專利名稱：快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測技術(shù)，具體涉及一種快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變的方法。利用該基因檢測方法不僅能夠快速檢測肺癌病人腫瘤組織DNA某些區(qū)域中的點(diǎn)突變，更重要的是可以預(yù)測治療非小細(xì)胞性肺癌新藥——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]對病人是否有療效，指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。
背景技術(shù)：
肺癌在中國是發(fā)病率最高的腫瘤，致病因素主要是吸煙。據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)有85％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸煙造成的。而其它可造成肺癌發(fā)病的因素還包括一些與工業(yè)致癌物的接觸，如石棉、砷、鈾、鎳、鉻酸鹽等以及室內(nèi)空氣被氡氣及福爾馬林(甲醛)污染等。
肺癌在組織學(xué)上分為4種類型鱗癌、腺癌、大細(xì)胞肺癌以及小細(xì)胞肺癌。這4種肺癌在臨床上也可簡單地歸納為非小細(xì)胞肺癌(前3種)和小細(xì)胞肺癌兩種。從目前的醫(yī)療水平看，純西醫(yī)治療效果總的來說，大約只有13％的肺癌病人(男性12％，女性16％)診斷后治療存活5年及5年以上，而非小細(xì)胞肺癌病人的5年生存率大約為15％。據(jù)統(tǒng)計(jì)在肺癌病人中，大約有75％是非小細(xì)胞肺癌。
根據(jù)現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究成果，表皮生長因子受體(EGFR)是一種受體酪氨酸激酶，表皮生長因子(EGF)與表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合導(dǎo)致受體自身磷酸化并激活其激酶活性，通過一系列由磷酸化傳導(dǎo)的信號傳遞，形成激活細(xì)胞生存和分化的機(jī)制。在多種癌癥包括非小細(xì)胞肺癌中，表皮生長因子受體(EGFR)及其它一些蛋白激酶異常活化或過高表達(dá)是這種機(jī)制的典型特征。
藥物化療法是目前治療非小細(xì)胞肺癌的有效方法，但也只能延長病人的壽命，并不能根治，而且伴隨著嚴(yán)重的副反應(yīng)。吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]是美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的治療對其它化療不敏感非小細(xì)胞肺癌病人的新藥。它是一種小分子化合物，其作用是特異性地結(jié)合在表皮生長因子受體(EGFR)的ATP結(jié)合區(qū)，并阻斷表皮生長因子受體(EFGR)的激酶活性。不過在臨床治療中，大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者對吉非替林(Gefitinib)并不敏感。為此，哈佛醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的兩個(gè)研究小組通過研究，最近同時(shí)發(fā)現(xiàn)在幾乎所有對吉非替林治療有反應(yīng)的病人的腫瘤組織中，表皮生長因子受體(EGFR)基因含有特定的基因突變。這些突變都發(fā)生在表皮生長因子受體(EGFR)的第18，19，21外顯子里(第18外顯子點(diǎn)突變；第19外顯子一段堿基缺失性刪除突變；第21外顯子點(diǎn)突變L858R；第21外顯子點(diǎn)突變L861Q)，對應(yīng)于蛋白的激酶活性區(qū)，特別是ATP結(jié)合部位，病人一般含有一個(gè)或多個(gè)突變。而在其他沒有反應(yīng)的病人腫瘤組織中該基因里則沒有這些突變。研究表明這些突變在腺癌組織中的發(fā)生率有21％，其它形式的非小細(xì)胞肺癌只有2％。而在日本，26％的非小細(xì)胞性肺癌病人中有此類突變，比美國病人突變率高。更為顯著的是，日本女性腺癌病人中有50％具以上表皮生長因子受體(EGFR)突變。可以推測中國非小細(xì)胞肺癌病人中的突變率將與日本人相似。
上述新發(fā)現(xiàn)可以改變吉非替林(Gefitinib)的使用方法，使該藥品的使用更加科學(xué)有效，即檢測該基因突變情況可以預(yù)測病人是否對肺癌新藥吉非替林(Gefitinib)有反應(yīng)。具體是利用基因檢測的方法檢測病人腫瘤組織DNA中這些區(qū)域中的突變可以預(yù)測吉非替林(Gefitinib)是否對病人有療效，真正做到對癥下藥。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種廣泛使用于基因檢測的方法。利用PCR擴(kuò)增上述表皮生長因子受體(EGFR)基因突變所在區(qū)片斷，然后用測序可檢查病人該基因是否有突變。但測序要分別測定表皮生長因子受體(EGFR)的第18，19，21三個(gè)外顯子片段，這種測定需要進(jìn)行三次，不僅費(fèi)時(shí)，而且成本較高；另外，測序需要測序儀，這種儀器非常昂貴，一般單位無力配備。因此，這種方法在臨床上難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對第18，21兩個(gè)外顯子片段，提供一種簡便、快速的檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變的方法，以指導(dǎo)醫(yī)生對非小細(xì)胞性肺癌病人的臨床用藥。