專利名稱：重組 d－氨基酸氧化酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是，涉及新的D-氨基酸氧化酶的制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供的二枚高酶活的重組D-氨基酸氧化酶，可用于將頭孢菌素C(cephalosporin C)轉(zhuǎn)化成戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid)。
背景技術(shù)：
半合成頭孢菌素的母核7-氨基頭孢霉烷酸(7-aminocephalosporanicacid)可由化學(xué)法裂解頭孢菌素C而成。但化學(xué)法使用大量有毒化學(xué)試劑，污染環(huán)境，且反應(yīng)步驟繁復(fù)，得率較低。近年來(lái)，酶法成為制備7-氨基頭孢霉烷酸的另一主要工藝。酶法轉(zhuǎn)化頭孢菌素C包括兩個(gè)步驟(1)D-氨基酸氧化酶氧化頭孢菌素C(cephalosporin C)生成戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid)；(2)戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸?；杆馕於?7-氨基頭孢霉烷酸產(chǎn)生7-氨基頭孢霉烷酸。目前，工業(yè)上采用的D-氨基酸氧化酶主要來(lái)自紅冬孢酵母(Rhodotorula gracilis)或三角酵母(Trigonopsis variabilis)。但是該兩種酶催化頭孢菌素C的比活均較低(Simonetta，et al.，Biochimica et Biophysica Acta，914136-142(1987)；U.S.Pat.No.5,453,374；U.S.Pat.No.5,208,155)。因而，在現(xiàn)有技術(shù)中，仍然存在對(duì)高催化活性的D-氨基酸氧化酶的需求，可從而降低酶法制備7-氨基頭孢霉烷酸的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供具有高催化頭孢菌素C活力的重組D-氨基酸氧化酶。本發(fā)明的目的還在于提供使用本發(fā)明的高催化活性重組D-氨基酸氧化酶生產(chǎn)戊二酰-7-氨基頭孢霉烷酸。
本發(fā)明將三角酵母(Trigonopsis vanabilis)FA10的D-氨基酸氧化酶基因(Li，W.et al.，Acta Microbiologica Sinica31251-253，1991)克隆至適當(dāng)?shù)妮d體上，采用定點(diǎn)突變方法進(jìn)行基因改進(jìn)。具體而言，對(duì)第53位氨基酸的編碼核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而獲得高催化活性的重組D-氨基酸氧化酶。
一方面，本發(fā)明提供一種編碼重組D-氨基酸氧化酶的DNA序列，其特征在于所述重組D-氨基酸氧化酶的基因與序列表中的序列1相比，在編碼第53位氨基酸的核苷酸密碼子中存在導(dǎo)致其編碼的蘇氨酸被其它氨基酸取代的至少一個(gè)核苷酸的差異，且其編碼蛋白質(zhì)所具有的D-氨基酸氧化酶催化頭孢菌素C的活力比具有序列2所示氨基酸序列的親本D-氨基酸氧化酶所具有的催化頭孢菌素C的活力至少高出25％，優(yōu)選高出35％，更優(yōu)選高出50％，最優(yōu)選高出100％。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的DNA序列含有編碼序列表中序列4或6所示氨基酸序列的核苷酸序列，更優(yōu)選該DNA序列包含序列3或5所示的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供一種多肽，其特征在于以序列表中的序列2為參考序列，對(duì)應(yīng)于序列2中第53位蘇氨酸的氨基酸被其它氨基酸替代，且其所具有的D-氨基酸氧化酶催化頭孢菌素C的活力比具有序列2所示氨基酸序列的親本D-氨基酸氧化酶所具有的D-氨基酸氧化酶催化活力至少高出25％，優(yōu)選高出35％，更優(yōu)選高出50％，最優(yōu)選高出100％。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽，其特征在于，以序列表中的序列2為參考序列，對(duì)應(yīng)于序列2中第53位蘇氨酸的氨基酸為絲氨酸或脯氨酸。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體舉出了兩個(gè)新的重組D-氨基酸氧化酶，重組D-氨基酸氧化酶GHA和重組D-氨基酸氧化酶GHB。重組D-氨基酸氧化酶GHA具有序列4所示的氨基酸序列，其催化頭孢菌素C的比活較親本的高105％；重組D-氨基酸氧化酶GHB具有序列6所示的氨基酸序列，其催化頭孢菌素C的比活較親本的高35％。本發(fā)明中親本基因系指來(lái)自三角酵母(Trigonopsisvariabilis)FA10的D-氨基酸氧化酶基因(Li，W.et al.，Acta MicrobiologicaSinica31251-253，1991)，其核苷酸序列如序列1所示，氨基酸序列如序列2所示。
本發(fā)明的重組D-氨基酸氧化酶還包括，對(duì)GHA或GHB的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保守替代的形式，增加或減少一個(gè)或多個(gè)氨基酸的衍生物的形式。
本發(fā)明制備重組D-氨基酸氧化酶GHA或重組D-氨基酸氧化酶GHB的方法中，適用的載體包括但不限于原核表達(dá)載體pRSET-A和pET；包括但不限于真核表達(dá)載體pYD1和pYES2；包括但不限于克隆載體pGEM-T Easy、pUC18、pUC19和pBluescript-SK(+/-)。
