本發(fā)明涉及一種快速、同時檢測沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的引物探針組合物以及多重實時熒光PCR的檢測方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術：

沙門氏菌(Salmonella)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)、志賀氏菌(Shigella Castellani)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是五種常見的食源性致病菌，也是我國食品國家衛(wèi)生標準中致病菌檢測的5項重要指標。其中沙門氏菌是是公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細菌科，包括那些引起食物中毒，導致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細菌。它們除可感染人外，還可感染很多動物包括哺乳類、鳥、爬行類、魚、兩棲類及昆蟲。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產力。創(chuàng)傷弧菌廣泛分布在海水中，可從牡蠣等海產品中分離得到。本菌主要通過傷口接觸海水造成感染，也可經(jīng)口感染。經(jīng)傷口感染時可導致蜂窩織炎及骨髓炎等多種炎癥，經(jīng)口感染時常迅速導致菌血癥或敗血癥。感染本菌后如不及時治療，病死率很高。志賀氏菌通稱痢疾桿菌，是引起人類細菌性痢疾的主要病原菌。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。單增李斯特菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一?，F(xiàn)階段國家標準中對上述致病菌的檢測主要依靠傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)、生化鑒定的方法，步驟復雜、檢測周期長，已不能完全適應大規(guī)?？焖贆z測的需要。近些年來，隨著分子生物學的發(fā)展，PCR和實時熒光定量PCR技術逐漸走進食品中致病菌的檢測。而且實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期短、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。由于多重實施熒光定量PCR引物之間的交叉影響，Mg²⁺的濃度、不同引物探針所需添加量的不同等因素的存在。致使現(xiàn)階段運用實時熒光定量PCR檢測多是單重實時熒光定量PCR檢測法，可同時檢測多個目的基因的檢測體系較少，因此，建立一種以多重實時熒光定量PCR為基礎的食品中沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的快速同時檢測方法是具有實踐意義的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可同時鑒別沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的引物探針組合物，該組合物能快速的鑒別沙門氏菌的特異性invA基因、創(chuàng)傷弧菌的特異性vvhA基因、志賀氏菌的特異性ipaH基因、金黃色葡萄球菌的特異性nuc基因，單增李斯特菌的特異性prfA基因，特異性強，靈敏度高。

一種同時檢測五種致病菌的引物探針組合物，包括表1中所示的SEQ ID No.1-15的序列，其中SEQ ID No.1、2、4、5、7、8、10、11、13、14分別為引物序列invA-F、invA-R、vvhA-F、vvhA-R、ipaH-F、ipaH-R、nuc-F、nuc-R、prfA-F、prfA-R，SEQ ID No.3、6、9、12、15分別為探針序列invA-P、vvhA-P、ipaH-P、nuc-P、prfA-P；所述各探針序列的5’端均修飾有報告基團，3’端均修飾有淬滅基團；所述報告基團有：FAM、FITC、HEX、JOE、CY3，淬滅基團有：TAMRA，BHQ、Eclipse；所述五種致病菌為沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌。

表1本發(fā)明同時檢測五種致病菌的引物探針組合物

進一步地，所述SEQ ID No.1-15的序列，應用于熒光定量PCR反應中，反應體系中各序列的用量為invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM。以上引物探針用量，均于建立五重實施熒光定量PCR反應體系時，經(jīng)實驗驗證，在此濃度下此反應體系才能最好的擴增各目的基因。否則會出現(xiàn)擴增不充分、反應失敗等嚴重后果。

本發(fā)明的另一目的是提供一種同時檢測五種致病菌的多重實時熒光PCR方法，包括以下步驟：

(1)、提取待檢樣本的基因組DNA，備用；

(2)、將提取的基因組DNA作為模板加入到五重實時熒光定量PCR反應體系中，所述反應體系為：Taq酶1-4U、Mg²⁺5mM、dNTP 300μM、pH8.3的Tris-HCl 100mM、KCl 500mM、invA-F 0.6μM、invA-R 0.6μM、invA-P 0.3μM、vvhA-F 0.4μM、vvhA-R 0.4μM、vvhA-P 0.3μM、ipaH-F 0.6μM、ipaH-R 0.6μM、ipaH-P 0.7μM、nuc-F 0.4μM、nuc-R 0.4μM、nuc-P 0.3μM、prfA-F 0.3μM、prfA-R 0.3μM、prfA-P 0.4μM、模板100-200ng，補水至25μL；