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，包括下列步驟(1)、準(zhǔn)備DNA①、從人體肺部采集病變組織；②、從病變組織中獲取DNA；(2)、對DNA進(jìn)行擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的至少一組四引物進(jìn)行擴(kuò)增第18外顯子點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為①、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進(jìn)行PCR循環(huán)，將DNA量擴(kuò)增至凝膠電泳可觀察即可；(3)、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳；(4)、觀測結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來判斷對應(yīng)外顯子位置是否發(fā)生點(diǎn)突變以及突變類型，具體判斷方法如下①、如果觀察到某外顯子泳帶中出現(xiàn)三條DNA條帶時(shí)，則判定有雜合子突變；②、如果觀察到某外顯子泳帶中僅出現(xiàn)兩條DNA條帶時(shí)，則用較小條帶的大小與下列對應(yīng)組中特異性產(chǎn)物的理論值對比，根據(jù)接近程度來判斷是純合子突變或是正常特異性，三組特異性產(chǎn)物的理論值如下A、第18外顯子點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為
正常特異性產(chǎn)物大小198個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小270個(gè)堿基；非特異性產(chǎn)物大小420個(gè)堿基；B、第21外顯子L858R點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小118個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小178個(gè)堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個(gè)堿基；C、第21外顯子L861Q點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小100個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個(gè)堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個(gè)堿基。
上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下1、關(guān)于特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增是一種體外擴(kuò)增DNA片段的方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。采用這種方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中只要有一個(gè)拷貝待擴(kuò)增的DNA片段，在短時(shí)間內(nèi)就能擴(kuò)增出大量拷貝數(shù)的特異性DNA片段。該方法廣泛應(yīng)用于基因檢測。
PCR擴(kuò)增的基本原理是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，以DNA互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴(kuò)增DNA)一側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性雜交、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴(kuò)增的特異性DNA片段。一般反應(yīng)過程是1、將反應(yīng)體系加熱至90～95℃，模板雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板；2、降溫至37～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈的3’一側(cè)的互補(bǔ)序列雜交(復(fù)性)；3、升溫至70～75℃，耐熱性DNA聚合酶催化引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈。重復(fù)以上過程，就可以出現(xiàn)待擴(kuò)增的特異性DNA片段。由于上一次循環(huán)合成的兩條互補(bǔ)鏈均可作為下一次循環(huán)的模板DNA鏈，所以每循環(huán)一次，底物DNA的拷貝數(shù)增加一倍，因此PCR經(jīng)過n次循環(huán)后，待擴(kuò)增的特異性DNA片段基本上達(dá)到2n個(gè)拷貝數(shù)。
2、上述方案中，為了獲得更好的PCR擴(kuò)增效果，其PCR循環(huán)按以下條件進(jìn)行


以上PCR循環(huán)次數(shù)較好的范圍為25～45次。
3、上述方案中，凝膠電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
4、上述方案中，“L858R”表示第21外顯子中所發(fā)生的一個(gè)突變，其中，L為突變前的亮氨酸；858為氨基酸在蛋白鏈中的位置，即突變所發(fā)生的位置；R為突變后的精氨酸?！癓861Q”表示第21外顯子中所發(fā)生的另一個(gè)突變，其中，L為突變前的亮氨酸；861為氨基酸在蛋白鏈中的位置，即突變所發(fā)生的位置；Q為突變后的谷氨酸胺。
