專利名稱：生成合成膽固醇合成抑制劑莫那可林k的相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于分子生物與微生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，本發(fā)明是關(guān)于膽固醇合成抑制劑莫那可林K(monacolin K)生合成相關(guān)基因。
背景技術(shù)：
在中國(guó)，紅曲霉菌(Monascus)在食品的應(yīng)用上已有千年的歷史，更因其能產(chǎn)生多項(xiàng)生理活性物質(zhì)而日漸被重視。這些生理活性物質(zhì)主要為紅曲霉的二次代謝產(chǎn)物，包括降血壓物質(zhì)、抗腐敗菌物質(zhì)(例如monascidin)、防癌物質(zhì)、降血糖物質(zhì)、麥角固醇(ergosterol)、抗氧化物質(zhì)、長(zhǎng)鏈脂肪酸及膽固醇合成抑制劑(例如monacolin)。因此，紅曲霉成為近年來(lái)相當(dāng)被重視的機(jī)能性健康保健食品。
紅曲霉菌所產(chǎn)生的膽固醇抑制劑最早是由日本三共制藥公司自紅曲霉菌(Monascus rubber)的培養(yǎng)液中找到monacolin k。之后美國(guó)莫克(Merck)藥廠也從土曲霉菌(Aspergillus terreus)的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)同一種化合物，命名為洛伐他汀(音譯lovastatin)，此膽固醇合成抑制劑是作為一HMG-CoA還原酶抑制劑(HMG-CoAReductase Inhibitors)。Monacolin K屬于一聚縮酮類(polyketide)產(chǎn)物，其在結(jié)構(gòu)上與HMG-CoA具有相似性，所以在膽固醇合成的過(guò)程中，monacolin k會(huì)與HMG-CoA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制，使HMG-CoA還原酶無(wú)法進(jìn)一步催化HMG-CoA形成mevolonate，降低膽固醇的合成。
真菌所產(chǎn)生的聚縮酮類(polyketide)二次代謝產(chǎn)物會(huì)表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性，及其它各種在細(xì)菌中所沒(méi)有的特征(O’Hagan，1995)，這些特征也表現(xiàn)在形成聚縮酮類(polyketide)物質(zhì)的酶多樣性上。紅曲霉所產(chǎn)生的monacolin k亦為聚縮酮類的一種，根據(jù)其它對(duì)于真菌聚縮酮類的研究發(fā)現(xiàn)，聚縮酮類的組成是由多功能的聚縮酮類生合成酶(polyketide synthase，PKS)催化乙酰輔酶A(acetyl CoA)進(jìn)行縮合反應(yīng)(condensation)而形成各種不同的產(chǎn)物(Kennedy et al.，1999 and Abe et al.，2002)。經(jīng)由真菌聚縮酮類生合成酶(polyketide synthase，PKS)的研究，并通過(guò)配合組合生合成(combinatorial biosynthesis)方法，未來(lái)對(duì)于開(kāi)創(chuàng)新穎的聚縮酮類物質(zhì)(novel polyketide)將具有相當(dāng)大的潛力(McDaniel et al.，1999)，其所產(chǎn)生的新穎的聚縮酮類則可做為將來(lái)篩選有效藥物的另一種新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一實(shí)施型態(tài)為提供一種分離的DNA分子，包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與其雜交的核苷酸序列。該嚴(yán)苛條件可以參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)所附的文獻(xiàn)。
本發(fā)明的另一實(shí)施形態(tài)提供一種分離的DNA分子，其包括擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物組成的族群的聚核苷酸a)一mkA聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列，b)一mkB聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)3的核苷酸序列，c)一mkC聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)4的核苷酸序列，d)一mkD聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)5的核苷酸序列，e)一mkE聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)6的核苷酸序列，f)一mkF聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)7的核苷酸序列，g)一mkG聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)8的核苷酸序列，h)一mkH聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列，i)一mkI聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)10的核苷酸序列，以及j)一在嚴(yán)苛條件下可與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、或i)雜交的聚核苷酸。
本發(fā)明的又一實(shí)施形態(tài)是提供一種穿梭載體(shuttlevector)，其包括上述定義的分離的DNA分子。
上述定義的分離的DNA分子，其是a)。
上述定義的分離的DNA分子，其是b)。
上述定義的分離的DNA分子，其是c)。
上述定義的分離的DNA分子，其是d)。
上述定義的分離的DNA分子，其是e)。
上述定義的分離的DNA分子，其是f)。
上述定義的分離的DNA分子，其是g)。
上述定義的分離的DNA分子，其是h)。
上述定義的分離的DNA分子，其是i)。
上述定義的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮酰基合成酶(β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，及?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)，以及酰脂基還原酶(enoyl reductase)。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有二縮酮合成酶的活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有單加氧酶(monooxygenase)活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有氧化還原酶(oxidoreductase)活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有去氫酶(dehydrogenase)活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)酯酶(transesterase)活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有HMG-CoA還原酶活性。
上述的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
本發(fā)明的再一實(shí)施形態(tài)是提供一種分離的DNA分子，其包括一擇自以下組成的族群的聚核苷酸a)一mkA聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)19的核苷酸序列，b)一mkB聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)20的核苷酸序列，c)一mkC聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)21的核苷酸序列，d)一mkD聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)22的核苷酸序列，e)一mkE聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)23的核苷酸序列，f)一mkF聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列，g)一mkG聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)27的核苷酸序列，h)一mkH聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列，i)一mkI聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)26的核苷酸序列，以及j)一在嚴(yán)苛條件下可與a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、或i)雜交的聚核苷酸。
本發(fā)明的又一實(shí)施形態(tài)是提供一種表達(dá)載體，其包括上述定義的分離的DNA分子。
上述定義的分離的DNA分子，其是a)，且編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮酰基合成酶(β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，及?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)。
上述的DNA分子，其中該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是b)，且編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮酰基合成酶(β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，酰基攜帶蛋白(acyl carrier protein)，以及酰脂基還原酶(enoyl reductase)。
上述的DNA分子，其中該多肽具有二縮酮合成酶的活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是c)，且編碼一多肽，該多肽具有單加氧酶(monooxygenase)活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是d)，且編碼一多肽，該多肽具有氧化還原酶(oxidoreductase)活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是e)，且編碼一多肽，該多肽具有去氫酶(dehydrogenase)活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是f)，且編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)酯酶(transesterase)活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是g)，且編碼一多肽，該多肽具有HMG-CoA還原酶活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是h)，且編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
上述定義的分離的DNA分子，其是i)，且編碼一多肽，該多肽具有外排泵(efflux pump)活性。
此外，本發(fā)明的一實(shí)施形態(tài)提供一細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有一擇自以下組成的族群的聚核苷酸a)一mkA聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列，b)一mkB聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列，c)一mkC聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列，d)一mkD聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列，e)一mkE聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列，f)一mkF聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列，g)一mkG聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)8或27的核苷酸序列，h)一mkH聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列，i)一mkI聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)10或26的核苷酸序列，以及j)上述聚核苷酸的組合。
上述的細(xì)胞為細(xì)菌，酵母菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或絲狀真菌。
上述的細(xì)胞為紅曲霉菌屬。
上述的細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
上述的細(xì)胞為紅曲霉菌BCRC 38072。
尚且，本發(fā)明的一實(shí)施形態(tài)是提供一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)化有一擇自以下組成的族群的聚核苷酸a)一mkA聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列，b)一mkB聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列，c)一mkC聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列，d)一mkD聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列，e)一mkE聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列，f)一mkF聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列，g)一mkH聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列，以及h)上述聚核苷酸的組合，以及由上述細(xì)胞收集HMG-CoA還原酶抑制劑。
上述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
上述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是紅曲霉菌屬。
上述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
上述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是紅曲霉菌BCRC 38072。
上述的增加莫那可林K生成的方法，其中該聚核苷酸為g)。
再者，本發(fā)明的一實(shí)施形態(tài)是提供一種增加monacolin K生成的方法。上述方法包括培養(yǎng)一可增加monacolin K生成的細(xì)胞。該細(xì)胞是轉(zhuǎn)化有一擇自上述組成的族群的聚核苷酸，以及由上述細(xì)胞收集monacolin K。
另外，本發(fā)明的一實(shí)施形態(tài)是提供一種生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法。上述方法包括培養(yǎng)一可生成HMG-CoA還原酶抑制劑的細(xì)胞，上述細(xì)胞轉(zhuǎn)化有一聚核苷酸，以及由上述細(xì)胞收集HMG-CoA還原酶抑制劑。上述聚核苷酸包括a)一mkA聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列，b)一mkB聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列，c)一mkE聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列，以及d)一mkF聚核苷酸，包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列。于另一實(shí)施形態(tài)中，上述HMG-CoA還原酶抑制劑為monacolin K。
上述的方法中該HMG-CoA還原酶抑制劑為莫那可林K。
上述的方法中該細(xì)胞為細(xì)菌，酵母菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或絲狀真菌。
上述的方法中該細(xì)胞為紅曲霉菌屬。
上述的方法中該細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
上述的方法中該細(xì)胞為紅曲霉菌BCRC 38072。