(3)、將反應體系放置于實時熒光定量PCR儀中，反應程序為95℃25s→95℃3s，60℃25-60s，40個循環(huán)；收集PCR擴增過程中的熒光信號，若待測樣本中某基因的Ct值小于36，則判斷該樣本含擁有該基因的致病菌；若待測樣本中某基因的Ct值大于等于36，則判斷該樣本不含有擁有該基因的致病菌。

一種同時檢測五種致病菌的試劑盒，主要包括熒光定量2×PCR mix，所述2×PCR mix包含以下組份：Taq酶2-8U、Mg²⁺10mM、dNTP 600μM、pH8.3的Tris-HCl 200mM、KCl 1000mM、invA-F 1.2μM、invA-R 1.2μM、invA-P 0.6μM、vvhA-F 0.8μM、vvhA-R 0.8μM、vvhA-P 0.6μM、ipaH-F 1.2μM、ipaH-R 1.2μM、ipaH-P 1.4μM、nuc-F 0.8μM、nuc-R 0.8μM、nuc-P 0.6μM、prfA-F 0.6μM、prfA-R 0.6μM、prfA-P 0.8μM。

進一步地，上述同時檢測五種致病菌的試劑盒，其使用方法為：吸取PCR mix 12.5μL，加入100-200ng DNA模板，補水至25μL組成PCR反應體系。

本發(fā)明分別針對沙門氏菌的特異性invA基因、創(chuàng)傷弧菌的特異性vvhA基因、志賀氏菌的特異性ipaH基因、金黃色葡萄球菌的特異性nuc基因，單增李斯特菌的特異性prfA基因設計特異性上下游引物，以及各基因不同熒光素標記的Taqman探針，并采用實時熒光定量PCR技術，對DNA分子進行標記，可實現(xiàn)對相關基因及致病菌的快速準確檢測。

本發(fā)明的一種多重實時熒光定量PCR的檢測方法，可在同一反應體系中，同時檢測沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌五種致病菌。且運用五重實時熒光定量PCR法對這五種致病菌進行檢測，可提高檢測的靈敏度、特異性、并可大幅度的提高檢測效率，彌補了常規(guī)檢測所存在的步驟復雜、檢測周期長，不能適應大規(guī)模快速檢測的缺陷。

附圖說明

圖1五重實時熒光定量PCR擴增曲線。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下述實施例中，所用實驗材料，試劑與儀器如下：

(1)、實驗材料

DNAiso Reagent*：日本TAKARA公司(9770Q)；

Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseH Plus)，ROX plus*：日本TAKARA公司(RR39LR)；

RNA酶(RT405-01)、蛋白酶K(10401ES60)、溶菌酶(A0702)等：購于青島百木生生物有限公司；

引物與雙標記Taqman探針均委托TAKARA公司合成。

(2)、儀器與設備

實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司，ABI7500Fast；

高速離心機：湘儀TG16-WS；

全自動核酸提取儀：杭州博日科技有限公司NPA-32+；

超微量分光光度計：eppendorf(AG22331Hamburg)。

實施例1引物及探針的設計

依據(jù)沙門氏菌invA基因序列(geneID：1254419)、創(chuàng)傷弧菌vvhA基因序列(gene ID：2827959)、志賀氏菌ipaH基因序列(gene ID：3776622)、金黃色葡萄球菌nuc基因序列(gene ID：767621)、單增李斯特菌prfA基因序列(gene ID：2744465)，利用引物設計軟件PrimerExpress3.0，我們分別設計沙門氏菌的特異性invA基因、創(chuàng)傷弧菌的特異性vvhA基因、志賀氏菌的特異性ipaH基因、金黃色葡萄球菌的特異性nuc基因，單增李斯特菌的特異性prfA基因的上下游引物，以及各基因不同熒光素標記的Taqman探針。