本發(fā)明原理是三組四引物是設(shè)計(jì)用來檢測第18外顯子、第21外顯子(L858R)和第21外顯子(L861Q)中的已知位點(diǎn)的DNA點(diǎn)突變的一種簡便方法。其中，內(nèi)源有義引物是正?；蛱禺愋缘?；內(nèi)源反義引物是突變體特異性的。而外源有義引物和外源反義引物，則位于突變位點(diǎn)的上下游距離不等的地方。當(dāng)基因含有突變時(shí)，內(nèi)源反義引物與外源有義引物之間的片段被擴(kuò)增出來。對正?；騺碚f，則內(nèi)源有義引物與外源反義引物之間的片段被擴(kuò)增出來。這兩種不同的片斷的大小不一樣。而外源有義和外源反義引物之間的DNA總是要被擴(kuò)增的，但不影響檢測判斷。此方法不需測序，只需要瓊脂糖水平電泳儀就足夠。不過，為了提高分辨率，建議使用聚丙烯酰胺凝膠電泳。因?yàn)槿擞?2對常染色體，表皮生長因子受體(EGFR)基因位有常染色體上，因此表皮生長因子受體(EGFR)基因有兩個(gè)拷貝(一個(gè)是父—染色體；一個(gè)是母—染色體)。以下結(jié)合


其工作原理和各種結(jié)果。
圖1表示的是純合子突變情況，即父—染色體和母—染色體這兩個(gè)拷貝的EGFR基因都有突變。產(chǎn)物1是以上兩個(gè)拷貝的外源有義與外源反義引物之間被擴(kuò)增出來的DNA片段(是以上兩個(gè)拷貝同時(shí)被擴(kuò)增的重合)，該片段是非特異性產(chǎn)物，它們總是要被擴(kuò)增出來的，但不影響檢測判斷。產(chǎn)物2是以上兩個(gè)拷貝的外源有義與內(nèi)源反義引物之間被擴(kuò)增出來的DNA片段(是以上兩個(gè)拷貝同時(shí)被擴(kuò)增的重合)，是突變特異性產(chǎn)物，說明父—染色體和母—染色體這兩個(gè)拷貝的EGFR基因都有突變，而以上兩個(gè)拷貝的內(nèi)源有義與外源反義引物之間沒有被擴(kuò)增出來，即沒有正常特異性產(chǎn)物，因此屬于純合子突變。
圖2表示的是雜合子突變情況，即父—染色體和母—染色體的兩個(gè)拷貝中有一個(gè)拷貝的EGFR基因有突變，而另一個(gè)正常。產(chǎn)物1與圖1中表示的完全相同，不重復(fù)描述。產(chǎn)物2是母—染色體拷貝中，外源有義與內(nèi)源反義引物之間被擴(kuò)增出來的DNA片段，是突變特異性產(chǎn)物，說明母—染色體拷貝的EGFR基因有突變。產(chǎn)物3是父—染色體拷貝中，內(nèi)源有義與外源反義引物之間被擴(kuò)增出來的DNA片段，是正常特異性產(chǎn)物，因此屬于雜合子突變。這里值得注意的是產(chǎn)物2與產(chǎn)物3的大小是不一樣的，這對將來判斷純合子突變和正常特異性具有意義(見發(fā)明內(nèi)容中的純合子突變或正常特異性判斷原則)。
圖3表示的是正常特異性，即父—染色體和母—染色體的兩個(gè)拷貝中的EGFR基因都沒有突變發(fā)生。產(chǎn)物1與圖1中表示的完全相同，不重復(fù)描述。產(chǎn)物2沒有，表示以上兩個(gè)拷貝的EGFR基因都沒有發(fā)生突變。產(chǎn)物3是以上兩個(gè)拷貝的內(nèi)源有義與外源反義引物之間被擴(kuò)增出來的DNA片段(是以上兩個(gè)拷貝同時(shí)被擴(kuò)增的重合)，是正常特異性產(chǎn)物，因此屬于正常特異性。
由以上原理可知，針對每個(gè)點(diǎn)突變本發(fā)明運(yùn)用一組特殊設(shè)計(jì)的四種引物，利用PCR擴(kuò)增后，通過凝膠電泳可直接觀察到產(chǎn)物的三種情況之一，這三種情況分別對應(yīng)純合子突變、雜合子突變和正常特異性，因此可以通過產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷EGRF基因是否有點(diǎn)突變發(fā)生和突變的類型。對于每種情況，除了外源有義與外源反義引物之間的DNA總是要被擴(kuò)增而外，每個(gè)拷貝只可能出現(xiàn)兩種可能，一種是外源有義與內(nèi)源反義引物之間的片段被擴(kuò)增出來，表示對應(yīng)的拷貝中含有突變，另一種是內(nèi)源有義與外源反義引物之間的片段被擴(kuò)增出來，表示對應(yīng)的拷貝屬于正常基因。上述三種情況是由父—染色體和母—染色體兩個(gè)拷貝在四引物作用下組合產(chǎn)生的，當(dāng)通過凝膠電泳觀察到三條DNA條帶時(shí)，根據(jù)圖2所示，可以判定有雜合子突變；當(dāng)觀察到兩條DNA條帶時(shí)，則要根據(jù)較小條帶的大小來判斷是純合子突變或是正常特異性。
已知肺癌EGFR基因突變包括外顯子18中的點(diǎn)突變，外顯子19中的在同一狹小區(qū)域的7種刪除突變(deletion)(從9bp到24bp)，外顯子21中的兩種點(diǎn)突變。應(yīng)用以上PCR四引物突變檢測方法可以檢測出外顯子18，21中是否有已知的點(diǎn)突變。由于有以上點(diǎn)突變和刪除突變的非小細(xì)胞性肺癌病人對吉非替林(Gefitinib)藥物均有反應(yīng)，因此本發(fā)明的應(yīng)用可以預(yù)測治療非小細(xì)胞性肺癌新藥——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]對病人是否有療效，指導(dǎo)臨床用藥，所以具有積極意義。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明應(yīng)用特殊設(shè)計(jì)的引物，利用該基因檢測方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷病人有無與吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]療效有關(guān)的EGRF基因點(diǎn)突變，及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。
