本實用新型涉及生物檢測領(lǐng)域，具體的，本實用新型涉及檢測肺癌標志物的試劑盒。
背景技術(shù)：
：作為全球最常見的癌癥之一，肺癌威脅著人類的健康，其高死亡率占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的19％。精確的診斷可以顯著提高患者的5年生存率和降低肺癌管理的醫(yī)療費用。因此，發(fā)展一種高靈敏和高特異性的肺癌檢測診斷技術(shù)，顯得至關(guān)重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本實用新型旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。本實用新型是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：本實用新型人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)肺癌檢測技術(shù)包括Luminex技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附檢測的聯(lián)合檢測，具重復(fù)性好和線性范圍廣的優(yōu)點，還能滿足高通量臨床診斷的需求，只是檢測樣品的消耗量較高而不利于大規(guī)模的臨床診斷。而且，采用循環(huán)生物標記物檢測肺癌的技術(shù)，可以用血液為樣本，并通過簡單的即時診斷技術(shù)來實現(xiàn)非侵入式的檢測，但是，以這些標記物為基礎(chǔ)的檢測方法的靈敏度和特異性遠未達到理想的程度。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，等離子體金芯片(以下簡稱p-GOLDchip)之類的等離子體貴金屬層，具有特殊納米微觀結(jié)構(gòu)，其表面分布著許多非連續(xù)的金島，并且金島間距離均勻，每個金島的大小都在納米級，這種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體共振特性，能夠增強近紅外(波長在650～1700nm)的熒光效應(yīng)和拉曼散射效應(yīng)。因此，發(fā)明人在上表面具有等離子體貴金屬層的玻璃基體上，將3種肺癌標志物的捕獲抗體分別固定到檢測陣列中；再將固定有捕獲抗體的近紅外熒光增強蛋白芯片依次與人體液樣品、熒光染料標記的檢測抗體接觸，然后通過熒光檢測來同時測定出人體液樣品中3種肺癌標記物的濃度值，如此能夠提高檢測的靈敏度和特異性。有鑒于此，本實用新型的一個目的在于提出一種高靈敏性、高特異性、高通量、多指標和低耗損的檢測肺癌標志物的試劑盒。在本實用新型的第一方面，本實用新型提出了一種檢測肺癌標志物的試劑盒。下面參考圖17所示的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，進行詳細的說明。根據(jù)本實用新型的實施例，所述肺癌標志物包括癌胚抗原、細胞角蛋白19的可溶性片段和神經(jīng)元特異性烯醇化酶，且所述試劑盒包括近紅外熒光增強蛋白芯片100、檢測抗體和捕獲抗體；其中，所述近紅外熒光增強蛋白芯片100包括：玻璃基底110，和等離子體貴金屬層120，所述等離子體貴金屬層120設(shè)置在所述玻璃基底110上，且所述等離子體貴金屬層120上設(shè)有檢測陣列200；所述捕獲抗體固定在所述檢測陣列200上，且用于特異性捕獲所述肺癌標志物；所述檢測抗體攜帶有可檢測的熒光標記，且用于與所述肺癌標志物特異性結(jié)合。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤標志物是腫瘤細胞本身存在或分泌的特異性物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物中大部分存在于惡性腫瘤、良性腫瘤、胚胎組織甚至正常組織中。對于肺癌而言，癌胚抗原(CEA)是非小細胞肺癌的腫瘤標志物，細胞角蛋白19的可溶性片段(Cyfra21-1)是非小細胞肺癌的腫瘤標志物，以及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是小細胞肺癌的腫瘤標志物?，F(xiàn)階段，單一腫瘤標志物的檢測在肺癌中的靈敏度或特異性均欠佳。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過研究又發(fā)現(xiàn)，捕獲抗體的一端被固定在近紅外熒光增強蛋白芯片100的等離子體貴金屬層120的檢測陣列上，另一端的位點可與特定的肺癌標志物發(fā)生特異性結(jié)合，從而可從待測的人體液樣品中同時檢測三種肺癌標志物。