對所設計的引物進行以下分析：引物間的干擾，發(fā)卡結構和二聚體。并通過NCBI的BLAST功能對其特異性進行初步鑒定。經(jīng)篩選，排除了引物自身及引物之間存在互補序列、擴增產物的單鏈能形成二級結構的引物，選留如表1所示的引物及探針序列。

對表1的5對引物對進行單一熒光定量PCR驗證，單一PCR采用25μL反應體系：0.25μL(5U/μL)Taq酶，0.375μL(5U/μL)UNG酶，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs混合物，2.5μL MgCl₂(25mM)，正反向引物各1μL，探針2μL，模板DNA 2μL(DNA濃度為50ng/μL)，加雙蒸水補足至25μL。所加引物終濃度均為0.2pmol/μL。

經(jīng)實驗驗證，沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的單重檢測結果如表2：

表2單一熒光定量PCR引物驗證結果

結果表明實驗所設計的引物探針均能夠滿足檢測要求。

實施例2多重熒光定量PCR最佳反應條件的確定

采用表1中的引物、探針及多重實時熒光定量PCR檢測方法檢測沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的方法步驟如下：

(1)DNA提?。?/p>

沸水浴法提取細菌DNA。具體操作為挑取瓊脂上純培養(yǎng)的單個菌落加入100μL滅菌的雙蒸水中，震蕩混勻后置沸水浴中煮沸10min，室溫靜置，至其降至室溫后12000r/min離心2min，取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)單重實時熒光定量PCR體系的建立及條件優(yōu)化

用TAKARA的Premix Ex Taq試劑作為反應體系，選定不同的退火溫度：

PCR反應條件一為：95℃預變性1min，95℃變性3s，55℃退火后延伸1min。

PCR反應條件二為：95℃預變性1min，95℃變性3s，60℃退火后延伸1min。

PCR反應條件三為：95℃預變性1min，95℃變性3s，62℃退火后延伸1min。

每個反應體系均在退火階段收集熒光，40個循環(huán)。隨后對五個基因的引物探針的濃度進行優(yōu)化，引物濃度優(yōu)化范圍為0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度為0.1μmol/L。探針濃度優(yōu)化范圍為0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度為0.1μmol/L。根據(jù)擴增曲線的Ct值和△Rn值來選擇適宜的引物和探針濃度組合。

當退火溫度為55℃時，五個基因均未出現(xiàn)平滑的擴增曲線，當退火溫度為62℃時，invA基因、nuc基因、prfA基因出現(xiàn)△Rn值偏低，Ct值增大等現(xiàn)象。因此本發(fā)明所選的PCR反應條件為：95℃預變性1min，95℃變性3s，60℃退火后延伸1min，退火階段收集熒光，40個循環(huán)。在這個反應條件下，五個基因均能擴增出Ct值偏低，△Rn值最大且擴增曲線平滑的結果。

經(jīng)比較Ct值、△Rn值以及擴增曲線。最終確定五個基因的引物探針濃度范圍為：invA基因的引物濃度為0.3μmol/L-0.7μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L-0.4μmol/L；vvhA基因的引物濃度為0.2μmol/L-0.5μmol/L，探針濃度為0.2μmol/L-0.4μmol/L；ipaH基因的引物濃度為0.3μmol/L-0.7μmol/L，探針濃度為0.6μmol/L-0.8μmol/L；nuc基因的引物濃度為0.3μmol/L-0.7μmol/L，探針濃度為0.2μmol/L-0.5μmol/L；prfA基因的引物濃度為0.3μmol/L-0.6μmol/L，探針濃度為0.2μmol/L-0.5μmol/L。PCR反應體系為TAKARA的Premix Ex taq試劑12.5μL，相應量的各個引物探針組合，模板2μL(DNA濃度為50ng/μL)，加無RNA酶水至25μL。