上述的方法中該細(xì)胞更轉(zhuǎn)化有一擇自所組成的聚核苷酸a)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列；b)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列；c)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列；以及d)以上的組合。
而且，本發(fā)明的一實(shí)施形態(tài)又是提供一種分離的DNA分子，其包括一編碼擇自以下組成的族群的多肽的聚核苷酸a)一包括序列識(shí)別號(hào)11的氨基酸序列的多肽，b)一包括序列識(shí)別號(hào)12的氨基酸序列的多肽，c)一包括序列識(shí)別號(hào)13的氨基酸序列的多肽，d)一包括序列識(shí)別號(hào)14的氨基酸序列的多肽，e)一包括序列識(shí)別號(hào)15的氨基酸序列的多肽，f)一包括序列識(shí)別號(hào)16的氨基酸序列的多肽，g)一包括序列識(shí)別號(hào)28的氨基酸序列的多肽，h)一包括序列識(shí)別號(hào)17的氨基酸序列的多肽，i)一包括序列識(shí)別號(hào)18的氨基酸序列的多肽，以及j)一在嚴(yán)苛條件下可與編碼a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、或i)的聚核苷酸雜交的聚核苷酸。
上述的DNA分子中該多肽為a)，且具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?β-ketoacylsynthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，及?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)。
上述的DNA分子中該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
上述的DNA分子中該多肽為b)，且具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?β-ketoacylsynthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)，以及酰脂基還原酶(enoyl reductase)。
上述的DNA分子中該多肽為c)，且具有二縮酮合成酶的活性。
上述的DNA分子中該多肽為c)，且具有單加氧酶(monooxygenase)活性。
上述的DNA分子中該多肽為d)，且具有氧化還原酶(oxidoreductase)活性。
上述的DNA分子中該多肽為e)，且具有去氫酶(dehydrogenase)活性。
上述的DNA分子中該多肽為f)，且具有轉(zhuǎn)酯酶(transesterase)活性。
上述的DNA分子中該多肽為g)，且具有HMG-CoA還原酶活性。
上述的DNA分子中該多肽為h)，且具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
上述的DNA分子中該多肽為i)，且具有外排泵(efflux pump)活性。
一種表達(dá)載體，其包括如上述的分離的DNA分子。
本發(fā)明于紅曲霉中尋找到產(chǎn)生monacolin k的相關(guān)基因，并提供了增加monacolin k生成的方法，提高了生產(chǎn)效率。


圖1A至1G顯示紅曲霉菌與其它霉菌的聚縮酮合成酶，及大鼠脂肪酸功能部位的序列比對(duì)。圖1A顯示酮?；铣擅傅谋葘?duì)，圖1B顯示?；D(zhuǎn)移酶的比對(duì)，圖1C顯示脫水酶的比對(duì)，圖1D顯示甲基轉(zhuǎn)移酶的比對(duì)，圖1E顯示酰脂基還原酶的比對(duì)，圖1F顯示酮酰基還原酶的比對(duì)，圖1G顯示酰基攜帶蛋白的比對(duì)。
圖2顯示紅曲霉菌mk基因群在第3天的表達(dá)情形。
圖3A與3B分別顯示pPICZamkA與pPICZamkB的圖譜。
圖4顯示以VectorNTI分析MKH氨基酸序列與推定的Zn(II)Cys6二核功能區(qū)域。方框中的氨基酸序列代表Zn(II)Cys6二合功能區(qū)域，6個(gè)半胱胺酸標(biāo)示為灰色。
圖5顯示構(gòu)筑含有聚縮酮合成酶mkA基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)筑流程。設(shè)計(jì)一組寡核苷酸引物(p3與p4)，以RT-PCR方式增幅mkA基因的部分cDNA(6.5kb)。另設(shè)計(jì)p1與p2引物，以RT-PCR方式增幅mkA基因的部分cDNA(3.0kb)。
圖6顯示構(gòu)筑含有枯草桿菌的4’-磷酸泛酰巰乙胺轉(zhuǎn)移酶sfp基因的大腸桿菌表達(dá)載體的流程。
圖7顯示于大腸桿菌表達(dá)mkA與sfp基因的SDS-PAGE結(jié)果照片。第1欄代表含有對(duì)照組質(zhì)粒pCDF-1b與pET30的大腸桿菌的總蛋白質(zhì)，第2欄代表將表達(dá)載體pCDFsfp(含sfp基因)與pETmkA(含mkA基因)與加樣緩沖液(loading buffer)在滾水中煮過(guò)的混合物。蛋白質(zhì)是以膠體考馬斯藍(lán)染色。箭頭代表Sfp與MKA的位置。溶解的蛋白質(zhì)是以ProBondTM純化系統(tǒng)(Invitrogen)純化。第3欄代表將溶胞產(chǎn)物于3000×g離心60分鐘的沉淀物，以及第4欄代表以Ni-管柱純化的蛋白質(zhì)。
菌種保藏情況大腸桿菌EP1300pMPF 001、大腸桿菌EP1300pMPF 002、大腸桿菌DH5αpMS-acuF、大腸桿菌DH5αpMS-Hsp已于公元2003年12月5日被寄存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110-2209，USA)，寄存編號(hào)分別為PTA-5685、PTA-5686、PTA-5687、PTA-5688。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)Nicholson(2001)等人針對(duì)土曲霉菌(Aspergillusterreus)的洛伐他汀(lovastatin)生合成基因所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物(degenerate primers)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)出針對(duì)紅曲霉的專一性探針，利用菌落雜交(colony hybridization)方式，自紅曲霉BAC基因庫(kù)中篩選并定序及批注分析出包括有monacolin k生合成基因。利用RT-PCR得到兩個(gè)完整的PKS全長(zhǎng)cDNA，并將此cDNA選殖至表達(dá)質(zhì)粒中，以做為PKS的表達(dá)。
自從1980年代紅曲霉菌被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生膽固醇抑制劑后，紅曲霉菌在降血壓、血糖與膽固醇的功效上即備受矚目。紅曲霉菌除了可產(chǎn)生monacolin k之外，亦能從中分離出與monacolin k具有相同基本結(jié)構(gòu)的降膽固醇物質(zhì)，例如monacolin J，L，M，及X等(Endo et al.，1979，1985，1986 and Komagata et al.，1989)，monacolin J與L為形成monacolin k的前驅(qū)物。Monacolin k之所以可以抑制膽固醇的合成在于其結(jié)構(gòu)與HMG-CoA具有的相似性，因此monacolin k會(huì)與HMG-CoA還原酶進(jìn)行鍵結(jié)，使得HMG-CoA無(wú)法通過(guò)HMG-CoA還原酶的催化形成Mevolonate，降低膽固醇的合成。所以目前在市面上除了monacolin k之外，也有其它經(jīng)由生物轉(zhuǎn)換或化學(xué)修飾等方法而產(chǎn)生的膽固醇抑制劑，其在結(jié)構(gòu)上都具有HMG-CoA的相似性，例如普伐他汀(音譯Pravastatin)，辛伐他汀(音譯Simvastatin)，氟伐他汀(音譯Fluvastatin)與阿托伐他汀(音譯Atorvastatin)等。
本發(fā)明的目的是于紅曲霉中尋找產(chǎn)生monacolin k的相關(guān)基因。本發(fā)明所分析的標(biāo)的為紅曲霉菌Monascus sp.BCRC 38072，將之依照Hawksworth & Pitt(1983)的分類系統(tǒng)進(jìn)行觀察及鑒定，其型態(tài)特征如下宏觀特征CYA，25℃，7天。菌落直徑25-26mm，菌絲體開(kāi)始為白色，漸漸變成淡紅橘色，復(fù)轉(zhuǎn)為深紅橘色。
MEA，25℃，7天。菌落直徑48mm，亮紅橘色，復(fù)轉(zhuǎn)為鮮紅橘色。
G25N，25℃，7天。菌落直徑28-29mm，深紅橘色，中央為深黃橘色。
微觀特征分生粉孢子(aleuriocondia)通常為單生或成短鏈，為倒梨狀(obpyriform)至球狀(globose)，大小為10-13×8-10μm。其有性世代閉囊殼(Cleistothecia)為球狀(globose)，直徑37-72μm。子囊孢子(ascospore)為透明，橢圓形，大小為4.6-6.3(-6.6)×3.3-4.2μm。
根據(jù)以上觀察，BCRC 38072的特征分析如下形態(tài)特征BCRC 38072介于M.pilosus與M.ruber之間。
1.依據(jù)菌落顏色與生長(zhǎng)速度以及分生粉孢子的著生方式，BCRC 38072與M.pilosus較接近。
2.依據(jù)子囊孢子形態(tài)大小，BCRC 38072與M.ruber較接近。
序列分析BCRC 38072、M.pilosus與M.ruber的rDNAITS片段及β-微管蛋白(β-tubulin)基因部分序列100％相同。
綜合形態(tài)特征與序列分析BCRC 38072的學(xué)名暫定為Monascus pilosus K.Sato ex D Hawksw. & Pitt。
從Monascus sp.BCRC 38072分析得知酮合成酶(ketosynthase)保留區(qū)域的DNA序列，再設(shè)計(jì)長(zhǎng)度約226bp(序列識(shí)別號(hào)1)專一性高的探針，做為以后菌落印跡雜交、DNA印跡雜交與PCR反應(yīng)等，此探針也可做為其它紅曲霉的篩選。利用BLAST與VectorNTI進(jìn)行BAC DNA的完整序列的批注及預(yù)測(cè)。在此BAC序列中獲得9個(gè)與已知土曲霉菌(Aspergillus terreus)所產(chǎn)生洛伐他汀(lovastatin)的基因群具有很高相似度的基因，其相似度分別約達(dá)54％以上。此外亦發(fā)現(xiàn)monacolin k基因群與橘青霉菌(Penicillium citrinum)合成compactin(后也稱美伐他汀，mevastatin)的基因群也具有很高的相似度，達(dá)49％以上。相似度比較如下表1。
表1紅曲霉菌的mk基因群，土曲霉菌的lov基因群，以及橘青霉菌的mlc基因群的相似度比較表

這9個(gè)基因包括兩個(gè)聚縮酮合成酶(polyketide synthase)基因，其中的一為合成九縮酮(nonaketide)的基因，另一個(gè)為合成二縮酮(diketide)的基因，此外包括有一個(gè)單加氧酶(monooxygenase)基因、一個(gè)氧化還原酶(oxidoreductase)基因、一個(gè)去氫酶(dehydrogenase)基因、一個(gè)轉(zhuǎn)酯酶(transesterase)基因、一個(gè)HMG-CoA還原酶基因、一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因與一個(gè)外排泵(efflux pump)基因。本發(fā)明亦構(gòu)筑紅曲霉的fosmid基因庫(kù)，并從fosmid end序列比對(duì)分析，篩選出2個(gè)轉(zhuǎn)化株分別為pMPF001(包括mkB，mkD，mkE，mkF，mkG，mkH及mkI)與pMPF002(包括mkA，mkC，mkD，mkE，mkF，mkG，mkH及mkI)，寄存于財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，編號(hào)前者為BCRC 940470，后者為BCRC 940471。其中進(jìn)一步針對(duì)九縮酮(nonaketide)聚縮酮合成酶基因、二縮酮(diketide)聚縮酮合成酶與轉(zhuǎn)錄因子基因，分別就其功能性區(qū)域與各種已知曲菌(Aspergillus)，青霉菌(Penicillium)，葉斑菌(Cochliobolus)，赤霉菌(Gibberella)微生物的聚縮酮類生合成基因與大鼠的脂肪生合成基因(FAS)作比對(duì)，結(jié)果顯示上述三個(gè)基因的各功能性區(qū)域的氨基酸序列，與土曲霉菌(Aspergillusterreus)中合成洛伐他汀(lovastatin)以及橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)中合成compactin(后也稱美伐他汀，mevastatin)的各功能性區(qū)域的氨基酸序列具很高的相似性，請(qǐng)參見(jiàn)圖1。本發(fā)明并萃取紅曲霉總RNA進(jìn)行RNA印跡雜交(Northern blot)的分析，各基因在轉(zhuǎn)錄程度的表達(dá)情形可參見(jiàn)圖2。
本發(fā)明獲得的兩個(gè)聚縮酮類合成酶基因?yàn)槎喙δ艿拿竚kA基因具有β-酮?；铣擅?β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)及酰基攜帶蛋白(acyl carrier protein)等功能；mkB基因除了以上6個(gè)功能外，尚有酰脂基還原酶(enoyl reductase)的酶功能，參見(jiàn)圖1。本發(fā)明利用RT-PCR的方式獲得此兩個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA，并將此全長(zhǎng)cDNA選殖入巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的表達(dá)系統(tǒng)，以表達(dá)出聚縮酮類的產(chǎn)物。由于聚縮酮合成酶基因?qū)儆诙喙δ艿拿?，而本發(fā)明又獲得完整的全長(zhǎng)cDNA，因此可通過(guò)改組(shuffling)等技術(shù)進(jìn)行DNA的重組，進(jìn)而產(chǎn)生多樣性的聚縮酮類產(chǎn)物，此技術(shù)是做為篩選新藥物的另一新途徑。目前也有相關(guān)的專利發(fā)展出這樣的技術(shù)，例如美國(guó)專利第6221641號(hào)、第6391594號(hào)，但此都局限于細(xì)菌的表達(dá)，相較之下，真菌所產(chǎn)生的聚縮酮類二次代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)的多樣性及復(fù)雜性，因此利用本發(fā)明所得到的pPICZamkA(圖3A)與pPICZamkB(圖3B)可進(jìn)一步的進(jìn)行改組(shuffling)技術(shù)，以做為表達(dá)聚縮酮類多樣性的表達(dá)質(zhì)粒。
由此，本發(fā)明提供以下DNA分子、載體以及方法。
(I)用來(lái)篩選monacolin K生合成相關(guān)基因的探針本發(fā)明是有關(guān)一種可用來(lái)篩選monacolin K生合成相關(guān)基因的探針，其包括序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列。該探針是根據(jù)Nicoholson(2001)等人針對(duì)土曲霉菌(Aspergillus terreus)的洛伐他汀(lovastatin)生合成基因所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物(degenerateprimers)，進(jìn)一步針對(duì)紅曲霉菌BCRC 38072設(shè)計(jì)出來(lái)的專一性探針。熟悉此項(xiàng)技術(shù)人士應(yīng)可輕易地利用本發(fā)明的探針，經(jīng)由已知的技術(shù)，例如雜交反應(yīng)等，于其它有機(jī)體中分離和純化與monacolin K相似的基因序列。