同時，近紅外熒光增強蛋白芯片100捕獲的肺癌標志物還可與檢測抗體也發(fā)生特異性結(jié)合，從而使被熒光染料標記的檢測抗體也被捕獲在近紅外熒光增強蛋白芯片上，再在熒光下獲得檢測陣列200的熒光強度，通過查看與熒光強度對應(yīng)的肺癌標志物濃度值，即可高效地檢測出人體液樣品中各種肺癌標志物的濃度。并且，近紅外熒光增強蛋白芯片100上的等離子體貴金屬層120能夠增強兩個數(shù)量級的近紅外熒光強度，從而提高檢測的靈敏性、并降低樣品消耗量。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用本實用新型實施例的檢測肺癌標志物的試劑盒，能夠同時進行多項組合檢測，滿足高通量臨床診斷的需求，且與單項標志物檢測相比具有更高的靈敏性和特異性，以及更低的檢測極限(LOD)和定量檢測限(LOQ)，而且只需一滴人體液(1～10微升)的低樣品消耗量，降低了檢測費用，可用于大規(guī)模的臨床診斷。另外，根據(jù)本實用新型上述實施例的檢測肺癌標志物的試劑盒，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：根據(jù)本實用新型的實施例，所述等離子體貴金屬層為等離子體金層或等離子銀層，且所述等離子體貴金屬層具有非連續(xù)的納米島狀結(jié)構(gòu)。本實用新型的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，等離子體貴金屬層120具有特殊納米微觀結(jié)構(gòu)，其表面分布著許多非連續(xù)的島，并且島間距離均勻，每個島的大小都在納米級，這種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體共振特性，能夠增強近紅外光的熒光效應(yīng)。由此，采用本實用新型實施例的等離子體貴金屬層，能夠進一步增強試劑盒檢測的熒光強度，從而可更高靈敏地、更高特異性地、并能夠定量地檢測出肺癌標志物，而且只需要消耗更少的人體液樣品。根據(jù)本實用新型的實施例，所述納米島狀結(jié)構(gòu)的相鄰島之間的距離為1～50nm，優(yōu)選為10nm。本實用新型的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，等離子體貴金屬層表面分布的非連續(xù)的島間距離均勻，大致在1～50nm之間。這種非連續(xù)的均勻的島間距離，增強了在近紅外(波長在650～1700nm)的等離子體共振，增強了在近紅外的熒光效應(yīng)和拉曼散射效應(yīng)。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過長期研究還發(fā)現(xiàn)，非連續(xù)的島間距離主要在10nm區(qū)間。由此，采用本實用新型實施例的等離子體貴金屬層，能夠進一步增強試劑盒檢測的熒光強度，從而可更高靈敏地、更高特異性地、并能夠定量地檢測出肺癌標志物，而且只需要消耗更少的人體液樣品。根據(jù)本實用新型的實施例，所述納米島狀結(jié)構(gòu)的島面積為1000～100000nm2。本實用新型的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，等離子體貴金屬層表面分布的非連續(xù)的島，每個島的大小都在納米級，這種結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體共振特性，能夠增強近紅外光的熒光效應(yīng)。由此，采用本實用新型實施例的等離子體貴金屬層，能夠進一步增強試劑盒檢測的熒光強度，從而可更高靈敏地、更高特異性地、并能夠定量地檢測出肺癌標志物，而且只需要消耗更少的人體液樣品。根據(jù)本實用新型的實施例，所述等離子體貴金屬層120的厚度為20～200nm。本實用新型的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，由于納米空隙之間的局域電場增強、以及等離子體與近紅外熒光染料之間的共振效應(yīng)，具有納米結(jié)構(gòu)的近紅外熒光增強蛋白芯片可提供大約兩個數(shù)量級的近紅外熒光增強效果。同時，本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，等離子體貴金屬層120的厚度為20～200nm的熒光增強效應(yīng)最好，因為離子體貴金屬層的厚度小于20nm則無法起到熒光增強的效果，而厚度超過200nm后會失去特殊的納米結(jié)構(gòu)才具有的等離子體共振特性而沒有熒光增強效應(yīng)。由此，采用本實用新型實施例的等離子體貴金屬層，能夠進一步增強并成百倍地增強試劑盒檢測的熒光強度，從而可更高靈敏地、更高特異性地、并能夠定量地檢測出肺癌標志物，并且檢測極限和定量檢測限都更低，而且只需一滴人體液的低樣品消耗量。