(3)五重實時熒光定量PCR的建立及條件優(yōu)化

3.1引物、探針濃度的優(yōu)化

PCR反應體系為TAKARA的Premix Ex Taq試劑12.5μL，以五種細菌基因組DNA混合液為模板進行多重實時熒光定量PCR實驗，各基因組DNA在PCR反應體系中的量均為100ng，相應量的各個引物探針組合，加無RNA酶水至25μL。PCR反應條件為：95℃預變性1min，95℃變性3s，60℃退火后延伸1min，退火階段收集熒光，40個循環(huán)。在單重實時熒光定量PCR的基礎上，取合理的引物探針濃度組合進行優(yōu)化。先確定invA基因和vvhA基因的最佳引物探針濃度，再以此為基礎確定ipaH基因的引物探針最佳濃度，建立三重實時熒光定量PCR反應體系。然后在此三重實時熒光定量PCR的基礎上確定nuc基因的最佳引物探針濃度，建立四重實時熒光定量PCR，最后以此四重實時熒光定量PCR為基礎，確定prfA基因的引物探針濃度。在優(yōu)化引物探針的濃度時，選擇上下游引物濃度均相同，以Ct值最小、△Rn值最大且擴增曲線平滑、有明顯的對數(shù)期和平臺期時最低引物和探針濃度為標準來進行選取最佳的引物探針濃度。

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，invA基因和vvhA基因在同一反應體系中，可同時擴增。當invA基因引物濃度為0.6μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L，vvhA基因引物濃度為0.4μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L時，兩者的Ct值較低且△Rn值較高、有平滑的擴增曲線和明顯的對數(shù)期和平臺期；同時兩基因的Ct值和△Rn值差異性最小，擴增效率最接近，因此確定為最佳雙重實時熒光定量PCR的引物探針濃度。當加入ipaH基因的引物探針時，于引物濃度為0.6μmol/L，探針濃度為0.7μmol/L處，三基因在同一反應中△Rn值差異性最小，且invA基因和vvhA基因的Ct值和△Rn值及擴增曲線與雙重時最相似。當加入nuc基因的引物探針時，于引物濃度為0.4μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L處，Ct值較低且△Rn值較高、有平滑的擴增曲線和明顯的對數(shù)期和平臺期；且invA基因、vvhA基因和ipaH基因的Ct值和△Rn值及擴增曲線與三重時最相似。當加入prfA基因的引物探針時，于引物濃度為0.3μmol/L，探針濃度為0.4μmol/L處，Ct值較低且△Rn值較高、有平滑的擴增曲線和明顯的對數(shù)期和平臺期；且invA基因、vvhA基因、ipaH基因和nuc基因的Ct值和△Rn值及擴增曲線與四重時最相似。因此本發(fā)明最終的引物探針組合為：invA基因引物濃度為0.6μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L；vvhA基因引物濃度為0.4μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L；ipaH基因的引物濃度為0.6μmol/L，探針濃度為0.7μmol/L；nuc基因的引物濃度為0.4μmol/L，探針濃度為0.3μmol/L；prfA基因的引物濃度為0.3μmol/L，探針濃度為0.4μmol/L。

3.2Mg²⁺和Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)化

Mg²⁺濃度優(yōu)化范圍為1.0mmol/L-9.0mmol/L，梯度為1.0mmol/L，DNA聚合酶優(yōu)化范圍擴大為1.0U-5.0U，梯度為1.0U；實驗結果顯示當Mg²⁺濃度為5.0mmol/L，Taq DNA聚合酶濃度為4U時，反應所得結果最優(yōu)，因此最終得到的五重實時熒光定量PCR反應體系如下表所示：

表3五重實時熒光定量PCR反應體系

反應條件為95℃預變性1min，95℃變性3s，60℃退火后延伸1min，退火階段收集熒光，40個循環(huán)。五重實時熒光定量PCR擴增曲線如圖1所示，所檢五種致病菌目的基因均有平滑的擴增曲線和明顯的對數(shù)期和平臺期，且Ct值均小于36，說明本反應體系可滿足五重實時熒光定量PCR的反應要求。