(II)九縮酮(Nonaketide)聚縮酮合成酶(mkA基因體DNA)本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)2(mkA基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)2的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)2雜交，且編碼具有九縮酮(nonaketide)聚縮酮合成酶活性的核苷酸序列。該DNA分子是由紅曲霉菌BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等技術(shù)獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。高度嚴(yán)苛雜交條件請(qǐng)參考EP 1325959 A1 P7 節(jié)。九縮酮合成酶主要是催化1個(gè)乙酸(acetate)及8個(gè)丙二酸(malonate)形成九縮酮(nonaketide)，此基因具有多功能區(qū)域，包括β-酮?；铣擅?β-ketoacyl synthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)及?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)。在與其它物種進(jìn)行功能性區(qū)域的比對(duì)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)紅曲霉菌BCRC38072中mkA各功能區(qū)域的氨基酸序列與土曲霉菌(Aspergillusterreus)的lovB基因及橘青霉菌(Penicillium citrinum)的mlcA基因具有較高的相似度。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)2(mkA基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)2的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)2雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。較佳地，本發(fā)明使用的載體工具是為一表達(dá)載體。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步經(jīng)由改組(shuffling)技術(shù)，產(chǎn)生多樣性的聚縮酮類產(chǎn)物。有關(guān)改組技術(shù)可參考美國(guó)專利第6,221,641號(hào)及第6,391,594號(hào)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)2的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)2雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞與真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascuspilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)2(mkA基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)2的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)2雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)2(mkA基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)2的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)2雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(III)二縮酮合成酶(mkB基因體DNA)本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)3(mkB基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)3的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)3雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。該DNA分子是由紅曲霉菌BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。高度嚴(yán)苛雜交條件請(qǐng)參考EP 1325959 A1 P7 節(jié)。二縮酮合成酶主要是生合成monacolin k的二縮酮支鏈，即2-丁酸甲酯(2-methylbyutyrate)。此基因具有多功能區(qū)域，包括β-酮酰基合成酶(β-ketoacylsynthase)，乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl transferase)，脫水酶(dehydratase)，甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)，酮還原酶(ketoreductase)，?；鶖y帶蛋白(acyl carrier protein)，與酰脂基還原酶(enoyl reductase)。在與其它物種進(jìn)行功能性區(qū)域的比對(duì)亦發(fā)現(xiàn)紅曲霉菌BCRC 38072中mkB各功能區(qū)域與土曲霉菌(Aspergillus terreus)的lovF基因及橘青霉菌(Penicilliumcitrinum)的mlcB基因具有較高的相似度。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)3的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)3的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)3雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步利用改組(shuffling)技術(shù)，產(chǎn)生多樣性的聚縮酮。有關(guān)的改組技術(shù)可參考美國(guó)專利第6,221,641號(hào)及第6,391,594號(hào)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括序列識(shí)別號(hào)3的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)3的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)3雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌，特別是Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)3(mkB基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)3的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)3雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)3(mkB基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)3的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)3雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(IV)轉(zhuǎn)錄因子(mkH基因體DNA)本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)9(mkH基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。該DNA分子是由紅曲霉菌BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。高度嚴(yán)苛雜交條件請(qǐng)參考EP1325959 A1 P7 節(jié)。mkH基因經(jīng)由Vector NTI比對(duì)發(fā)現(xiàn)此基因?yàn)槎r(jià)鋅6半胱胺酸二核功能部位(Zn(II)Cys6 binuclearmotif)，其保守序列為Cys-X2-Cys-X6-Cys-X11-Cys-X2-Cys-X6-Cys(請(qǐng)參考圖4)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。較佳地，本發(fā)明使用的載體工具是為一表達(dá)載體。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括一序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascus pilosus，Monascusruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種表達(dá)系統(tǒng)，其包括一載體，上述載體包括一序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，以及一可表達(dá)上述核苷酸序列的宿主細(xì)胞，其中上述載體是經(jīng)由一轉(zhuǎn)化方法被轉(zhuǎn)化進(jìn)入上述宿主細(xì)胞中。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)9(mkH基因體DNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)9的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)9雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(V)HMG-CoA還原酶抑制劑及Monacolin K的生產(chǎn)本發(fā)明亦有關(guān)一種生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)2(mkA基因體DNA)、序列識(shí)別號(hào)3(mkB基因體DNA)、序列識(shí)別號(hào)6(mkE基因體DNA)及序列識(shí)別號(hào)7(mkF基因體DNA)的核苷酸序列，或者是在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與上述序列分別雜交，且分別編碼具有九縮酮合成酶、二縮酮合成酶、去氫酶與轉(zhuǎn)酯酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收monacolin K。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。根據(jù)Hutchinson(2000)及其團(tuán)隊(duì)針對(duì)洛伐他汀(lovastatin)生合成基因的研究推論，欲將洛伐他汀生合成基因于異源表達(dá)(heterologous expression)可能只需要九縮酮合成酶、二縮酮合成、去氫酶與轉(zhuǎn)酯酶四種基因。其中九縮酮合成酶與去氫酶共同表達(dá)產(chǎn)生洛伐他汀的前驅(qū)物，二縮酮合成酶則形成2-丁酸甲酯，轉(zhuǎn)酯酶則再進(jìn)一步的將2-丁酸甲酯鍵結(jié)于九縮酮形成完整的洛伐他汀。再者，上述HMG-CoA還原酶抑制劑為monacolin K。
于上述方法中，可更進(jìn)一步包括序列識(shí)別號(hào)4(mkC基因體DNA)、序列識(shí)別號(hào)5(mkD基因體DNA)、序列識(shí)別號(hào)8(mkG基因體DNA)、序列識(shí)別號(hào)9(mkH基因體DNA)及序列識(shí)別號(hào)10(mkI基因體DNA)的核苷酸序列，或者是在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與上述序列分別雜交，且分別編碼具有細(xì)胞色素P450單加氧酶、氧化還原酶、HMG-CoA還原酶、轉(zhuǎn)錄因子與外排泵活性的核苷酸序列。
(VI)九縮酮(Nonaketide)聚縮酮合成酶(mkA cDNA)
本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)19(mkA cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)19的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)19雜交，且編碼具有九縮酮(nonaketide)聚縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述DNA分子是由紅曲霉菌BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等技術(shù)獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。高度嚴(yán)苛雜交條件請(qǐng)參考EP 1325959 A1 P7 節(jié)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)19(mkA cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)19的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)19雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。較佳地，本發(fā)明使用的載體工具是為一表達(dá)載體，更佳地，本發(fā)明使用的載體工具是pPICZαA(Invitrogen)。本發(fā)明建構(gòu)完成的載體是pPICZamkA，其包括本發(fā)明的序列識(shí)別號(hào)19。pPICZamkA是依據(jù)Molecular Cloning中的分子操作方法，將完整mkA基因的全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)化至pPICZαA上而得。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步經(jīng)由改組(shuffling)技術(shù)，產(chǎn)生多樣性的聚縮酮類產(chǎn)物。有關(guān)改組技術(shù)可參考美國(guó)專利第6,221,641號(hào)及第6,391,594號(hào)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括序列識(shí)別號(hào)19，或與序列識(shí)別號(hào)19的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)19雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞與真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)19(mkA cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)19的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)19雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)19(mkA cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)19的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)19雜交，且編碼具有九縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(VII)二縮酮合成酶(mkB cDNA)本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)20(mkB cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)20的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)20雜交且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述DNA分子是由BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)20的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)20的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)20雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。較佳地，本發(fā)明使用的載體工具是為一表達(dá)載體。更佳地，本發(fā)明使用的載體工具是pPICZαC。本發(fā)明建構(gòu)完成的載體是pPICZamkB，其包括本發(fā)明的序列識(shí)別號(hào)20。pPICZamkB是根據(jù)Molecular Cloning中分子操作方法將完整mkB基因的全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)化至pPICZαC上而得。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步利用改組技術(shù)，產(chǎn)生多樣性的聚縮酮。有關(guān)改組技術(shù)可參考美國(guó)專利第6,221,641號(hào)及第6,391,594號(hào)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括一序列識(shí)別號(hào)20的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)20的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)20雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascuspilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)20(mkB cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)20的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)20雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)20(mkB cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)20的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)20雜交，且編碼具有二縮酮合成酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(VIII)轉(zhuǎn)錄因子(mkH cDNA)本發(fā)明有關(guān)一種分離的DNA分子，其包括序列識(shí)別號(hào)25(mkH cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。該DNA分子是由紅曲霉菌BCRC 38072分離而來(lái)。此外熟悉此項(xiàng)技藝人士亦可依據(jù)本發(fā)明所揭示的DNA分子，經(jīng)由已知的PCR、雜交等獲得本發(fā)明所請(qǐng)求的序列。高度嚴(yán)苛雜交條件請(qǐng)參考EP1325959 A1 P7 節(jié)。