根據(jù)本實用新型的實施例，所述檢測陣列200包含多個陣列排布的檢測點；任選地，所述檢測點為圓形，且所述檢測點的直徑為300～500微米。需要說明的是，“多個”可理解為兩個及兩個以上。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，采用陣列排布的方式，在提高單項檢測準確性的基礎(chǔ)上，還可實現(xiàn)聯(lián)合多項的檢測。具體的例如，根據(jù)本實用新型的實施例檢測點采用3×3的陣列排布，形成固定有三種不同種類的捕獲抗體的檢測陣列，其中每一行都是同一種類的捕獲抗體，每行分布有3個檢測點可提高針對同一種肺癌標志物的單項檢測準確性，而且每列分布著三種不同種類的捕獲抗體，可實現(xiàn)同時對人體液中三種肺癌標志物的聯(lián)合檢測，以此來提高檢測的靈敏性和特異性。本實用新型的發(fā)明人經(jīng)過研究還發(fā)現(xiàn)，借助打印技術(shù)可將特定的肺癌標志物的捕獲抗體，固定到近紅外熒光增強蛋白芯片上特定的檢測點上，打印出的檢測點形狀具體為圓形的斑點狀。并且，根據(jù)本實用新型的實施例，每個檢測點可定量打印上捕獲抗體，且重復(fù)打印3次后，打印出的檢測點直徑為300～500微米。由此，采用本實用新型實施例的檢測陣列，借助微液滴打印技術(shù)可在檢測陣列的特定檢測點上獲得等量的特定肺癌標志物的捕獲抗體，并能夠直觀清晰地顯示出近紅外熒光增強蛋白芯片上對三種肺癌標志物的獨立檢測結(jié)果，還可通過聯(lián)合多項檢測的實現(xiàn)，既可提高單項檢測的準確性，還可提高檢測的靈敏性和特異性。根據(jù)本實用新型的實施例，所述捕獲抗體包括第一捕獲抗體、第二捕獲抗體和第三捕獲抗體，所述第一捕獲抗體、所述第二捕獲抗體和所述第三捕獲抗體分別特異性捕獲所述癌胚抗原、所述細胞角蛋白19的可溶性片段和所述神經(jīng)元特異性烯醇化酶。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，蛋白芯片上固定的捕獲抗體，能夠與肺癌標志物特異性地結(jié)合，從而從微量的人體液樣品中檢測到肺癌標志物的存在。因此，針對三種典型的肺癌標志物，本實用新型的發(fā)明人選擇了癌胚抗原的捕獲抗體、細胞角蛋白19的可溶性片段的捕獲抗體和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的捕獲抗體。需要說明的是，本實用新型對捕獲抗體的具體類型不做具體的限定，只需要捕獲抗體能夠捕獲特定的肺癌標志物即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要進行選擇。由此，采用本實用新型實施例的特定捕獲抗體，就能夠同時高效地捕獲到人體液樣品中存在的三種特定的肺癌標志物，再通過被標記的檢測抗體在熒光下的顯示作用，即可高靈敏性地、高特異性地檢測出肺癌標志物。根據(jù)本實用新型的實施例，所述癌胚抗原的捕獲抗體、所述第一捕獲抗體、第二捕獲抗體和第三捕獲抗體分別固定在所述檢測陣列的不同檢測點上；優(yōu)選的，所述第一捕獲抗體、第二捕獲抗體和第三捕獲抗體分別固定在所述檢測陣列的不同行或列上。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用陣列排布的檢測點后，每行檢測點都可打印上同一肺癌標志物的捕獲抗體，從而可提高各個單項檢測準確性，同時，三項聯(lián)合檢測可提高綜合檢測的靈敏性和特異性。具體的例如，根據(jù)本實用新型的實施例，3×3的陣列排布的檢測點中，第一行分布的是癌胚抗原的捕獲抗體，第二行分布的是細胞角蛋白19的可溶性片段的捕獲抗體，而第三行分布的是神經(jīng)元特異性烯醇化酶的捕獲抗體，如此分行地分布能夠有效地區(qū)分三種肺癌標志物的檢測結(jié)果，并且減少交叉檢測的干擾。由此，采用本實用新型實施例的捕獲抗體的特定分布，可直觀清晰地顯示出近紅外熒光增強蛋白芯片上對三種肺癌標志物的獨立檢測結(jié)果，并盡可能地減少交叉檢測帶來的互相干擾。根據(jù)本實用新型的實施例，所述熒光標記為熒光染料，且所述熒光染料為IRDye800；并且所述檢測抗體包括第一檢測抗體、第二檢測抗體和第三檢測抗體，所述第一檢測抗體、第二檢測抗體和第三檢測抗體分別對應(yīng)與所述癌胚抗原、所述細胞角蛋白19的可溶性片段和所述神經(jīng)元特異性烯醇化酶特異性結(jié)合。發(fā)明人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，熒光染料IRDye800是蛋白質(zhì)和抗體標記的理想選擇，IRDye800具有高水溶性，高耐鹽性以及低非特異性結(jié)合，可以保持準確的熒光強度。并且，被IRDye800標記后的檢測抗體，不僅可與人體液樣品中肺癌標志物特異性地結(jié)合，還能夠在熒光檢測中通過熒光強度定量地顯示出的濃度。