待測樣本檢測結果判定：

①若測試樣品中某基因的Ct值小于36，則判斷該樣品含擁有該基因的致病菌。

②若測試樣品中某基因的Ct值大于等于36，則判斷該樣品不含有擁有該基因的致病菌。

實施例3對五種致病菌的特異性檢測

(1)為了驗證探針及引物的性能，進行特異性試驗：

將40種已知菌株快速擴增后，分別使用單重和多重實時熒光定量PCR方法(采用實施例2確定的PCR體系及反應條件)對目標致病菌進行檢測。使用特異性引物及探針對相應的目標致病菌進行單重實時熒光定量PCR反應，所檢基因的Ct值均小于36，使用混合引物探針對這40種已知菌株進行多重實時熒光定量PCR檢測，檢測結果與設計完全相符：五種目標致病菌均出現(xiàn)相應報告基團的擴增，對其他已知菌株均未出現(xiàn)擴增情況。

表4多重實時熒光定量PCR檢測的特異性檢測

通過以上結果可以看出，5對引物、探針僅針對相對應的致病菌具有Ct值，且Ct值均小于36；而其他樣本沒有擴增。由此可見本實驗設計的引物探針具有很高的物種特異性。

(2)基因組DNA靈敏度試驗

根據(jù)國標GB4789.2-2010《食品微生物檢驗-菌落總數(shù)測定》計數(shù)當前所用菌液中菌落形成單位數(shù)，無菌操作將其稀釋成10⁰cfu/ml-10¹⁰cfu/ml系列濃度梯度后，用沸水浴法提取DNA模板，取各濃度菌液模板2μL(DNA濃度為50ng/μL)進行實時熒光PCR擴增，并依據(jù)濃度梯度的擴增曲線Ct值，計算該方法的檢出限。

結果顯示，當菌液濃度小于10²cfu/ml時，invA基因、vvhA基因、ipaH基因、nuc基因、prfA基因都未出現(xiàn)擴增曲線，表明濃度已經(jīng)超出了本方法所能檢測的限度。因此該方法對invA基因、vvhA基因、ipaH基因、nuc基因、prfA基因的檢出限為10²cfu/ml。

(3)重復性試驗驗證

分別提取沙門氏菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的DNA，每種致病菌提取3個樣本DNA，按照上述優(yōu)化好的體系、PCR條件進行五重實時熒光定量PCR，每個樣本進行3次復孔的獨立重復，考察方法的穩(wěn)定性，結果如表5。

表5多重實時熒光定量PCR檢測的重復性驗證

表5中Ct mean表示Ct的平均值，Ct SD表示Ct的標準方差，從表5中可以看出，每個樣本的3次獨立重復實驗的Ct值的標準方差均小于0.5，說明檢測結果的重復性好，檢測的穩(wěn)定性高。

本方法所采用的五重實施熒光定量PCR法，可在同一反應體系中同時檢測五種致病菌，不但彌補了傳統(tǒng)檢測所需的細菌培養(yǎng)、生化鑒定的方法中存在的步驟復雜、檢測周期長、不適用于大規(guī)模檢測等缺點，還在實施熒光定量PCR檢測的基礎上，將工作效率提高了五倍。大大提升了對這五種致病菌檢測的效率。

應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島捷安信檢驗技術服務有限公司

<120> 一種同時檢測五種致病菌的引物探針組合物及多重實時熒光PCR方法

<130> 2017

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Salmonella

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<212> DNA

<213> Salmonella

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<212> DNA

<213> Salmonella

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tcaatgcgtt ggaaaggatc actagctgt 29

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Vibrio Vulnificus

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<213> Vibrio Vulnificus

<400> 6

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<212> DNA

<213> Shigella Castellani

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tccgatccgt ctgtgcgcac aa 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Shigella Castellani

<400> 8

agcgaaagat gctgtcgaag ct 22

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<212> DNA

<213> Shigella Castellani

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<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

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cgcatctagt tgcttagtct taactttagt tg 32

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<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

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tgcactatat actgttggat cttcagaa 28

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<213> Staphylococcus aureus

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attgttcttc caccgtgatt ccgaa 25