本發(fā)明亦有關(guān)一種載體，其包括序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。用于建構(gòu)本發(fā)明載體的工具是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中可自行復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞的染色體的分子序列，其等諸如質(zhì)粒、噬菌體與病毒等。較佳地，本發(fā)明使用的載體工具是為一表達(dá)載體。更佳地，本發(fā)明使用的載體工具是pMS。本發(fā)明建構(gòu)完成的載體是pMSmkH，其包括本發(fā)明的序列識(shí)別號(hào)25。pMSmkH是根據(jù)Molecular Cloning中分子操作方法將mkH基因轉(zhuǎn)化至pMS上而得。
本發(fā)明亦有關(guān)一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其包括一載體，上述載體包括一序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列。上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種表達(dá)系統(tǒng)，其包括一載體，上述載體包括一序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，以及一可表達(dá)上述核苷酸序列的宿主細(xì)胞，其中上述載體是經(jīng)由一轉(zhuǎn)化方法被轉(zhuǎn)化進(jìn)入上述宿主細(xì)胞中。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascus pilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。轉(zhuǎn)化的方法可以采用已知的宿主-載體系統(tǒng)，對(duì)屬于曲菌屬(Aspergillus)的絲狀真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如歐洲專利第1325959 A1 P5號(hào) 節(jié)所述。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加monacolin K生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳地，上述細(xì)胞是指原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。
本發(fā)明亦有關(guān)一種增加HMG-CoA還原酶抑制劑生成的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)25(mkH cDNA)的核苷酸序列，或與序列識(shí)別號(hào)25的序列分享95％相似性的核苷酸序列，或在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與序列識(shí)別號(hào)25雜交，且編碼具有轉(zhuǎn)錄因子活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收HMG-CoA還原酶抑制劑。上述細(xì)胞可為原本就可產(chǎn)生monacolin K的細(xì)胞。其特別是真菌細(xì)胞，特別是紅曲霉菌屬(Monascus sp.)，特別是紅曲霉菌屬M(fèi)onascus pilosus，Monascus ruber，或Monascuspurpureus，更特別是BCRC 38072。
(IX)HMG-CoA還原酶抑制劑及Monacolin K的生產(chǎn)本發(fā)明亦有關(guān)一種生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其包括(a)將序列識(shí)別號(hào)19(mkA cDNA)、序列識(shí)別號(hào)20(mkBcDNA)、序列識(shí)別號(hào)23(mkE cDNA)及序列識(shí)別號(hào)24(mkFcDNA)的核苷酸序列，或者是在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與上述序列分別雜交，且分別編碼具有九縮酮合成酶、二縮酮合成酶、去氫酶與轉(zhuǎn)酯酶活性的核苷酸序列，轉(zhuǎn)化入一細(xì)胞中；(b)于允許該核苷酸序列表達(dá)的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(c)回收monacolin K。上述細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括，但不限于，細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞以及絲狀真菌，其特別是紅曲霉菌(Monascus sp.)，特別是Monascuspilosus，Monascus ruber，或Monascus purpureus，更特別是BCRC 38072。根據(jù)Hutchinson(2000)及其團(tuán)隊(duì)針對(duì)洛伐他汀(lovastatin)生合成基因的研究推論，欲將洛伐他汀生合成基因于異源表達(dá)(heterologous expression)可能只需要九縮酮合成酶、二縮酮合成酶、去氫酶與轉(zhuǎn)酯酶四種基因。其中九縮酮合成酶與去氫酶共同表達(dá)產(chǎn)生洛伐他汀的前驅(qū)物，二縮酮合成酶則形成2-丁酸甲酯，轉(zhuǎn)酯酶則再進(jìn)一步的將2-丁酸甲酯鍵結(jié)于九縮酮形成完整的洛伐他汀。再者，上述HMG-CoA還原酶抑制劑為monacolinK。
于上述方法中，可更進(jìn)一步包括序列識(shí)別號(hào)21(mkCcDNA)、序列識(shí)別號(hào)22(mkD cDNA)、序列識(shí)別號(hào)25(mkHcDNA)及序列識(shí)別號(hào)26(mkI cDNA)的核苷酸序列，或者是在高度嚴(yán)苛雜交條件下可與上述序列分別雜交，且分別編碼具有細(xì)胞色素P450單加氧酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)錄因子與外排泵活性的核苷酸序列。
以下將以具體實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1紅曲霉的培養(yǎng)將紅曲霉真菌接種于PDA(Potato Dextrose Agar)試管斜面，放置于30℃中培養(yǎng)。之后刮取菌絲及孢子，將其接種于50mL培養(yǎng)基(7％ glycerol，3％ glucose，3％ MSG，1.2％ polypetone，0.2％ NaNO3，0.1％ MgSO4·7H2O)中，以200rpm的轉(zhuǎn)速于25℃中培養(yǎng)。
實(shí)施例2紅曲霉BAC文庫(kù)的建構(gòu)A.紅曲霉細(xì)胞核的制備收集紅曲霉菌體，以滅過(guò)菌的去離子水沖洗，利用抽氣過(guò)濾抽干菌體。加入已預(yù)冷10倍菌體重的清洗緩沖液(wash bufferHB buffer+1.5％ β-mercaptoethanol)，放置攪拌器中將菌體打碎。利用Miracloth濾膜過(guò)濾可得紅曲霉細(xì)胞核的部分。
B.DNA填充物(DNA plugs)與染色體DNA片段的制備以HB緩沖液配制1.8％低熔解溫度的瓊脂糖(low meltingtemperature agarose)并置于50℃水浴中，以等體積的瓊脂糖溶液與細(xì)胞核溶液均勻混合后，快速加入填充模型(plug mold，Bio-Rad)中，以蛋白酶K(1mg/mL)去除雜質(zhì)。最后將填充物取出切成小碎片進(jìn)行Hind III的部份酶切割作用(partialdigestion)，將反應(yīng)完畢的填充物置于1％瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行脈沖式電泳分析。切取約200kb的DNA片段，利用電洗脫(electroelution)的方法進(jìn)行DNA回收。
C.紅曲霉基因庫(kù)的構(gòu)筑使用pIndigoBAC-5 HindIII Ready(Epicentre)，使載體與回收的DNA進(jìn)行接合反應(yīng)，之后再利用電轉(zhuǎn)化方式，將DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中(Epicentre，TransforMaxTM EC 100TMelectrocompetent E.coli)，待菌落長(zhǎng)出后，點(diǎn)選菌落于384微孔盤中做為保存。
實(shí)施例3核酸探針引物的設(shè)計(jì)及核酸探針制備利用下示的簡(jiǎn)并引物(degenerate primer)進(jìn)行PCR及定序反應(yīng)后，將所得DNA序列使用VectorNTI設(shè)計(jì)約226bp長(zhǎng)的引物(序列識(shí)別號(hào)1)，以做為核酸探針制備。
Mplov1 5’TCCACTGCCGTTTATGTTG 3’(序列識(shí)別號(hào)29)
Mplov2 5’TCGTCATCTTCACCCCATC 3’(序列識(shí)別號(hào)30)之后利用PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增一段序列上含有DIG-11-dUTP(Roche，PCR DIG Probe Synthesis Kit)的DNA，用此段DNA來(lái)做為核酸探針。
實(shí)施例4菌落雜交的分析與BAC DNA的抽取剪裁尼龍膜(nylon membrane，Roche)一角以標(biāo)示其方向，小心將尼龍膜置于含有菌落的平板上，以沾粘上的菌落朝上，將尼龍膜分別依順序置于裂解液(lysis solution2N NaOH，0.1％SDS)5分鐘，0.5M NaOH/1.5M NaCl溶液5分鐘，1.5MNaCI/0.5M Tris-HCl(pH7.4)5分鐘及2X SSC 5分鐘，之后使用紫外光固定DNA于尼龍膜上。所得的尼龍膜再進(jìn)行雜交反應(yīng)與免疫偵測(cè)(Roche)。將反應(yīng)所得的菌落利用Qiagen的Large-Construct Kit抽取大量的BAC DNA。
實(shí)施例5基因槍(Shotgun)方式的序列分析A.基因槍(Shotgun)基因庫(kù)的制備取3～5μg的BAC DNA，調(diào)整適當(dāng)?shù)某舨ㄕ鹚闂l件，將BAC DNA震碎至1～2kb，并以電泳分析確定。使用Bal31核(nuclease)及T4 DNA聚合酶進(jìn)行DNA鈍端(blunt end)的修復(fù)，所得的DNA以電泳分析，并回收1～2kb的DNA片段，并進(jìn)行接合反應(yīng)(使用載體為pUC18/SmaI/CIAP(50ng/μL)(Pharmacia))并電轉(zhuǎn)至E.coli DH5α中。
B.DNA定序及分析利用96微孔盤進(jìn)行高速質(zhì)粒DNA(high throughput)的抽取，所得質(zhì)粒DNA以ABI Bigdye v3.0套組進(jìn)行定序反應(yīng)，并以ABI 3700定序儀進(jìn)行10倍覆蓋率的序列分析。
實(shí)施例6DNA序列的組裝(Assembly)與批注(annotation)根據(jù)Phil Green實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的Phred-Phrap-Consed系統(tǒng)進(jìn)行DNA序列的組裝，所得的BAC完整序列進(jìn)一步利用VectorNTI與BLAST進(jìn)行序列的批注分析。
實(shí)施例7紅曲霉總RNA的萃取與RT-PCR反應(yīng)收集約0.2g紅曲霉真菌的菌絲置于研缽中，利用液態(tài)氮迅速冷凍菌絲并將其磨成粉末狀。之后利用trizol試劑(Invitrogen)與氯仿進(jìn)行萃取。所得RNA溶于DEPC-H2O中。利用RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Promega，ImProm-IITM Reverse TranscriptionSystem)，得到的全長(zhǎng)cDNA再接合于TA載體(promega，pGEM-T vector system)保存。
實(shí)施例8RNA電泳分析與RNA印跡雜交(Northern blot)分析A.RNA電泳分析配置含有甲醛凝膠工作緩沖液(formaldehyde gel runningbuffer)與甲醛(formaldehyde)的1.2％瓊脂糖凝膠(agarose gel)。取出RNA與甲醛凝膠運(yùn)作緩沖液，甲醛(37％)，及甲酰胺均勻混合后，進(jìn)行RNA電泳并以EtBr染色。
B.RNA印跡切割與凝膠大小適當(dāng)?shù)哪猃埬?，并以剪刀剪下一角，以做為記?hào)，進(jìn)行RNA印跡。之后使用紫外光固定RNA于尼龍膜上，所得的尼龍膜再進(jìn)行雜交反應(yīng)與免疫偵測(cè)(Roche)。
實(shí)施例9核酸探針引物的設(shè)計(jì)及核酸探針制備根據(jù)BAC DNA序列設(shè)計(jì)引物，以做為制備RNA印跡雜交分析用的探針。以下所列引物是設(shè)計(jì)用于制備紅曲霉基因群分析所使用的探針mkA基因正向引物5’ATA GCT CCG AGA ATG GTC CC 3’(序列識(shí)別號(hào)31)
反向引物5’CCA TCA AGG ATG CTC TGT CG 3’(序列識(shí)別號(hào)32)探針片段長(zhǎng)度為229bpmkB基因正向引物5’CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3’(序列識(shí)別號(hào)33)反向引物5’CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3’(序列識(shí)別號(hào)34)探針片段長(zhǎng)度為167bpmkC基因正向引物5’GGC CTG AGC CGA AGA AGT AC 3’(序列識(shí)別號(hào)35)反向引物5’TCA GAG ATC TTC GTC CCG AC 3’(序列識(shí)別號(hào)36)探針片段長(zhǎng)度為304bpmkD基因正向引物5’TGA TGA CTT TGC CCT GGC GG 3’(序列識(shí)別號(hào)37)反向引物5’TCA CCC AAT GAC TCT AGC CC 3’(序列識(shí)別號(hào)38)探針片段長(zhǎng)度為175bpmkE基因正向引物5’TTC TCT CCC GAC AAC TGC CC 3’(序列識(shí)別號(hào)39)反向引物5’AAT GGT CAC CGC CGA CTG GA 3’(序列識(shí)別號(hào)40)探針片段長(zhǎng)度為246bp
mkF基因正向引物5’GCC CCG AAT CCT ACA TGA AG 3’(序列識(shí)別號(hào)41)反向引物5’GGC CCA CCG TAG TTG ATG TG 3’(序列識(shí)別號(hào)42)探針片段長(zhǎng)度為166bpmkG基因正向引物5’CCT CGC TCT GAA TAT GAC CC 3’(序列識(shí)別號(hào)43)反向引物5’TCG GAT CGG CTT CTC AAA CC 3’(序列識(shí)別號(hào)44)探針片段長(zhǎng)度為217bpmkH基因正向引物5’ACC TCA TCG CTC CAG ACC AT 3’(序列識(shí)別號(hào)45)反向引物5’CTG CGA GAG AAT GAG AGT GC 3’(序列識(shí)別號(hào)46)探針片段長(zhǎng)度為179bpmkI基因正向引物5’CTA GAC TCG TTC ATC GCG GC 3’(序列識(shí)別號(hào)47)反向引物5’CCA TAC ATT CTA CCT TGC GG 3’(序列識(shí)別號(hào)48)探針片段長(zhǎng)度為127bp實(shí)施例10巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)的轉(zhuǎn)化將PKS的全長(zhǎng)cDNA(mkA與mkB)接合于pPICZαA與C(Invitrogen)，并使用Pichia EasyComp.套組(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