發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，與捕獲抗體的功能類似，后加入的檢測抗體可與蛋白芯片上捕獲的肺癌標志物發(fā)生進一步的特異性結(jié)合，同時，被IRDye800標記的檢測蛋白在熒光下會顯現(xiàn)，從而使試劑盒能夠檢測出微量的人體液樣品中肺癌標志物的存在。因此，針對三種典型的肺癌標志物，本實用新型的發(fā)明人選擇了癌胚抗原的檢測抗體、細胞角蛋白19的可溶性片段的檢測抗體和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的檢測獲抗體。同樣需要說明的是，本實用新型對檢測抗體的具體類型不做具體的限定，只需要捕獲抗體能夠捕獲特定的肺癌標志物即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要進行選擇。由此，采用本實用新型實施例的捕獲抗體，通過被熒光染料標記，能夠在熒光檢測中同時顯示出被近紅外熒光增強蛋白芯片捕獲的三種肺癌標志物，熒光檢測的結(jié)果更直觀，還可高靈敏性地、高特異性地、定量地檢測出人體液樣品中肺癌標志物的濃度。本實用新型的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本實用新型的實踐了解到。附圖說明本實用新型的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1是根據(jù)本實用新型的一個實施例的近紅外熒光增強蛋白芯片的掃描電鏡圖；圖2是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的消光光譜圖；圖3是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的不同濃度的CEA樣品的熒光掃描圖；圖4是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的不同濃度的Cyfra21-1樣品的熒光掃描圖；圖5是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的不同濃度的NSE樣品的熒光掃描圖；圖6是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種標志物在3種基底上的標準曲線對比圖；圖7是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種基底的數(shù)據(jù)誤差分析圖；圖8是根據(jù)本實用新型的一個對比例的3種標志物的標準曲線對比圖；圖9是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種單項肺癌標志物的熒光掃描圖；圖10是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種單項肺癌標志物的數(shù)據(jù)誤差分析圖；圖11是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種雙項肺癌標志物的熒光掃描圖；圖12是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的3種雙項肺癌標志物的數(shù)據(jù)誤差分析圖；圖13是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的4個血液樣品的3種標志物的檢測結(jié)果柱狀圖；圖14是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的一系列血液樣品的檢測濃度與熒光強度的相關(guān)性分布圖；圖15是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的一系列血液樣品的檢測誤差分析圖；圖16是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的一系列血液樣品的3種標志物的pGOLD芯片和Luminex檢測的對比圖；以及圖17是根據(jù)本實用新型的另一個實施例的檢測肺癌標志物的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖標記100近紅外熒光增強蛋白芯片110玻璃基底120等離子體貴金屬層200檢測陣列具體實施方式下面詳細描述本實用新型的實施例，本
技術(shù)領(lǐng)域：