2、本發(fā)明簡單，不需測序。
3、本發(fā)明便宜，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室就可操作。
4、本發(fā)明靈敏度高，可以檢測到測序漏診的病例。

附圖1為純合子突變示意圖；附圖2為雜合子突變示意圖；附圖3為正常特異性示意圖；附圖4為外顯子21(L858R)突變檢查測序圖譜，其中，上半部為病人DNA測序圖譜，下半部為正常DNA測序?qū)φ請D譜；附圖5本發(fā)明實(shí)施例凝膠電泳圖片；附圖6為外顯子21(L861Q)突變檢查測序圖譜，其中，上半部為病人DNA測序圖譜，下半部為正常DNA測序?qū)φ請D譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一種快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，包括下列步驟第一步、腫瘤組織基因組DNA樣品準(zhǔn)備第一種新鮮組織或福爾馬林處理后組織試劑準(zhǔn)備緩沖溶液50mM Tris-HCl，pH8.020mM NaCl1mM EDTA1％ SDS10mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)10mg Proteinase K溶于1mlddH2O。分裝，-20℃保存。使用時(shí)，在4℃融化。(最好是現(xiàn)配現(xiàn)用)。
(1)、取微量組織(≤米粒的1/4)，加入20uL上述溶液中(可冷凍保存)，在加入1uL 10mg/ml蛋白酶K。
(2)、在55℃溫育15分鐘，Vortex，再溫育15分鐘。(可用PCR管在PCR機(jī)器上完成)。加雙蒸水至200uL。
(3)、加熱至95℃，保持10分鐘，使蛋白酶K失活，降溫至4℃或室溫。
(4)、取1uL作為DNA模板。用于以下PCR反應(yīng)。
第二種組織切片組織切片中含有石蠟。與方法1相比，只多了除蠟這一步，具體如下取40um大小的切片加入100ul0.5％Tween-20，加熱至90度并保持10分鐘，冷卻至55度。
第二步、對DNA進(jìn)行擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的后兩組四引物進(jìn)行擴(kuò)增第18外顯子點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為1、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見下表


2、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進(jìn)行PCR循環(huán)，將DNA量擴(kuò)增至凝膠電泳可觀察即可。PCR循環(huán)條件見下表

第三步、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳，可采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
第四步、觀測結(jié)果圖5為2％瓊脂糖電泳圖片，如采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，分辨率會更高。圖5中，M泳帶為標(biāo)準(zhǔn)DNA大小值對照，第5泳帶為外顯子21(L858R)的結(jié)果，第6泳帶為外顯子21(L861Q)結(jié)果，注意所有泳帶中，條帶的大小，自上而下，由大變小。
而理論上，外顯子21(L858R)的大小分別為正常特異性產(chǎn)物大小為118個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小為178個(gè)堿基；非特異性產(chǎn)物大小為248個(gè)堿基。
外顯子21(L861Q)的大小分別為正常特異性產(chǎn)物大小100個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個(gè)堿基；非特異性產(chǎn)物大小248個(gè)堿基。
從圖片中可以看出，在第5泳帶中，自上而下可以很清楚地看到非特異性產(chǎn)物、突變特異性產(chǎn)物和正常特異性產(chǎn)物三條DNA條帶，則判定外顯子21(L858R)泳帶所對應(yīng)EGFR基因的DNA片段有雜合子突變。而在第6泳帶中，自上而下可以很清楚地看到兩條DNA條帶，其中，除了上方的非特異性產(chǎn)物條帶外，下方的較小條帶大小值與正常特異性產(chǎn)物的理論大小接近，由此可以判定外顯子21(L861Q)泳帶所對應(yīng)EGFR基因的DNA片段屬于正常特異性產(chǎn)物，沒有發(fā)生突變。
比較例參見圖4和圖6，通過測序檢查，此病人含有外顯子21(L858R)突變，但沒有L861Q突變。以上結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，結(jié)果表明此病人是雜合子突變。
值得說明的是，在圖4中的突變圖譜并不明顯，通常情況下，突變峰(黑)與正常峰(紅)應(yīng)該相同高度。這種情況是由于腫瘤標(biāo)本中混入了正常組織。經(jīng)克隆方法證實(shí)此病人確有該突變。在這種情況下，四引物法可以很清楚地檢測出突變。這也說明采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測的正確性。