實(shí)施例11DNA印跡雜交(Souhern blot)分析將凝膠浸泡在0.25M HCl中，放在平板震蕩器上輕輕搖晃10分鐘，以進(jìn)行酸脫嘌呤作用(acid depurination)，再以二次水輕輕地洗凈。之后轉(zhuǎn)至NaCl/NaOH溶液(1.5M NaCl，0.5NNaOH)中，放在平板震蕩器上輕輕搖晃15分鐘兩次，以進(jìn)行變性作用，再以二次水輕輕地洗凈。最后將凝膠浸泡在NaCl/Tris-HCl溶液(1.5M NaCl，1M Tris-HCl，pH7.4)中，放在平板震蕩器上輕輕搖晃15分鐘兩次，以進(jìn)行中和反應(yīng)。切割與凝膠大小適當(dāng)?shù)哪猃埬ぃ⒁约舻都粝乱唤且宰鰹橛浱?hào)，進(jìn)行DNA印跡。之后使用紫外光固定DNA于尼龍膜上，所得的尼龍膜再進(jìn)行雜交反應(yīng)與免疫偵測(cè)(Roche)。
以下所列引物是設(shè)計(jì)用于制備DNA印跡雜交分析所使用的探針mkA基因正向引物2 5’TGA ACA GCA CAG CAT AGG GG 3’(序列識(shí)別號(hào)49)反向引物2 5’GCA GCC ATT GAA GAC GGC AT 3’(序列識(shí)別號(hào)50)探針片段長(zhǎng)度為293bpmkB基因正向引物5’CTA GAC TTT GCT TCC CAC GCC A 3’(序列識(shí)別號(hào)33)反向引物5’CAT TGT CGA GCG TTG GAG TC 3’(序列識(shí)別號(hào)34)探針片段長(zhǎng)度為167bp實(shí)施例12聚縮酮的生成
Bedford(1995)，Gokhale(1999)，以及Pfeifer(2001)已研究過(guò)應(yīng)用大腸桿菌與鏈霉菌作為宿主細(xì)胞，進(jìn)行異源性聚縮酮合成酶的表達(dá)。而且，細(xì)菌性聚縮酮合成酶也已成功地表達(dá)于大腸桿菌與鏈霉菌中，并偵測(cè)到少量聚縮酮的生成。一般來(lái)說(shuō)，大腸桿菌缺乏轉(zhuǎn)譯后修飾作用，因此應(yīng)會(huì)限制功能性聚縮酮合成酶的異源表達(dá)。因此，可同時(shí)表達(dá)聚縮酮合成酶(簡(jiǎn)稱PKS)與4’-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(4’-phosphopantetheine transferase，簡(jiǎn)稱PPTase)，以產(chǎn)生聚縮酮合成酶的完整?；鶖y帶蛋白(簡(jiǎn)稱holo-ACP)功能區(qū)域，而能進(jìn)行聚縮酮生成(Mootz等人，2001)。為更進(jìn)一步研究本發(fā)明的表達(dá)載體的表達(dá)效能，將枯草桿菌(Bacillus subtilis)的sfp基因(編碼PPTase)成功轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體pCDF-1b中(如圖6所示)，并與如圖5所示的帶有PKS(即mkA基因)的載體同時(shí)表達(dá)于大腸桿菌中。SDS-PAGE的結(jié)果，如圖7所顯示，發(fā)現(xiàn)會(huì)產(chǎn)生少量的PKS可溶蛋白(342kDa)。而大部分Sfp蛋白亦可溶而造成29kDa蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下述。
1.表達(dá)載體的構(gòu)筑將mkA基因的部份cDNA片段(6.5kb cDNA)以正向引物p35’-CCATCAAGGATGCTCTGTCG-3’(序列識(shí)別號(hào)32)以及反向引物p45’-TCAAGCCAACTTCAACGCGG-3’(序列識(shí)別號(hào)51)，并以Monascus的第一股cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR增幅。將所得到的6.5kb cDNA片段導(dǎo)入載體pGEM-T，以獲得具有EcoRI-NotI切割位的片段。之后將上述片段接合至pET30，得到pETmkA1。再設(shè)計(jì)一組寡核苷酸引物，正向引物p15’-GGAATTCATGTACGTAGGACGCATTGGTGC-3’(序列識(shí)別號(hào)52)，其含有23個(gè)堿基互補(bǔ)于5’端的mkA基因，且導(dǎo)入EcoRI切割位，以及反向引物p25’-TCGCGAGGACGGACAAAGTT-3’(序列識(shí)別號(hào)53)，以由RT-PCR增幅部分3.0kb的cDNA。將上述具有EcoRI-EcoRI切割位的3.0kb Cdna片段接到pETmkA1，以得到pETmkA，如圖6所示。
另設(shè)計(jì)一組寡核苷酸引物，正向引物5’-CGGGATCCCATGAAGATTTACGGAATTTA-3’(序列識(shí)別號(hào)54)，其含有20個(gè)堿基互補(bǔ)于5’端的sfp基因，并導(dǎo)入BamHI切割位，以及反向引物5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTATAAAAGCTCTTCGTACG-3’(序列識(shí)別號(hào)55)，含有20個(gè)堿基互補(bǔ)于5’端sfp基因，并導(dǎo)入NotI切割位，以由枯草桿菌168的基因體DNA增幅出sfp基因。將具有BamHI-NotI切割位的sfp基因接合到pCDF-1b，已得到pCDFsfp，如圖7所示。
2.于大腸桿菌同時(shí)表達(dá)mkA與sfp將pETmkA與pCDFsfp同時(shí)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，并于LB培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)得到單獨(dú)菌落。接著，將LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到ATCC 765號(hào)的培養(yǎng)基，其中含有10％甘油，培養(yǎng)到OD600nm達(dá)到0.6～0.8。加入異丙醇-β-D-硫代半乳糖(isopropyl β-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱IPTG)至1.0mM的最終濃度，以誘導(dǎo)基因表達(dá)，并于20℃培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞沉淀物并以液態(tài)氮冷凍，再于42℃解凍，以進(jìn)行溶胞作用。為增進(jìn)溶胞作用，可加入溶菌酶(lysozyme)至細(xì)胞沉淀物中。以全細(xì)胞蛋白質(zhì)以及可溶蛋白質(zhì)的SDS-PAGE(7.5％的凝膠)，以及膠體考馬斯藍(lán)染色偵測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。
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序列表<110>財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所<120>膽固醇合成抑制劑Monacolin K生合成基因<140>
<141>
<160>55<210>1<211>226<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>
<222>
<223>monacolin K探針<400>1tccactgccg tttatgttgg catgatgaca cacgactacg agacggtgtc 50gacgcgcgac ttggagagca ttcccactta ctcggccacg ggagtcgctg 100ttagtgtcgc gtcgaaccgc atctcatact tctttgactg gcatggcccg 150agtgtaagtt gctctcatgc cccatattgg taatcttgaa gagttcctaa 200cggacttgat ggggtgaaga tgacga 226<210>2
<211>9818<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>
<222>
<223>mkA基因組DNA<400>2atgtacgtag gacgcattgg tgcgaccaca tacatctctc gtcccgcaga 50ctctcgagct acgccaaaag tgatcaaaac tcaagggtcg atcaccacgt 100ctaatctaac atcactaaca accatggctc agtcaacata ccccaatgag 150cctattgtcg tggtaggaag cggctgccgc tttcccgggg gcgccaacac 200gccctccaag ctgtgggagc tccttcggga gcctcgcgac gtccgtagca 250aaatcccgaa agagagattt gacgtcgacg cattctatca tccagacgga 300aaacaccatg gacgaacaaa cgcaccctat gcctatatgc tacaagaaga 350cctgcgcgcc ttcgacggcc ctttcttcaa tatccaggcc ggagaggccg 400agagtatgga tccacaacag cggctcttgc tggagaccgt gtacgaggca 450gtctcagatg ccggtatgcg gatccaagac ctgcaggggt cttccactgc 500cgtttatgtt ggcatgatga cacacgacta cgagacggtg tcgacgcgcg 550acttggagag cattcccact tactcggcca cgggagtcgc tgttagtgtc 600gcgtcgaacc gcatctcata cttctttgac tggcatggcc cgagtgtaag 650
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ggacgaggct acgttcgcca gactgctcag ggtggataca gcataccact 2700ctcaccatat gcttccttgt gcagcgccgt atatgcaagc tttggaggaa 2750tgcggctgtg ctgttgctga tggagacggt caggtggaag agggatcatg 2800gtattcctct gtcaaggaca gcaacgaacc aatgggcctt gccgacgtga 2850ctgctgagta ctggaaagat aacctggtat ccccggtgct tttctctcag 2900gccgtccagc gggcagccat catgcaccgg cccctggatg tcgggattga 2950agtcggttgc caccctgctc tcaagggccc gtgtctggct accatcaagg 3000atgctctgtc ggacgttgac ctggcataca caggatgttt ggagcgcgga 3050aagaatgata tgaatgcatt ttcccaggcc ctggcctatc tttgggagca 3100gttcggaatt ccaagcctgg atgctgaccg ctttataagt accattgctc 3150ccgagcgctc ctgcgtgagc ctttcgaagc agctgccgac gtactcatgg 3200gaccattctc ggagctattg gacggaatct cgtgccactc gtcagcacct 3250gcgaggaccg aagccgcatc ttctgctggg taagctctct gaatatagca 3300ctccgttgac cttccagtgg ctgaactttg tccgtcctcg cgacattgaa 3350tggctggatg ggcatgcatt gcagggccaa gtggtcttcc ctgccgcggg 3400ttatattgtc atggcgatgg aggcggccat ggaaattgcc aactctcatc 3450aggtgcaagt ccagctactt gagatcctgg atatgagcat tgacaaagcg 3500gtggttttcg atgatgaaga cagtctggta gaacttaact tgaccgcgga 3550agtaaccagc ggcatcggta aaggtgaccg gatgatcctc agcttcataa 3600ttgattcctg tctatccagg gaaggtgacc tctccacctc agccaagggt 3650
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<223>mkA氨基酸序列<400>11MYVGRIGATT YISRPADSRA TPKVIKTQGS ITTSNLTSLT TMAQSTYPNE 50PIVVVGSGCR FPGGANTPSK LWELLREPRD VRSKIPKERF DVDAFYHPDG 100KHHGRTNAPY AYMLQEDLRA FDGPFFNIQA GEAESMDPQQ RLLLETVYEA 150VSDAGMRIQD LQGSSTAVYV GMMTHDYETV STRDLESIPT YSATGVAVSV 200ASNRISYFFD WHGPSMTIDT ACSSSLVAVH LAVQQLRSGQ SSMAIAAGAN 250MILGPMTFVL ESKLNMLSPS GRSRMWDAGA DGYARGEAVC SVVLKTLSQA 300LRDGDSIECV IRETGVNQDG RTTGITMPNH SAQEALIRAT YSKAGLDITN 350PEDRCQFFEA HGTGTPAGDP QEAEAIATAF FGHKKEASDA ENAETPLFVG 400SVKTVVGHTE GTAGLAGLMK ASFAVQHGVI PPNLLFENIS PRVAPFYSNL 450
KIATETTPWP TIKPGQPRRV SVNSFGFGGT NAHAIIEEYI KSDQKVPASR 500QPVEYSDSPS TLNLPLVLSA KSQRSMKTTL ESMVQFLQSN PEVNLRDLSW 550TLLRKRSILP FRRAIVGHSH EAIRAALEAA IEDGIVVSDF SADVKGKPSV 600LGVFTGQGAQ WPGMLKELIV GSSYVRSIAE ELDHSLQTLP EKYRPSWTIL 650EQLMLEDEAS NVRHASFSQP LCCAVQIVLV RLLKAAGIQF AAVVGHSSGE 700IACAFATGLI SASLAIRIAH LRGVVSAEHA ASASGGRGSM LAAGMSYEEA 750KELCELDAFE SRICVAASNS PDSVTFSGDA DAIEHLQGVL EDEATFARLL 800RVDTAYHSHH MLPCAAPYMQ ALEECGCAVA DGDGQVEEGS WYSSVKDSNE 850PMGLADVTAE YWKDNLVSPV LFSQAVQRAA IMHRPLDVGI EVGCHPALKG 900PCLATIKDAL SDVDLAYTGC LERGKNDMNA FSQALAYLWE QFGIPSLDAD 950RFISTIAPER SCVSLSKQLP TYSWDHSRSY WTESRATRQH LRGPKPHLLL 1000GKLSEYSTPL TFQWLNFVRP RDIEWLDGHA LQGQVVFPAA GYIVMAMEAA 1050MEIANSHQVQ VQLLEILDMS IDKAVVFDDE DSLVELNLTA EVTSGIGKGD 1100RMILSFIIDS CLSREGDLST SAKGQLVVTL DEGHLQVTPD NEKQLLPPPE 1150EEHPHMNRVN INSFYHELDL MGYDYSKDFR RLHSMRRADA RASGILEFIP 1200LNDEVHGRPL LLHPAPLDIA FQTVIGAYSS PGDRRLRCLY VPTHIDRIAL 1250VPSLCLATAA SGCDKIAFNT INTYDKGDFL SGDIVAFDAE QTSLFHVENI 1300VFKPFSPPTA STDHPIFAKW SWGPLTPETL LDNPNHWATA QDKEAIPIIE 1350RIVYFYIKLF LQQLTREDRE QAAFHLQRQI VWCEQVVADA HEGRHQWYDA 1400AWENDTEAQI EQLCARSSYH PHVRLVQRVG QNLLATIRSN GNPFDLMDHD 1450