人員會理解，下面實施例旨在用于解釋本實用新型，而不應(yīng)視為對本實用新型的限制。除非特別說明，在下面實施例中沒有明確描述具體技術(shù)或條件的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照本領(lǐng)域內(nèi)的常用的技術(shù)或條件或按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可市購到的常規(guī)產(chǎn)品。除非明確說明，在下列實施例中采用下述制備方法和測試條件：儀器型號和測試條件：磁控檢測儀，中國沈陽科晶自動儀器有限公司，GSL-1100X-SPC-16M；掃描電子顯微鏡，日立S-4800，加速電壓為10.0kV；分光光度計，UV1901PC；打印機，GeSimNano-PlotterTM2.1；多功能流式細胞點陣儀，Luminex200；以及熒光掃描器，LI-COROdyssey，采用800納米通道，激光波長為785nm，激光強度為7.0，分辨率為20微米，掃描獲得的圖像為16位灰度，并借助軟件ImageStudioVersion3.1.4分析圖像。試劑：捕獲抗體(包括CEA、Cyfra21-1和NSE的捕獲抗體)、檢測抗體(包括CEA、Cyfra21-1和NSE的檢測抗體)、CEA校準品、CYFRA21-1校準品、NSE校準品、CEA定量檢測試劑盒、CYFRA21-1定量檢測試劑盒以及NSE定量檢測試劑盒，都是購自上海Tellgen生命科學(xué)公司，800CWNHS酯是購自LI-COR公司，PBS、FBS、PBST和吐溫20購自Sigma-Aldrich公司，環(huán)氧基改性玻璃芯片(規(guī)格為75毫米×25毫米)購自博奧公司。肺癌患者血液樣品：所有樣品均在上海胸科醫(yī)院收集；其中，將3毫升的血液吸引到一個EDTA管，并分成等份用于血液試驗；對于血清試驗，將3毫升的血液加入至血清管中，并在每分鐘3000轉(zhuǎn)的條件下離心15分鐘，收集離心管的上清液；并且，所有樣品使用前儲存在-20℃條件下。實施例1在該實施例中，制備出近紅外熒光增強蛋白芯片。具體的制備方法為，在環(huán)氧基改性玻璃芯片的表面，通過磁控檢測儀在40毫安電流的真空環(huán)境下表面進行4分鐘的金濺射處理，系統(tǒng)的沉積壓強為0.1mbar；再浸入濃度為3mmol/L的氯金酸溶液中，按照1:50的體積比加入濃度為0.15mol/L的氨水，振蕩1分鐘；去離子水洗滌，然后將其浸漬在濃度為1mmol/L的硼氫化鈉溶液，浸漬1分鐘；再用去離子水洗滌一次，并浸漬在濃度為0.5mmol/L的氯金酸和濃度為0.5mmol/L羥胺組成的混合溶液中，搖動5分鐘并孵育10分鐘，最終得到近紅外熒光增強蛋白芯片。該實施例的近紅外熒光增強蛋白芯片，在掃描電鏡下的表面形貌如圖1所示。由圖1可看出，制得的近紅外熒光增強蛋白芯片表面具有獨特的各自分隔的維納金島形貌，以及大量距離分布在10nm左右的空隙。由于納米空隙之間的局域電場增強、以及等離子體與近紅外熒光染料之間的共振效應(yīng)，具有納米結(jié)構(gòu)的近紅外熒光增強蛋白芯片可提供大約兩個數(shù)量級的近紅外熒光增強效果。實施例2在該實施例中，制備出IRDye800標記的檢測抗體。具體的制備方法為，檢測抗體預(yù)先與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基進行共價偶聯(lián)反應(yīng)，并用柱分離IRDye-800，且800CWNHS酯用DMSO稀釋并避光保存在-20℃；檢測抗體和IRDye800以1:1的摩爾比混合，室溫下?lián)u動，黑暗中反應(yīng)1.5小時；用再NAP-5柱除去未結(jié)合的染料，并以PBS緩沖液為流動相，收集IRDye800標記的檢測抗體，并避光儲存在-20℃。該實施例的IRDye800標記的檢測抗體，可直接涂覆在實施例1的近紅外熒光增強蛋白芯片表面，再通過分光光度計可獲得消光光譜圖，如圖2所示。從圖2可看出，等離子體在近紅外區(qū)具有共振效應(yīng)，且近紅外熒光增強蛋白芯片的消光光譜與IR800染料的激發(fā)(785nm)和發(fā)射區(qū)域(790-810nm)重疊。實施例3在該實施例中，制備并使用檢測肺癌標志物的試劑盒，檢測樣品。具體的制備方法為，采用打印機固定捕獲抗體至近紅外熒光增強蛋白芯片上，其中，捕捉抗體用PBS緩沖液稀釋至濃度為3微摩爾/升，再加入到384孔板中；通過運行設(shè)計的打印方案，捕獲抗體以每個點3nL的打印量、且每個點重復(fù)打印3次，獲得直徑為400微米的圓形斑點，并逐行打印后，最終得到打印固定有捕獲單體的近紅外熒光增強蛋白芯片。具體使用近紅外熒光增強蛋白芯片之前，在4℃下放置過夜，再密封在含有10v/v％FBS的PBS緩沖液中搖動1小時，以減少非特異性結(jié)合；然后，每個檢測點用150微升的含有0.05v/v％吐溫20的PBST緩沖液清洗后，將含有10微升樣品和90微升FBS的總共100微升混合溶液，依次加入至每個檢測點，搖動2小時；隨后，用PBST洗滌芯片五次，加入IRDye800標記的檢測抗體，在黑暗中半小時搖動染色；再用PBST洗滌五次，每個檢測點分別加入100微升的PBST和PBS，在黑暗中靜置15分鐘后搖動5分鐘；最后，用純水清洗并干燥，得到用于熒光掃描的檢測芯片。