應(yīng)用檢測EGFR基因中的已知點(diǎn)突變方法，與檢測刪除突變的PCR方法相結(jié)合，可以同時(shí)檢測已知?jiǎng)h除突變和點(diǎn)突變。因?yàn)檫@些突變的有無，可以預(yù)測抗非小細(xì)胞肺癌新藥，吉非替林或易瑞沙，對病人的療效，所以此方法可以發(fā)展為試劑盒應(yīng)用于臨床檢測，造福病人。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，其特征在于包括下列步驟(1)、準(zhǔn)備DNA①、從人體肺部采集病變組織；②、從病變組織中獲取DNA；(2)、對DNA進(jìn)行擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，采用下列三組對應(yīng)外顯子DNA片段的至少一組四引物進(jìn)行擴(kuò)增第18外顯子點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；內(nèi)源反義GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有義GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反義CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外顯子L858R點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；內(nèi)源反義CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有義CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外顯子L861Q點(diǎn)突變DNA片段的四引物為內(nèi)源有義GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；內(nèi)源反義TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有義CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反義CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具體步驟為①、將上述每組四引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對各反應(yīng)體系重復(fù)進(jìn)行PCR循環(huán)，將DNA量擴(kuò)增至凝膠電泳可觀察即可；(3)、凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳；(4)、觀測結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來判斷對應(yīng)外顯子位置是否發(fā)生點(diǎn)突變以及突變類型，具體判斷方法如下①、如果觀察到某外顯子泳帶中出現(xiàn)三條DNA條帶時(shí)，則判定有雜合子突變；②、如果觀察到某外顯子泳帶中僅出現(xiàn)兩條DNA條帶時(shí)，則用較小條帶的大小與下列對應(yīng)組中特異性產(chǎn)物的理論值對比，根據(jù)接近程度來判斷是純合子突變或是正常特異性，三組特異性產(chǎn)物的理論值如下A、第18外顯子點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小198個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小270個(gè)堿基；B、第21外顯子L858R點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小118個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小178個(gè)堿基；C、第21外顯子L861Q點(diǎn)突變DNA片段的特異性產(chǎn)物理論值為正常特異性產(chǎn)物大小100個(gè)堿基；突變特異性產(chǎn)物大小192個(gè)堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，其特征在于上述PCR循環(huán)為
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，其特征在于所述循環(huán)次數(shù)為35次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，其特征在于上述凝膠電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
一種快速檢測非小細(xì)胞性肺癌表皮生長因子受體基因點(diǎn)突變方法，其特征在于包括下列步驟(1)準(zhǔn)備DNA；(2)利用PCR方法采用三組特殊設(shè)計(jì)的四引物對DNA進(jìn)行擴(kuò)增；(3)凝膠電泳；(4)觀測結(jié)果。本發(fā)明應(yīng)用特殊設(shè)計(jì)的引物，利用該基因檢測方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物的數(shù)量和大小來判斷病人有無與吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]療效有關(guān)的EGRF基因點(diǎn)突變，及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥，真正做到對癥下藥。本發(fā)明的特點(diǎn)是1.簡單，不需測序；便宜，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室就可操作；3.靈敏度高，可以檢測到測序漏診的病例。
文檔編號C12Q1/68GK1661107SQ20041010322
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者王進(jìn), 朱輝, 秦正紅 申請人:王進(jìn), 朱輝, 秦正紅