GLLTEFYTNT LSFGPALHYA QDLVGQIAHR YQSMDILEIG AGTGGATKYV 1500LATPQLGFNS YTYTDISTGF FEKAREQFAA FEDRMEFEPL DIRRSPAEQG 1550FTEHVYDLII ASNVLHATPD LEKTMAHARS LLKPGGQMVI LEITHRNHTR 1600LGFIFGLFAD WWAGIDDGRT MEPFVSFDRW DEILKHVGFS GIDSRTKDRD 1650ADLFPTSVFS THAVNSTIDY LHKPLDAPVK DSYPPLVVVG GQTPKTQRIL 1700DEIKAVMPNR QIQLHQRLVD LLDAEDMQAK FTFVVLTELD EELFAGLTED 1750SFEAVKLLLM YAGNMLWLTE NAWVKRPHQA STIGMLRSIR REHPDIGVHI 1800MDVDSAENLD AHFLVEQVLR LEEDIDELAA TTTWTQEPEV FWCNGRAWIP 1850RLKHDKSRNN RMNSSRRQIF ETLNPSKIPV ALKKAAASSS YYLESAETWP 1900VPGAVTAGDR KTVHVRLSHP HALRVGHLGF FYLVQGHVLK GDQALPVVAL 1950AERNASIVHV RSDYVHVLED TAVSANNGSF ILAAAAAVLA ETVIHSAKSL 2000GADASVLVLN APGFCAQTLL RAARDSGLRV HLATTSSSTD PSPGADRCVR 2050LHPRDTDRRL KQLLPRGTQA FFDLSTDPSS EGLTQRLPNV LIPSCVRHST 2100EYLLRDTASA GGKATLPAAY WERVASLANH SLSTHFKEND NASNGCQVLS 2150CTDIVARNNK SRLNASTVIS WPDDAALPAR IRPIDTETLF AAEKTYLLVG 2200LTGDLGRSLG RWMVLHGARR IVLTSRNPQV SPNWVAHVEE LGGQVTVLSM 2250DVTSEDSVDS GLAKLQDLKL PPIGGIAFGP LVLQDVMLKN MDLQMMEMVL 2300KPKVEGARIL HEKFSDPASS NPLDFFVMFS SIVAVMGNPG QANYSAANCY 2350LQALAQRRCA SGLAASTIDI GAVYGVGFVT RAELEEDFNA IRFMFDSVEE 2400HELHSLFAEA VVSGRRAMHQ QQQFKTVLDM ADIELTTGIP PLDPTLKDRI 2450
TFFDDARVGN FKIPERRGKA GDNAAGSKGS VKEQLLQATS LDQVRQIVID 2500GLSEKLRVTL QIPDGESVHP TIPLIDQGVD SLGAVTVGTW FSKQLYLDLP 2550LLRVLGGASV ADLADDAAAR LPPSSIPLVA ASEGGAETSD NDTSGPEGTD 2600LSASTTITEP SSADEEDEKQ EDDNDNSVLA LHPLSLGQEY AWRLQKAADD 2650STIFNNTIGM FMTGSIDAKR LSKALRAVLR RHEIFRTGFA AVGNNADATS 2700LAQIVFGRTK NKVQVIQVAD RAGAEEGYRQ LVQTQYDITA GDTLRLVDFF 2750WGKDEHLFVV AYHRFVGDGS TTENIFVEAS QLYGGVTLDK HVPQFADLAT 2800RQREALESGQ MDADLAYWES MHHQPTGVVS PVLPRMLLGE DGLNSPNHAR 2850QPNSWKQHEA IARLDPMVAF RIRERSRKHK ATPMQFYLAA YHVLLARLTG 2900SSDFSIGLAD TNRTNVDELA GMGFFANLLP LRFRNFVPHI TFGEHLVATK 2950DKVREAMQHA RVPYGVLLER LGFEVPGATA ETAEPAPLFQ AVFDYKQGQA 3000ESGSIGSAKM TEVIATRERT PYDVVLEMSD DPTKDPLLTV KLQSSVYEVH 3050HPRAFLESYI SILSMFSMNP ALKLA3075<210>12<211>2547<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>
<222>
<223>mkB基因 氨基酸序列<400>12MKATAASGTP TPIAVVGMGC RFAGGATDPQ ALWKLLEQGG STWSKTPSSR 50FNVSGVYHPN GQRVGSMHVR GGHFLDQDPA LFDASFFNMT SEVASCMDPQ 100QRLILEVVYE ALEAAGIPLE SVAGSNTAVF SGAMYHDYQD SLHRNPETLP 150RYFITGNAGT MMSSRVSHFY DLRGPSVTVD TACSTTLTAL HLAIQSIRAG 200EADMAIVAGS NLLLNSDVFV TMSNLGFLSP DGISYSFDPR ANGYGRGEGV 250AAIILKALPR ALRDGDPIRL VVRETALNQD GRTPAITGPS PEAQACLIRE 300CYQKAGLDPR QTSYVEAHGT GTPTGDPLEL AAISAAFQGQ PLQIGSVKAN 350LGHTEAASGL ASVMKVALAL EKGIVPPSAR FLQPSKKLLE ERKFQIPLSS 400QLWLPIDGIC RASINNFGFG GANAHAIVER YDPAARISTS KPNGHIRPHD 450SHVEADRGKI YVLSAKDEHS CQEMISRLRD YLNRANPTDE RQFLANMAYT 500LASRRSNLRW KAACRAHSLA SLLSVLVSDG TRPRRSAEKA RLGWVFTGQG 550AQWFAMGREL IEAYPVFKEA LIECDGYIKG MGANWSIIDE LRRGEAESRV 600NEAEFSLPLS TAIQVALVRL LWSWGIRPAA ITSHSSGEVA AAYAVGAFSA 650RSAIGISYIR GALIAKTQPA PTTKGGMLAV GLSRSEVGEY ITRVQQQGEE 700YLVVGCINSP SNVTVSGDLS AVVRLEELLH ADQIFARRLK VTQAFHSHHM 750QPLSGEFREA LVEVFNADIT DTTNACQDVV YASPKTGKRL DDCNHLRDPM 800HWVESMLFPV EFESSFREMC FDRKDQAQEV DKIIEIGPHG VLSGAIKQIL 850QLPELAAFDI SYLSCLSRGK SAVDTIQLLA MDLLQGGYPV DLNAVNFPYG 900
CEAAEVQVLS DLPTYPWNHK TRYWKEPRIS RAARQRKIPV HDLIGVQEPL 950CPPLLHLWQN VLRISDVPWI RDHVVGSRIL FPGAGFISMV IDGLSQICNH 1000DPETCGLSYI LRDVDLAQAL ILPTDGDEGV DLRLTIRAAD QKSLGMRDWQ 1050RFSVYSIAGD KDDWTEHCTG LIRAQVDHPV SSSSIQQKTN PPQWSRKMAP 1100QDLWASLHAT GICHGPLFQN IERIESDGQA SWCTLTVADT VATMPHAYES 1150QHIVHPTTLD SAIQAAYTVL PFMGTLMKTA MVPSRIGGMK IPASFASLEP 1200GDMLCAQAKI KNQGLSAFTT DVAVFNESDM DEEAGIELEG LTFQSLGAVI 1250SDSRRDLTEN ESTYSSWHWA PDITLTNSTW LERILSTGTQ SQEIGVMLEL 1300RRCTVHFIQE AIENLTTEDV ERLSGHLVKF YCWMQAQLAC ATNGELGQDS 1350ADWLRDSEQE RQSLRSRVVA ATNNGEMICR LGPKLSAILR GELDPLELMM 1400DGQLLSRYYI RAIKWSRSNT QASELVRLCC HKNPRARILE IGGGTGGCTQ 1450LIVNALGPTK PVGRYDFTDV SAGFFEAARK RFSGWQDVMD FRKLDIEGDP 1500EVQGFDCGSY DVVLACQVLH ATSNMQRTLN NVRKLLKPGG KLILVETTRD 1550QLDLFFTFGL LPGWWLSEEP ERQLTPSLSP ELWRSVLSAT GFSGVDLEVR 1600DCDSDEFYMI STMMSTATPG TPATTLNGPA EVLLVHAGSP PPMDWLQNLQ 1650VALGGKNSSI TSLKALQGVS DLKGKMCVFL GEMDRTLLES VVSDDFTSLT 1700SMLQYSQGTL WVTRGAAMAS DDPRKALHLG LLRTLRNENH GRRFVSLDLD 1750PLRDPWTAQS CDAIVNVLNA VGASHEKEFE YAERDGTIHV PRTFSDSSSS 1800EKEDLVVLEP FQNETRLVRL DVQTPGLLDS LHFKLCSADE AWSSELPEDW 1850VEIEPRAFGL NFRDIMVAMG QLESNRVMGF ECAGVVTRLS KAATTGAGGL 1900
AIGDRVCALM KGHWASRVRT ARTNVICIPG TLSFEQAASI PLAFTTAYTS 1950LYTVARLQRG EKVLIHGGAG GVGQAAIILA QLVGAEVFTT AGTHSKRNFL 2000IDKFKLAPDH VFSSRDSGFI EGIRACTNGK GVDVVLNSLA GPLLQYSFDC 2050LVNFGRFVEI GKKDLEQNSR LNMATFARNV SFSSIDILYW EEAKSAEIFR 2100ALTEIMRLLE QKTIDLIGPI SEYPMSAIEK AFRTMQSGQH VGKLVVATAE 2150TDMIPVRRGT MPVALKLDAS YLIVGGLGGI GRRICEWMVD HGARHLLILS 2200RSGRTDPFVT GLQKRGCVVR IHSCDVADES QLHAVLQQCH EDNMPPIRGI 2250IQAAMVLKDA LVSQMTADDF HVALRPKVQG SWNLHKIASE VDFFIMLSSL 2300VGVMGGAGQA NYAAAGAFQD ALAQHRVAQG KPAVTIDLGM VKSIGYVAET 2350DPAVAERLAR IGYQPMHEEE VLAVLERAMS PSSSSAPPSS NPTIPASPAV 2400IVTGINTGPG PHFTNADWMQ EARFAGIKYR DPLKDDRGGA LSSSQPADED 2450SVRARLSRAS TEEEATALVV QVMGHRLVTM FGLTESEMSA TQTLSSVGVD 2500SLVAIELRNW ITAQLNVDIS VFELMEGRTI AEVAEVVVKK YGVGSKV2547<210>13<211>524<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
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<223>mkC基因 氨基酸序列<400>13MTVPTDTVSR RLQSLAWSDI KQHAPWLPSS RTLVSGFLCL ILLQILYSRG 50RKSDLRVYNP KKWWELTTMR AKREFDANAP AWIEAWFSKN DQPLRFIVDS 100GYCTILPSSM ADEFRKMKEL CMYKFLGTDF HSHLPGFDGF KEVTRDAHLI 150TKVVMNQFQT QAAKYTKPLA DEASATIADI FGDNKEWHTA PVYNECLDLV 200TRTVTFIMVG DKLAHNEEWL DIAKHHAVTM AIQARQLRLW PVILRPIVHW 250LEPQGAKLRA QVRRARQLLE PIIQERRAEK AKCLAQGIEP PRYVDSIQWF 300EDTAKGQWYD AAGAQLAMDF AGIYGTSDLM IGGLVDIVRH PHLIEPLRNE 350IRTVIGEEGW TPASLYKLKL LDSCLKESQR VKPVECATMR SYALQNVTFS 400NGTFVPKGEL VAVAADRMSN PEVWPEPKKY DPYRYMRLRE DPDKAFSAQL 450ENTNGNHIGF GWHPRACPGR FFASKEIKIM LAFLLIRYDW KLVPNEPLQY 500YRHSFSVRIH PATKLMMRRR DEDL 524<210>14<211>263<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>
<222>
<223>mkD基因 氨基酸序列<400>14MRIQRTPAPP KAPRALLCVH GAGCSPAIFR VQLSKLRAAL REDFEFVYAT 50APFPSAPGPG ILPTFEGLGP YYTWFEGSPS GAAAKGDNSN SNDSNSSPTV 100HDRLAAVHEP VRRAIAEWQT QNPSIPIVGT VSFSEGALVT ALLLWQQQMG 150RIPWLPVMQV AMFICCWYQH EATQYMREEV GCGGDGGIDG EKLVIRGVLS 200LHLQGRDDFA LAGSKMVVAQ HFVPGEAQVL EFAGRHHFPN RPRDVLETVK 250RFRQLCVRAR VIG 263<210>15<211>360<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
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<223>mkE基因 氨基酸序列<400>15MTITFTLPPH QTALTVDEHD KVTIWDVAPC PSLPPDQVCV RVEAVALNPS 50DTKMRGQFAT PYAFLGTDYA GTVVAVGSQV THIQVGDRVY GAQNEMCPRT 100PRPGPFSQYT VTRGRIWATV PEGWSFEQAA SLPAGISTAG LAMKLLGLPL 150
PDPNATTAPA LPKPVYVLVY GGSTATATIV MQMLRLSGYI PIATCSPHNF 200DLAKKHGAED VFDYRDAGLA QTIRTYTKNN LRYALDCITN VESTTLCFAA 250IGRAGGRYVS LNPFPEHAAT RKMVTADWTL GPTIFGEGST WPAPYGRPGS 300EKDRAFGEEL WRVAARLVED GKIVHHPLRV IPGGFEAIKQ GMELVRTGQL 350SGEKVVVKLG 360<210>16<211>413<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
<221>
<222>
<223>mkF基因 氨基酸序列<400>16MRQFLSSDRI NSEIPQEKSE MVGFSDIDNS SRQIKEMEAA FRSAVKTGQI 50PGAVIMARDH SGRLNYTRCF GARTVVRDEC NRLPPMQVDT PCRLASATKL 100LTTIMALQCV ERGLVRLDET VDRLLPDLSA MKVLEGFDAA GEPKMRERKG 150KITLKHLLTH TSGLSYVFLH PLLREYMAKG HLQTAEKFGI QSRLAPPAVN 200DPGAEWIYGA NLDWTGKLVE RATGLDLEQY LQENICAPLN ITDMTFKLQQ 250RPDLLARRAD QTHRNKADGR LRYDDSVYFR SDGDECFGGQ GVFSGPESYM 300
KVVHSLLQRD GRLLRPETVD LMFQPALDAQ TEKQMNQHMD ASPHINYGGP 350MPMVLRRSFG LGGMIALEDL DGQKWRRKGC LTFGGGPNIV WVMLLSALRF 400VFFFFFFFFF CSS 413<210>17<211>455<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
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<222>
<223>mkH基因 氨基酸序列<400>17MALSPVQDPP SHTDKTMPRR AFRRSCDRCH AQKIKCIGSE GAVARASCQR 50CQQAGLRCVY SERCPKRKLP KPNPAESSPA SSTAGLHTSS SDSSPPVPSD 100GLPLDLPGPD SSGVSLQFLD PSADCDWPWS SIGVDETVVN NCLDLSHGHG 150HGDLSCQLEL PMPDLPSPFE FSAEKSPSPS VSGSIAGAVS AQRELFDGLS 200TVSQELEAIL LAVAVEWPKQ EIWTYPIGTF FNASRRLLVY LQQQSNTRSD 250QGMLNECLRT KNLFMAVHCY MLIVKIFTSL SELLLSQIRH SQAGQLTPLE 300GHQFEPPPSS SRDRSSVDTM PIFNPNLHIG GLFSYLNPFM HALSSACTTL 350RVGVQLLREN ESALGIPPAQ GVAASVSMGK EEWADGEDVA SAVTTADEDL 400
RQPASRILSM VWSDEVGDQK AKSADAAGPR SRTLAVLRRC NREIFSLARQ 450HNLAS 455<210>18<211>543<212>PRT<213>Monascus BCRC 38072<220>
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<223>mkI基因 氨基酸序列<400>18MASHQSEKEK PQSCTTEVQV SHVTGLKLGL VVTSVTLVVF LMLLDMSIIV 50TAIPHITAQF HSLGDVGWYG SAYLLSSCAL QPLAGKLYTL LTLKYTFLAF 100LGVFEVGSAL CGAARCSTML IVGRAVAGMG GSGLTNGAIT ILASAAPKQQ 150QPLLIGIMMG LSQIAIVCGP LLGGAFTQHA SWRWCFYINL PVGALAAILL 200LAIHIPKSVP TSDCTMPAPR AVGVRVILSQ LDLLGFVLFA AFAVMISLAL 250EWGGSDYMWD SSVIIGLFCG AGISLVVFGF WERYVGNSMA MIPFSVASRR 300QVWCSCLFLG FFSGALLTFS YYLPIYFQAV KDVSPTMSGV YMLPGIGGQI 350VMAIVSGAII GKTGYYIPWA LASGIIVSIS AGLVSTFQPH TSIAAWVMYQ 400FMGGFGRGCG MQTPIIAIQH ALPPQMSALG ISLAMFGQTF GGSLFLTLAK 450
