàn)人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的死亡率是110萬(wàn)/年，發(fā)病率是120萬(wàn)/年，肺癌中75％～80％為非小細(xì)胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化療等治療手段不僅降低了生存質(zhì)量，且療效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼Gefitinib)是目前臨床使用最為成功的晚期肺癌靶向治療藥物，為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase inhibitors，TKI)，臨床試驗(yàn)證實(shí)對(duì)東方人(亞洲人為主)、女性、非吸煙者、肺泡細(xì)胞癌或腺癌患者的療效較好。進(jìn)一步的研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因上攜帶20外顯子上T790M突變型患者則對(duì)易瑞沙耐受，而對(duì)AZD9291靶向藥物敏感。

目前，測(cè)序方法仍然是檢測(cè)核酸序列突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法對(duì)于所取樣本中的腫瘤細(xì)胞的比例要求較高，一般大于50％，并且突變率低于20％的核苷酸突變，不能有效檢測(cè)和判讀，因此會(huì)造成假陰性。相比于測(cè)序技術(shù)，其它分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如熒光定量PCR，高效液相色譜技術(shù)等，存在結(jié)果不能準(zhǔn)確定量等問(wèn)題，因此會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性。

Pyrosequencing(焦磷酸測(cè)序)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，被廣泛用于基因型分析領(lǐng)域。該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須特殊的熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。相比傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)方法，降低了樣本取材的要求(只需較少的腫瘤組織，低腫瘤細(xì)胞含量仍可檢測(cè))，具有更高的靈敏度，可定量檢測(cè)低至1-5％的突變，準(zhǔn)確性高，更適合于高通量分析，結(jié)果直觀，判讀更加簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速，具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。但是針對(duì)臨床上一些特殊標(biāo)本，如血漿、胸腹水等來(lái)源的標(biāo)本，5％的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變?cè)噭┖?，以解決現(xiàn)有技術(shù)中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率低的缺點(diǎn)。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的如下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體基因T790M低頻突變的引物，包括：

SEQ ID NO：1～2所示的擴(kuò)增引物、SEQ ID NO：3所示的測(cè)序引物、SEQ ID NO：4所示的擴(kuò)增阻滯引物，所述擴(kuò)增阻滯引物的5’末端最后兩個(gè)堿基與擴(kuò)增引物的上游引物3’末端前兩個(gè)堿基序列相同；

其中，SEQ ID NO：2其5’端標(biāo)記生物素；SEQ ID NO：4其3’端磷酸化處理；以上核酸序列在一次檢測(cè)中共同使用。

其中，所述擴(kuò)增阻滯引物的序列如SEQ ID NO：4所示。

本發(fā)明中，通過(guò)引入擴(kuò)增阻滯引物，降低了野生型序列的擴(kuò)增，相對(duì)增加了突變基因型的擴(kuò)增，結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)大大提高了檢出靈敏度。相比于現(xiàn)在臨床上普遍采用的ARMS檢測(cè)EGFR T790M的方法(1％靈敏度)，檢測(cè)靈敏度提高至0.1％，提高了臨床標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率，可以為更多的患者提供了準(zhǔn)確的用藥參考。

一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體基因T790M低頻突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1～4所示的引物以及如下試劑：

(1)DNA提取試劑；

(2)生物素標(biāo)記親和磁珠；

(2)反應(yīng)液：PCR緩沖液，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μL Taq DNA聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測(cè)序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

其中，所述PCR緩沖液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明膠，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)吐溫-20，0.06M pH8.9Tricine。

其中，所述的緩沖液包括：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)吐溫-20。

其中，所述的退火緩沖液包括：20mM pH 7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽，2mM醋酸鎂。

一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變的方法，包括如下步驟：

(1)提取石蠟活檢標(biāo)本組織中的基因組DNA；

(2)以步驟(1)中所得DNA為模板，PCR擴(kuò)增EGFR T790M位點(diǎn)核酸序列片段；

(3)將步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合進(jìn)行單鏈純化；

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；

(5)測(cè)序得到SNP突變頻率。

上述檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變的方法，步驟(2)中，

PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO.：4 5uL，Template DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL；

PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min；50個(gè)循環(huán)，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃終止反應(yīng)。

有益效果：本發(fā)明的一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變檢測(cè)方法和試劑盒，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)突變?cè)撐稽c(diǎn)的突變，可用于臨床啟動(dòng)EGFR-TKI用于治療非小細(xì)胞肺癌前的靶標(biāo)位點(diǎn)EGFR T790M突變檢測(cè)，篩選藥物敏感和耐藥的患者。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，敏感性高，降低了樣本取材要求，結(jié)果易于判讀，大大降低了檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性或者假陰性率，為患者避免無(wú)效有害的治療，節(jié)省寶貴的治療時(shí)間。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)EGFR基因型序列分析，設(shè)計(jì)了特異的生物素標(biāo)記引物，利用PCR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)與肺癌相關(guān)的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因T790M低頻突變。該方法可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)低至0.1％的EGFR T790M突變。其重要意義在于：(1)指導(dǎo)肺癌患者有針對(duì)性用藥，避免無(wú)效用藥；(2)改善預(yù)后；(3)避免獲得耐藥；(4)降低對(duì)樣本組織的取材要求；(5)減少醫(yī)療費(fèi)用。