本發(fā)明制備重組D-氨基酸氧化酶的方法中，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞。適用的原核微生物包括但不限于大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)和鏈霉菌(Streptomyces)；適用的真核微生物包括但不限于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、紅冬孢酵母、三角酵母、黑曲霉(Aspergillus niger)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。
本發(fā)明制備重組D-氨基酸氧化酶GHA和重組D-氨基酸氧化酶GHB的方法中，采用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法，所述重組D-氨基酸氧化酶可在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞內(nèi)或胞外表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)將上述本發(fā)明的DNA序列通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法導(dǎo)入適當(dāng)?shù)奈⑸锼拗骷?xì)胞例如大腸桿菌或酵母細(xì)胞中，進(jìn)行多肽的表達(dá)。
如果表達(dá)的重組D-氨基酸氧化酶是胞外酶，可以從細(xì)胞產(chǎn)物中通過(guò)常規(guī)技術(shù)如硫酸銨分離和丙酮沉淀等，獲得部分純化的重組D-氨基酸氧化酶，或通過(guò)常規(guī)純化技術(shù)如離子交換親和層析等從細(xì)胞產(chǎn)物中完全純化。因此，在使用時(shí)，本發(fā)明的重組D-氨基酸氧化酶可以是未經(jīng)提純的粗酶；也可以是部分純化的酶；也可以是純化的酶。
如果重組D-氨基酸氧化酶是胞內(nèi)酶，則可先將宿主細(xì)胞破碎，然后例如通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片，接著再通過(guò)分級(jí)分離，分離純化重組的D-氨基酸氧化酶。
此外，為了方便在工業(yè)上的各種應(yīng)用，可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⒈景l(fā)明的重組D-氨基酸氧化酶制成固相細(xì)胞。為制備所述的固相細(xì)胞，可以將含有本發(fā)明重組D-氨基酸氧化酶的轉(zhuǎn)化細(xì)胞按照本領(lǐng)域已知的方法與固相載體連接起來(lái)，制成包含所述D-氨基酸氧化酶的固相細(xì)胞。在本發(fā)明中，還可以用常規(guī)方法將未經(jīng)純化的粗酶、部分純化的酶或純化的重組D-氨基酸氧化酶本身固定在載體上?？赏ㄟ^(guò)將本發(fā)明的重組D-氨基酸氧化酶吸附到離子交換樹(shù)脂以制備固定化的固相酶。
此外，可根據(jù)例如Miyake Y.，Aki K.，Hashimoto S.，and Yamano T.(1965)Crystallization and some properties of D-Amino Acid OxidaseApoenzyme，Biochemica et Biophysica Acta，10586-99來(lái)制備結(jié)晶酶。很顯然，這些固相酶或結(jié)晶酶及其應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。


圖1質(zhì)粒pRSET-kan圖譜。
圖2質(zhì)粒pRSET-kan序列。
圖3重組D-氨基酸氧化酶GHA和重組D-氨基酸氧化酶GHB的SDS-PAGE電泳圖。1，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記BenchMarkTMPre-Stained ProteinLadder(Invitrogen)，單位是KDa；2，3和4分別是純化的親本三角酵母D-氨基酸氧化酶、重組D-氨基酸氧化酶GHA，以及重組D-氨基酸氧化酶GHB。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施實(shí)例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。
實(shí)例1 D-氨基酸氧化酶基因重組質(zhì)粒pRSET-A-DAO的構(gòu)建根據(jù)已知三角酵母D-氨基酸氧化酶基因5’和3’端序列(Gonzalez，F(xiàn).J.，Montes，J.，Martin，F(xiàn).，Lopez，M.C.，F(xiàn)erminan，E.，Catala n，J.，Galan，M.A.Dominguez，A.Molecular cloning of TvDAO1，a gene encoding a D-aminoacid oxidase from Trigonopsis variabilis and its expression inSaccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis.Yeast131399-1408；1997)設(shè)計(jì)引物如下5’-Ndel(引入Ndel酶切位點(diǎn))5’-TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGC-3’(序列7)3’-Bglll(引入BgIII酶切位點(diǎn))5’-TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAGAGC-3’(序列8)
以質(zhì)粒pJL(楊藴劉等，中國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者王駿, 葉康堅(jiān), 曾偉基, 呂旭新, 蕭游龍, 曾實(shí)現(xiàn), 游明翰 申請(qǐng)人:百瑞全球有限公司