實施例4在該實施例中，按照與實施例3基本相同的方法，分別制備出CEA校準品、CYFRA21-1校準品和NSE校準品的一系列不同樣品濃度的檢測芯片，再進行熒光掃描檢測。該實施的熒光掃描圖如圖3～5所示，具體的，為對比出近紅外熒光增強蛋白芯片(pGOLDchip)的增強效果，還增了加玻璃芯片(Glassslide)和均一金膜芯片(Coldslide)的檢測效果。其中，圖3為CEA校準品、圖4為CYFRA21-1校準品和圖5為NSE校準品的一系列不同濃度的熒光檢測結(jié)果。從圖3、圖4和圖5可以看出，等離子體具有明顯的近紅外熒光增強效應(yīng)，并且CYFRA21-1和NSE在近紅外熒光增強蛋白芯片上，相對于玻璃和均一的金膜分別有50倍和100倍熒光增強的效果。再分別以近紅外熒光增強蛋白芯片、玻璃芯片以及均一金膜芯片檢測CEA標準品、Cyfra21-1標準品和NSE標準品的數(shù)據(jù)，能夠得到CEA標準曲線圖、Cyfra21-1標準曲線圖和NSE標準曲線圖，具體的如圖6所示。然后，比較檢測限和動態(tài)范圍，包含已知濃度的生物標記物樣本來源于Tellgen公司，在近紅外熒光增強蛋白芯片上做了三個獨立的實驗計算標準偏差和誤差棒，具體的如圖7所示，且數(shù)據(jù)顯示了平均±s.d.(n＝3)。結(jié)合圖6和圖7可看出，通過商品化的含有已知濃度CEA標準品、Cyfra21-1標準品和NSE標準品獲得的標準曲線中，相比玻璃和均一金膜，pGOLD芯片的檢測結(jié)果顯示出更高的信噪比和動態(tài)測量范圍。與pGOLD芯片的結(jié)果相反，無特殊納米結(jié)構(gòu)的均一金膜上顯示出微小的熒光淬滅而非近紅外熒光增強，從而導(dǎo)致了靈敏度的降低和信號動態(tài)范圍的減少。因此，通過近紅外熒光增強檢測可以證明，pGOLD是一個在生物標記物檢測方面優(yōu)于傳統(tǒng)基質(zhì)的平臺。對比例1在該對比例中，使用Luminex檢測方法檢測一系列不同濃度的肺癌標志物標準品。具體的使用方法為，預(yù)先將Luminex試劑盒中的材料在室溫下放置30分鐘，并良好混合各個試劑；校準材料在純水中溶解，靜置2分鐘；分別將25微升反應(yīng)緩沖液、10微升校準材料和25微升藻紅蛋白(PE)標記的混合抗體加入到每個檢測點的96孔板中，密封，充分混合；然后，移至培養(yǎng)箱中在37℃下避光5分鐘；每個檢測點添加25微升的微球懸浮液，密封和搖動后，再次放置在37℃培養(yǎng)箱中黑暗下反應(yīng)60分鐘；最后，每個檢測點添加100微升終止緩沖，充分混合，得到檢測板，并用Luminex200多功能流式細胞點陣儀檢測，得到一系列不同肺癌標志物標準品濃度的檢測結(jié)果。再分別以近紅外熒光增強蛋白芯片、玻璃芯片以及均一金膜芯片檢測CEA標準品、Cyfra21-1標準品和NSE標準品的數(shù)據(jù)，能夠得到CEA標準曲線圖、Cyfra21-1標準曲線圖和NSE標準曲線圖，具體的如圖8所示。對比圖6和圖8，通過比較pGOLD芯片和Tellgen商業(yè)化Luminex試劑盒這兩種方法測得的標準曲線，觀察到在檢測肺癌蛋白標記物中，pGOLD芯片可以獲得更高的靈敏度和檢測重現(xiàn)性。根據(jù)標準曲線計算結(jié)果證明，pGOLD芯片方法在檢測CEA，Cyfra21-1以及NSE中，其LOD和LOQ較Luminex方法提高了6～20倍，具體數(shù)據(jù)請見表1。表1.pGOLD芯片和Luminex平臺的LOD和LOQCEA[ng/mL]Cyfra21-1[ng/mL]NSE[ng/mL]Luminex-LODa1.0710.2540.831pGOLDchip-LODa0.1850.0490.146Luminex-LOQb4.3021.3464.003pGOLDchip-LOQb0.2780.0780.667a)LODs通過將平均空白值加上標準誤差的3倍計算；b)LOQs通過平均空白值加標準誤差的10倍獲得。而且，在生物標記物檢測的低濃度區(qū)域，pGOLD芯片上多次檢測的結(jié)果比Luminex平臺顯示出更好的重現(xiàn)性。其中，pGOLD的變異系數(shù)為6.42-24.13％，Luminex的變異系數(shù)為5.47～60.33％，具體數(shù)據(jù)見表2、表3和表4。這些結(jié)果具有重要的意義，且檢測過程使用了相同的抗體和標準品，證明等離子體熒光增強芯片平臺檢測效果優(yōu)于Luminex平臺。