LVFSAGLDAG LREYAPAVSA EAVTAAGATG FRDVVPANLL SQVLLAYCKG 500IDHTFYLAVG ASGATFLFAW GMGQVGLIWW GEERTGFGRD ERV543<210>19<211>9228<212>DNA<213>Monascus BCRC 38072<220>
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<223>mkA cDNA<400>19atgtacgtag gacgcattgg tgcgaccaca tacatctctc gtcccgcaga 50ctctcgagct acgccaaaag tgatcaaaac tcaagggtcg atcaccacgt 100ctaatctaac atcactaaca accatggctc agtcaacata ccccaatgag 150cctattgtcg tggtaggaag cggctgccgc tttcccgggg gcgccaacac 200gccctccaag ctgtgggagc tccttcggga gcctcgcgac gtccgtagca 250aaatcccgaa agagagattt gacgtcgacg cattctatca tccagacgga 300aaacaccatg gacgaacaaa cgcaccctat gcctatatgc tacaagaaga 350cctgcgcgcc ttcgacggcc ctttcttcaa tatccaggcc ggagaggccg 400agagtatgga tccacaacag cggctcttgc tggagaccgt gtacgaggca 450
gtctcagatg ccggtatgcg gatccaagac ctgcaggggt cttccactgc 500cgtttatgtt ggcatgatga cacacgacta cgagacggtg tcgacgcgcg 550acttggagag cattcccact tactcggcca cgggagtcgc tgttagtgtc 600gcgtcgaacc gcatctcata cttctttgac tggcatggcc cgagtatgac 650gatcgatacc gcatgcagct cgtctttggt tgccgttcac ctggctgtac 700aacagctacg cagtgggcaa agctccatgg ctatcgccgc gggcgccaac 750atgatcctcg ggcccatgac cttcgttcta gaaagcaagt tgaacatgtt 800atccccctcg ggccggtccc gcatgtggga cgctggggcc gatggctatg 850ctagaggcga agctgtttgt tcggtagtgc ttaaaacatt gagccaagcc 900ttgcgcgatg gcgacagcat tgaatgcgtt atccgagaaa ccggtgtgaa 950ccaagatggt cgaacgacag gcatcacgat gcccaaccac agcgctcagg 1000aggcacttat cagggctacc tactccaaag ccggcctcga catcacgaac 1050cccgaggatc gatgccagtt cttcgaggct catggaactg gtacaccagc 1100aggagatcca caggaggccg aggccatcgc aaccgccttt ttcggacaca 1150aaaaggaggc ctccgatgct gagaacgcag agactcccct cttcgtgggc 1200agtgtgaaga ccgttgtcgg tcatactgag ggcactgccg gcctggctgg 1250tctcatgaag gcgtccttcg ccgtccagca cggagtgatc ccgcccaacc 1300tgctgtttga gaatatcagc ccccgcgtgg ccccattcta ctccaatttg 1350aagattgcaa cagagacaac accatggccc accatcaaac ctggacagcc 1400tcgccgtgtc agtgtcaact cttttggttt cggtggcacg aatgcacatg 1450
caattattga ggaatacata aagtctgacc aaaaggtgcc agcgagccga 1500cagccggtgg agtactcaga cagtcccagt acattgaatc tgcccttggt 1550tctctcggcc aagtctcagc gctccatgaa gacaacgttg gagagcatgg 1600tacagttcct tcagtccaac cctgaagtta acttgcggga tctttcatgg 1650actctactgc ggaagcggtc gattctaccc ttccgtcggg ctattgtcgg 1700ccatagccac gaagcaatcc gtgccgctct cgaggcagcc attgaagacg 1750gcatcgttgt gagcgacttc agcgcggatg tcaaaggcaa gccgtctgtg 1800ctgggagtct tcaccggaca gggtgcccaa tggcctggga tgttgaagga 1850actgattgtg ggatcatcct atgtgcggtc gatagcggag gagctggatc 1900actcactgca gactttgccg gagaagtacc gcccctcctg gaccattctc 1950gagcagctaa tgctagaaga tgaggcttcc aacgtccgac acgccagctt 2000ctcccagccc ctatgctgtg ctgttcagat tgttctggtg cgtctcctga 2050aagcagcagg aatccagttt gctgctgtgg tcggacacag ttccggagag 2100atcgcctgtg catttgccac cggtcttatc agtgcatcct tggcaattcg 2150tattgcccac ctgcgtggag tcgtttcggc ggagcacgct gcctccgcga 2200gcggaggacg cggatctatg ttggcagcag gtatgtccta tgaggaagcg 2250aaagagctct gtgagttgga tgcctttgaa agccgcatct gtgttgctgc 2300tagcaattcc ccagacagcg ttaccttctc gggagatgcg gatgcaattg 2350agcacttgca gggcgttctg gaggacgagg ctacgttcgc cagactgctc 2400agggtggata cagcatacca ctctcaccat atgcttcctt gtgcagcgcc 2450
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<222>
<223>mkG氨基酸序列<400>28MASAAVTPKL GWVQHQVTNG LHAVVGQVCR HPIHTLLVTA LIAATTYLHV 50LEGTFRAANL GPGSKTDAAP FDVQSFLWGS RSLRLGETSS WRWQVGDLSE 100ATGDGQVNHH WALVTLSFPG ASVDDRSPAF LWNALPDSVG AEPITPTSNF 150FTSISNEFSL AFRVPYTQLS DFLEAVEFVA SDKEDRSWAI RFPHGEGKPI 200SLGRWLGNSW LSFLHRAKHA ETVDMAIIGL GYLALNMTLV SLFRAMRQLG 250SRFWLAASVL LSGAFAFVFG LGVTTACGVP VDMLLLSEGI PFLVLTVGFE 300KPIRFTRAVL YASNQLRRGL QQRDVADKHD SRQRHMIPNA MLFAINREGW 350SIVQSYLLEI GALALGAVFR PRERFGQFCF LAAWMVLFDA ILLFTFYATI 400LCVKLEVTRM QNPGTLDLAD DQHGPRIFGY KVNPTSLARW KLIMVGGFVL 450FNVLQLSSFF YRIMGGFMTN AALTPTTVSP FKVAANGLND IYLAARAGGV 500ETWVTVLPPI RYVMEASGLE MSAGRRPVFD GVLAGLESPL GRLCLMGALV 550FSLYLNNHLI PAARWHFSPG APKESAAPAP PSSPASVPSA VPVPAPSSRS 600FEEIEALFKA NQAESLTDDE LAELCLRGKI AGYSLEKTLE SIASAGSSST 650ATTRLEAFTR AVRIRRAAVS RTPSTRDLSG GIQESLLPYR NYNYELVHGA 700CCENVIGYLP LPLGLAGPMV IDGQAYFIPM ATTEGVLVAS ASRGCKAINT 750
GGGAVTMLKG DGMTRGPCLG FPSAKRAAEA QRWVESPVGH QVLTDAFNAT 800SRFARLQTLT VAQAGTYLYI RFRTTTGDAM GMNMISKGVE KALQAMTAHG 850FPDMNTITLS GNFCADKKSA AINWIGGRGK SVIAEATIPA DTVRKVLKTD 900IDALVELNTA KNLVGSAMAG SMGGFNAHAS NLVQAVFLAT GQDPAQNVES 950SSCITTMKKI DGNLHIAVSM PSMEVGTIGG GTILEAQGAM LDLLGVRGAH 1000PTDPGANARR LARIVAAAVL AGELSTCSAL AAGHLVNAHM RHNRSAASSE 1050KK 1052<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>Monascus monacolin K探針Mplov1正向引物<400>29tccactgccg tttatgttg19<210>30<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>Monascus monacolin K探針Mplov2反向引物<400>30tcgtcatctt caccccatc19<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkA基因的正向引物<400>31atagctccga gaatggtccc 20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkA基因(p3)反向引物<400>32ccatcaagga tgctctgtcg 20<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkB基因 正向引物<400>33ctagactttg cttcccacgc ca22<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkB基因 反向引物<400>34cattgtcgag cgttggagtc20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkC基因 正向引物<400>35ggcctgagcc gaagaagtac20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合
<222>
<223>mkC基因 反向引物<400>36tcagagatct tcgtcccgac20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkD基因 正向引物<400>37tgatgacttt gccctggcgg20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkD基因 反向引物<400>38tcacccaatg actctagccc 20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkE基因 正向引物<400>39ttctctcccg acaactgccc 20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkE基因 反向引物
<400>40aatggtcacc gccgactgga 20<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkF基因的正向引物<400>41gccccgaatc ctacatgaag 20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkF基因 反向引物<400>42
ggcccaccgt agttgatgtg 20<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkG基因的正向引物<400>43cctcgctctg aatatgaccc 20<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkG基因反向引物<400>44tcggatcggc ttctcaaacc 20
<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkH基因的正向引物<400>45acctcatcgc tccagaccat 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkH基因 反向引物<400>46ctgcgagaga atgagagtgc 20
<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkI基因的正向引物<400>47ctagactcgt tcatcgcggc 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkI基因反向引物<400>48ccatacattc taccttgcgg 20<210>49
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkA基因(2)的正向引物<400>49tgaacagcac agcatagggg 20<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>mkA基因(2)反向引物<400>50gcagccattg aagacggcat 20<210>51<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>反向引物p4<400>51tcaagccaac ttcaacgcgg 20<210>52<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>正向引物p1<400>52ggaattcatg tacgtaggac gcattggtgc 30<210>53<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>反向引物p2<400>53tcgcgaggac ggacaaagtt 20<210>54<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>sfp基因的正向引物BamHI位點(diǎn)<400>54cgggatccca tgaagattta cggaattta29<210>55<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>引物-結(jié)合<222>
<223>sfp基因 反向引物NotI位點(diǎn)<400>55atagtttagc ggccgcttat aaaagctctt cgtacg 3權(quán)利要求
1.一種分離的DNA分子，其特征在于包括一序列識(shí)別號(hào)1的核苷酸序列，或于嚴(yán)苛條件下可與序列識(shí)別號(hào)1雜交的的核苷酸序列。