附圖說(shuō)明

圖示1為突變頻率為20％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后突變頻率變?yōu)?2.5％。

圖示2為突變頻率為2％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后突變頻率變?yōu)?0.1％。

圖示3為突變頻率為0.2％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后，突變頻率變?yōu)?.5％。

圖示4為一例石蠟組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：試劑。

(1)DNA提取試劑：

購(gòu)自QIAGEN公司。

(2)反應(yīng)液：

PCR Buffer：購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；

引物SEQ ID NO：1～4，由上海英俊生物科技有限公司合成；

MgCl₂：購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；

0.2mM dNTPs：購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；

2U/μL Taq DNA聚合酶：購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。

(3)單鏈純化試劑：

75％(v/v)乙醇溶液：購(gòu)于杭州長(zhǎng)征化學(xué)試劑有限公司；

0.2M NaOH：購(gòu)于上海試四赫維化工有限公司；

10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，無(wú)水乙酸購(gòu)于杭州化學(xué)試劑有限公司；

結(jié)合緩沖液：由10mM Tris-HCl(Tris-base購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，鹽酸購(gòu)于杭州化學(xué)試劑有限公司),2M NaCl(購(gòu)于上海試四赫維化工有限公司)，1mM EDTA(購(gòu)于杭州化學(xué)試劑有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)組成；

退火緩沖液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，無(wú)水乙酸購(gòu)于杭州化學(xué)試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購(gòu)于上海試四赫維化工有限公司)組成；

親和素標(biāo)記的磁珠(購(gòu)于GE healthcare Bioscience AB)。

(4)測(cè)序試劑：

DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶：購(gòu)于QIAGEN公司；

底物APS和熒光素：購(gòu)于QIAGEN公司；

四種dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：購(gòu)于QIAGEN公司。

實(shí)施例2：檢測(cè)方法。

儀器：Bio-Rad S1000PCR儀，Beckman Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)，北京六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統(tǒng)，QIAGEN PyroMark Q96ID測(cè)序儀。

(1)提取石蠟標(biāo)本組織DNA，具體步驟如下：將石蠟標(biāo)本置于二甲苯中，去除石蠟；加入裂解緩沖液和蛋白酶K，在變性條件下消化組織，裂解細(xì)胞；置于90℃孵育，逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)；將裂解液通過(guò)硅膠膜使DNA吸附到硅膠膜上，加入漂洗液洗滌雜質(zhì)，最后將高純、濃縮的DNA從硅膠膜上洗脫，得到基因組DNA收集液。

(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用EGFR特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

其中，所述的PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO：4 5uL，Template DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl₂，Taq DNA聚合酶2U，加無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL；PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min；50個(gè)循環(huán)，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃終止反應(yīng)。

(3)將步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合進(jìn)行單鏈純化：

(a)在使用前，保證所有溶液都達(dá)到室溫；

(b)在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：3測(cè)序引物(10uM)1uL；

(c)使用Vertex混勻Sepharose beads,將需要使用的sepharoe beads總量(每樣本3μL)轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每個(gè)樣品約有50μL的體積，將混合物混勻；

(d)將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50μL反應(yīng)體積)中，每樣本50μL，將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合；

(e)在Vacuum prep workstation中，四個(gè)樣品板中依次加入180mL高純水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；

(f)打開(kāi)vacuum prep workstation的泵，將vacuum prep tool在高純水中清洗30秒,然后將vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，將vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸頭放在相應(yīng)含有測(cè)序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵，將vacuum prep tool放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放sepharose beads；

(g)使用高純水清洗vacuum prep tool。

將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80℃2分鐘，再冷卻到室溫后放入測(cè)序儀中。

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；

(5)讀取測(cè)序結(jié)果。

標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果如圖1～3所示，圖示1為突變頻率為20％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后突變頻率變?yōu)?2.5％，圖示2為突變頻率為2％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后突變頻率變?yōu)?0.1％，圖示3為突變頻率為0.2％的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)本方法檢測(cè)后，突變頻率變?yōu)?.5％。

將本發(fā)明方法用于1例臨床石蠟組織標(biāo)本的檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120> 一種檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體基因T790M低頻突變引物及其應(yīng)用

<130> SG20161208001

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游擴(kuò)增引物

<400> 1

ctcacctcca ccgtgcagc 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

gtctttgtgt tcccggacat agtc 24

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 測(cè)序引物

<400> 3

accgtgcagc tcatca 16

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 擴(kuò)增阻滯引物

<400> 4

gctcatcatg cagctcatgc c 21