表2.pGOLD芯片和Luminex平臺檢測不同濃度CEA的變異系數(shù)Concentration[ng/mL]pGOLDa(％)Luminexa(％)118.3315.262.3829.5811.773.0911.838.674.042.967.195.141.188.985.470.597.5134.260.127.9212.86Blank6.4248.26a)異系數(shù)由三個獨立試驗由標準偏差除以平均強度計算而得。表3.pGOLD芯片和Luminex平臺檢測不同濃度Cyfra21-1的變異系數(shù)表4.pGOLD芯片和Luminex平臺檢測不同濃度NSE的變異系數(shù)Concentration[ng/mL]pGOLDa(％)Luminexa(％)10035.634.752514.374.97108.9810.702.511.1517.3619.4136.080.524.136.740.122.3422.12Blank14.2060.33實施例5在該實施例中，通過pGOLD芯片同時檢測多種生物標記物，用于驗證檢測方法的特異性，以及檢測過程中無交叉污染。具體的制備方法與實施例3基本相同，區(qū)別在于，CEA、Cyfra21-1和NSE的捕獲抗體以3×3點陣形式被打印固定到pGOLD芯片上，每行固定一種抗體，且每種抗體分別固定于同一行上的三個點；待芯片上的點陣與三種蛋白標記物的混合物孵育后，加入熒光標記的捕獲抗體(一種或多種的混合物)用于結(jié)合被捕獲在芯片上的CEA,Cyfra21-1和NSE，最后通過檢測熒光強度來檢測標記物。當加入的熒光標記的捕獲抗體是一種時，能夠得到單項肺癌標志物的檢查結(jié)果，如圖9所示，以及三種標志物單項檢測結(jié)果的誤差分析，具體見圖10。而當使用兩種檢測抗體混合物時，芯片上只會呈現(xiàn)兩行對應(yīng)的熒光顯色光斑，而對于于缺失檢測抗體的那一行不顯色熒光，具體檢測結(jié)果如圖11和圖12所示。從圖9～12可以看出，pGOLD微陣列檢測芯片在同時檢測多種生物標記物時具有良好的特異性，無交叉污染。實施例6在該實施例中，按照與實施例3基本相同的使用方法和檢測條件，對4個肺癌病人分別進行全血和血清進行對照檢測。區(qū)別在于，在該實施例中，熒光標記的捕獲抗體中含有10nmol的CEA檢測抗體、10nmol的CYFRA21-1檢測抗體和1nmol的NSE檢測抗體。該實施例的肺癌病人的血液樣品檢測結(jié)果，如圖13所示。由圖13可看出，CEA和Cyfra21-1的檢測信號相當，但是血液樣本中對應(yīng)NSE的信號強度明顯高于血清樣本所測得的信號，說明NSE來源于血紅細胞的釋放。實施例7在該實施例中，按照與實施例6基本相同的使用方法和檢測條件，對48個肺癌病人和24個健康的人進行全血和血清進行對照檢測。該實施例的血液樣品檢測結(jié)果的統(tǒng)計數(shù)值，如表6、圖14～16所示。該實施例的檢查結(jié)果顯示，等離子金芯片檢測通過調(diào)整臨界值至更低的濃度，甚至可以觀察到更高的CEA和NSE檢測靈敏度，分別為18.8％和25.0％，同時具有100％的特異性。肺癌診斷中，等離子體金芯片展現(xiàn)出更優(yōu)的檢測靈敏度，其主要原因是等離子體方法提供更優(yōu)的LOD和LOQ，同時在低濃度檢測區(qū)域具有更小的檢測變異系數(shù)(CV)。由于單個標記物的檢測方法通常靈敏度有限，為了提高檢測靈敏度，同時檢測三個標記物。使用金等離子體熒光增強平臺，發(fā)現(xiàn)用三種標記物檢測肺癌時，可以獲得52％的靈敏度和95.8％的特異性(如果其中一個標記物的濃度高于臨界值，認為此樣品為陽性)。對比例2在該實施例中，采用Luminex試劑盒，即按照與對比例1基本相同的使用方法和檢測條件，對實施例7中同樣的48個肺癌病人和24個健康的人進行全血和血清進行對照檢測。并且，根據(jù)商品化Luminex試劑盒上推薦的截斷值水平：CEA為5ng/mL,Cyfra21-1為5ng/mL以及NSE為25ng/mL，具體可參考表5。表5.截斷值總結(jié)該對比例的血液樣品檢測結(jié)果的統(tǒng)計數(shù)值，如表6所示。將實施例7的數(shù)據(jù)與該對比例的數(shù)據(jù)進行對比可發(fā)現(xiàn)，實施例7的pGOLD芯片的單項CEA(12.5％)和Cyfra21-1(35.4％)的檢測靈敏度更高，并且基于等離子體近紅外熒光增強和Luminex的方法均可以提供91％到100％不等的超高特異性。并且，根據(jù)Luminex試劑盒和pGOLD芯片降低的截止值獲得的診斷結(jié)果，如表7所示。