2.一種分離的DNA分子，包括擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群的聚核苷酸a)mkA的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)2的核苷酸序列；b)mkB的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)3的核苷酸序列；c)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)4的核苷酸序列；d)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)5的核苷酸序列；e)mkE的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)6的核苷酸序列；f)mkF的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)7的核苷酸序列；g)mkG的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)8的核苷酸序列；h)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)9的核苷酸序列；i)mkI的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)10的核苷酸序列；以及j)于嚴(yán)苛條件下可與a)，b)，c)，d)，e)，f)，g)，h)，或i)雜交的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是a)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是b)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是c)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是d)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是e)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是f)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是g)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是h)。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子，其是i)。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?，乙酰轉(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，及?；鶖y帶蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?，乙酰轉(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，?；鶖y帶蛋白，以及酰脂基還原酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有二縮酮合成酶的活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有單加氧酶活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有氧化還原酶活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有去氫酶活性。
19.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)酯酶活性。
20.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有HMG-CoA還原酶活性。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
22.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的DNA分子，其中該聚核苷酸編碼一多肽，該多肽具有外排泵活性。
23.一種穿梭載體，其包括如權(quán)利要求2所述的分離的DNA分子。
24.一種分離的DNA分子，包括擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群的聚核苷酸a)mkA的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)19的核苷酸序列；b)mkB的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)20的核苷酸序列；c)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)21的核苷酸序列；d)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)22的核苷酸序列；e)mkE的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)23的核苷酸序列；f)mkF的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)24的核苷酸序列；g)mkG的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)27的核苷酸序列；h)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)25的核苷酸序列；i)mkI的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)26的核苷酸序列；以及j)于嚴(yán)苛條件下可與a)，b)，c)，d)，e)，f)，g)，h)，或i)雜交的核苷酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的D NA分子，其是a)，且編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅?，乙酰轉(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，及?；鶖y帶蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的分離的DNA分子，其中該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是b)，且編碼一多肽，該多肽具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅福阴＾D(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，?；鶖y帶蛋白，以及酰脂基還原酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的分離的DNA分子，其中該多肽具有二縮酮合成酶的活性。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是c)，且編碼一多肽，該多肽具有單加氧酶活性。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是d)，且編碼一多肽，該多肽具有氧化還原酶活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是e)，且編碼一多肽，該多肽具有去氫酶活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是f)，且編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)酯酶活性。
33.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是g)，且編碼一多肽，該多肽具有HMG-CoA還原酶活性。
34.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是h)，且編碼一多肽，該多肽具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
35.根據(jù)權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子，其是i)，且編碼一多肽，該多肽具有外排泵活性。
36.一種表達(dá)載體，其包括如權(quán)利要求24所述的分離的DNA分子。
37.一種細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有一聚核苷酸，該聚核苷酸是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群a)mkA的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列；b)mkB的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列；c)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列；d)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列；e)mkE的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列；f)mkF的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列；g)mkG的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)8或27的核苷酸序列；h)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列；i)mkI的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)10或26的核苷酸序列；以及j)上述的組合。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為細(xì)菌，酵母菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或絲狀真菌。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為紅曲霉菌屬。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為紅曲霉菌BCRC 38072。
42.一種增加莫那可林K生成的方法，其包括I)培養(yǎng)一可生產(chǎn)莫那可林K的細(xì)胞，該細(xì)胞轉(zhuǎn)化有一擇自以下所組成的族群的聚核苷酸a)mkA的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列；b)mkB的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列；c)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列；d)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列；e)mkE的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列；f)mkF的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列；g)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列；以及j)上述的組合；以及II)由該細(xì)胞收集莫那可林K。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是紅曲霉菌屬。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的增加莫那可林K生成的方法，其中該細(xì)胞是紅曲霉菌BCRC 38072。
47.根據(jù)權(quán)利要求42所述的增加莫那可林K生成的方法，其中該聚核苷酸為g)。
48.一種生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，包括I)培養(yǎng)一可生成HMG-CoA還原酶抑制劑的細(xì)胞，該細(xì)胞轉(zhuǎn)化有一聚核苷酸，包括a)mkA的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)2或19的核苷酸序列；b)mkB的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)3或20的核苷酸序列；c)mkE的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)6或23的核苷酸序列；d)mkF的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)7或24的核苷酸序列；以及II)由該細(xì)胞收集HMG-CoA還原酶抑制劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該HMG-CoA還原酶抑制劑為莫那可林K。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該細(xì)胞為細(xì)菌，酵母菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或絲狀真菌。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該細(xì)胞為紅曲霉菌屬。
52.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該細(xì)胞是擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群紅曲霉pilosus，紅曲霉ruber，以及紅曲霉purpureus。
53.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該細(xì)胞為紅曲霉菌BCRC 38072。
54.根據(jù)權(quán)利要求48所述的生成HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，其中該細(xì)胞更轉(zhuǎn)化有一擇自所組成的聚核苷酸a)mkC的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)4或21的核苷酸序列；b)mkD的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)5或22的核苷酸序列；c)mkH的聚核苷酸，其包括序列識(shí)別號(hào)9或25的核苷酸序列；以及d)以上的組合。
55.一種分離的DNA分子，包括一聚核苷酸，其編碼擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成的族群的多肽a)一包括序列識(shí)別號(hào)11的氨基酸序列的多肽；b)一包括序列識(shí)別號(hào)12的氨基酸序列的多肽；c)一包括序列識(shí)別號(hào)13的氨基酸序列的多肽；d)一包括序列識(shí)別號(hào)14的氨基酸序列的多肽；e)一包括序列識(shí)別號(hào)15的氨基酸序列的多肽；f)一包括序列識(shí)別號(hào)16的氨基酸序列的多肽；g)一包括序列識(shí)別號(hào)28的氨基酸序列的多肽；h)一包括序列識(shí)別號(hào)17的氨基酸序列的多肽；i)一包括序列識(shí)別號(hào)18的氨基酸序列的多肽；；以及j)于嚴(yán)苛條件下可與編碼a)，b)，c)，d)，e)，f)，g)，h)，或i)的聚核苷酸雜交的核苷酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為a)，且具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅福阴＾D(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，及?；鶖y帶蛋白。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分離的DNA分子，其中該多肽具有九縮酮合成酶的活性。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為b)，且具有擇自以下一個(gè)或多個(gè)所列物所組成族群的活性β-酮?；铣擅福阴＾D(zhuǎn)移酶，脫水酶，甲基轉(zhuǎn)移酶，酮還原酶，?；鶖y帶蛋白，以及酰脂基還原酶。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的分離的DNA分子，其中該多肽為c)，且具有二縮酮合成酶的活性。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為c)，且具有單加氧酶活性。
61.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為d)，且具有氧化還原酶活性。
62.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為e)，且具有去氫酶活性。
63.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為f)，且具有轉(zhuǎn)酯酶活性。
64.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子，其中該多肽為g)，且具有HMG-CoA還原酶活性。
65.根據(jù)權(quán)利要求55項(xiàng)所述的分離的DNA分子，其中該多肽為h)，且具有轉(zhuǎn)錄因子活性。
66.根據(jù)權(quán)利要求55所述的分離的D NA分子，其中該多肽為i)，且具有外排泵活性。
67.一種表達(dá)載體，其包括如權(quán)利要求55所述的分離的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及生成合成膽固醇合成抑制劑莫那可林K的相關(guān)基因，紅曲菌生成的膽固醇合成抑制劑莫那可林k為聚縮酮的二次代謝產(chǎn)物。本發(fā)明提供一種專一于莫那可林K生合成基因群的探針，由BAC基因庫(kù)篩選出具有推定莫那可林K基因群的BAC轉(zhuǎn)殖株，并經(jīng)定序與批注，得到相關(guān)于莫那可林K生合成的2個(gè)聚縮酮合成酶基因，以及7個(gè)調(diào)控基因。經(jīng)RT－PCR得到上述基因的全長(zhǎng)cDNA，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)載體上以表達(dá)上述基因。本發(fā)明還提供了增加莫那可林k生成的方法，提高了生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1637143SQ20041010258
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者陳煜沛, 廖麗玲, 王俊霖, 李鐘財(cái), 黃英娥, 曾慶平, 袁國(guó)芳 申請(qǐng)人:食品工業(yè)發(fā)展研究所