表6.pGOLD芯片和Luminex平臺的靈敏度和特異性LuminexapGOLDloweredcutoffsbLuminex-ROCcpGOLD-ROCcSensitivity-CEA10.42％18.75％8.33％39.58％Specificity-CEA91.67％100％100％91.67％Sensitivity-Cyfra21-14.17％35.42％14.58％62.5％Specificity-Cyfra21-1100％95.83％95.83％83.33％Sensitivity-NSE18.75％25％20.83％93.75％Specificity-NSE100％100％100％62.5％Sensitivity-Combination29.17％52.08％33.33％93.75％Specificity-Combination91.67％95.83％95.83％50％a)敏感性和特異性分別按照商業(yè)Luminex公司試劑盒的推薦截止值獲得；b)敏感性和特異性按照調(diào)整的截止值(10倍血清稀釋)獲得，在pGOLD芯片上測試82例CEA,271例Cyfra21-1和170例NSE，所對應(yīng)的血清中生物標記物濃度也應(yīng)用于Luminex平臺的敏感性和特異性計算；c)敏感性和特異性根據(jù)由ROC曲線優(yōu)化的截斷值獲得。表7：根據(jù)試劑盒截止值和pGOLD芯片降低的截止值.獲得的診斷結(jié)果除此以外，pGOLD芯片和Luminex平臺檢測CEA、Cyfra21-1以及NSE的受試者工作特征曲線如圖14、圖15和圖16所示。PGold芯片所測的三個標記物的曲線顯示出更大的曲線積分面積(CEA：pGOLD芯片和Luminex結(jié)果分別為0.640和0.205；Cyfra21-1：pGOLD芯片和Luminex結(jié)果分別為0.750和0.450；NSE：pGOLD芯片和Luminex結(jié)果分別為0.830和0.297)。這些結(jié)果證明pGOLD芯片檢測可獲得比Luminex平臺更優(yōu)的檢測結(jié)果。由于肺癌病人在腫瘤學(xué)上可分為非小細胞肺癌(NSCLC，28例)和小細胞肺癌(SCLC，20例)，發(fā)現(xiàn)，通過pGold芯片方法檢測，對于NSCLC來說，多指標檢測的靈敏度可達到46％，特異性可達到95％，然而對于SCLC來說，多指標檢測可獲得大約60％的靈敏度和98％的特異性。雖然CEA,Cyfra21-1和NSE在診斷肺癌的價值方面早就被承認，但是通過ELISA和化學(xué)發(fā)光技術(shù)獲得的檢測靈敏度僅僅為～4-24％之間(特異性大于95％)。使用這些技術(shù)檢測肺癌時，靈敏度的提高將不可避免地降低特異性。在本研究中，基于單指標檢測，可以獲得更高的靈敏度(CEA:19％,Cyfra21-1:35％,NSE:25％)，同時具有很高的特異性(CEA:100％,Cyfra21-1:95.83％,NSE:100％)。使用單個標記物聯(lián)合檢測時，可以獲得更高的52％的靈敏度和非常高的96％的特異性，這些結(jié)果很顯然優(yōu)于Luminex檢測方法和之前報道的基于類似標記物檢測手段。pGOLD優(yōu)越的檢測效果歸結(jié)于其生物標記物優(yōu)越的定量檢測限和檢測限，使得在檢測臨界值處獲得準確的定量檢測效果?？偨Y(jié)總體上說，本實用新型將pGOLD芯片作為一種非侵入式的診斷工具應(yīng)用于靈敏、特異的肺癌檢測。根據(jù)實施例1～7和對比例1～2中，通過近紅外熒光增強檢測，pGOLD芯片與其它的芯片和Luminex檢測平臺相比，其提供了優(yōu)異的檢測限(0.049-0.185ngmL-1)、定量檢測限(0.078-0.667ngmL-1)和重現(xiàn)性。將微陣列高通量檢測技術(shù)、多指標近紅外光增強檢測技術(shù)應(yīng)用于肺癌的診斷方法具有高的靈敏度和特異性，同時極大地減少樣品耗費量和檢測成本，具有即時診斷應(yīng)用的潛力。Tips：在本實用新型的描述中，需要理解的是，術(shù)語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”、“內(nèi)”、“外”、“順時針”、“逆時針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本實用新型和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對本實用新型的限制。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本實用新型的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本實用新型的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本實用新型的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本實用新型的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。當前第1頁1 2 3