本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，特別涉及用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)致病弧菌群的基因芯片和使用方法。
背景技術(shù)：
：：隨著人工養(yǎng)殖迅速發(fā)展，養(yǎng)殖水域生態(tài)變化，弧菌病已經(jīng)成為海水養(yǎng)殖動物主要的細(xì)菌性病害之一。在世界各地養(yǎng)殖參蝦貝水產(chǎn)動物中，由弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌引起的弧菌病(Vibriosis)是普遍流行且危害最大的細(xì)菌性疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，弧菌屬中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和燦爛弧菌在弧菌種群中占優(yōu)勢，廣泛存在于自然海水中，導(dǎo)致弧菌病發(fā)生，且具有流行廣、發(fā)病率高、危害大、死亡率高等特點(diǎn)，給參蝦貝等海水動物的養(yǎng)殖造成了巨大的影響。因此，急需一種檢測速度快、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)的參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)致病弧菌的檢測方法。目前，海洋微生物檢測方法一般為生化檢測法，但該方法存在培養(yǎng)周期長，操作繁瑣，特異性差等缺點(diǎn)。同時，由于自然環(huán)境中僅有小于1％左右的微生物為可培養(yǎng)，而基因芯片不需要活的細(xì)菌，只需有DNA即可?，F(xiàn)有基因芯片設(shè)計(jì)的探針多是針對16SrRNA基因，而16SrDNA用于致病弧菌的檢測比較保守，由于信息位點(diǎn)較少，因此構(gòu)建的系統(tǒng)穩(wěn)定性較差，用于鑒定親緣關(guān)系較接近的細(xì)菌，容易產(chǎn)生偏差，引起假陽性，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可并行性的快速、高效、準(zhǔn)確的檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體六種致病弧菌群的基因芯片和使用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)致病弧菌群的基因芯片，包括芯片載體，其特殊之處在于：所述的芯片載體上固載有經(jīng)化學(xué)修飾的用于檢測副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌的核苷酸探針，所述的用于檢測副溶血弧菌的探針使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein為靶基因、所述的用于檢測溶藻弧菌的探針使用23rDNA為靶基因、所述的用于檢測鰻弧菌的探針使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、所述的用于檢測哈維氏弧菌的探針使用glycolipidtransferprotein為靶基因、所述的用于檢測創(chuàng)傷弧菌的探針使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、所述的用于檢測燦爛弧菌的探針使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter為靶基因。各探針的基因序列如下：進(jìn)一步的，所述化學(xué)修飾為氨基修飾。一種用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體致病弧菌群基因芯片的使用方法，包括待測樣品DNA提取步驟；樣品PCR擴(kuò)增步驟；PCR產(chǎn)物與芯片雜交步驟；芯片雜交后的處理步驟；雜交芯片的掃描及結(jié)果判讀的步驟，其特殊之處在于：所述的樣品PCR擴(kuò)增步驟中針對致病弧菌群不同菌種靶基因所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增的引物序列如下：所述的樣品PCR擴(kuò)增步驟中擴(kuò)增體系為：PCRMix12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA1μL；ddH2O10.3μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?5℃5min；②95℃30s；③61℃或55℃30s；④72℃45s，返回到②35個循環(huán)；⑤72℃10min；⑥4℃保存。進(jìn)一步的，擴(kuò)增程序③中，DJ1、DJ2、DJ6、DJ11退火溫度為61℃；DJ7、D8、DJ13、DJ17退火溫度為55℃。本發(fā)明的有益效果：通過副溶血弧菌使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein為靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA為靶基因、鰻弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、哈維氏弧菌使用glycolipidtransferprotein為靶基因、創(chuàng)傷弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、燦爛弧菌使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter為靶基因，設(shè)計(jì)針對副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌的特異性探針，進(jìn)行氨基修飾后，制作可用于快速檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體致病弧菌群的基因芯片，采用多重PCR技術(shù)同時擴(kuò)增6種致病弧菌靶基因，在基因芯片上平行、快速地鑒定致病弧菌群。所設(shè)計(jì)的基因芯片能并行性的快速高效檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體6種致病弧菌，并且具有更加特異性和敏感性的特點(diǎn)。此外，針對每種弧菌變異區(qū)序列設(shè)計(jì)的特異性探針，顯著提高了檢測的特異性。本發(fā)明提高了鑒定參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體致病弧菌群的能力，同時極大地縮短了檢測時間。附圖說明圖1為副溶血弧菌VP2和VP3特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖2為溶藻弧菌VA2特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖3為鰻弧菌LA3和LA4特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖4為哈維氏弧菌VH1和VH2特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖5為創(chuàng)傷弧菌VV7特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖6為燦爛弧菌VS3和VS6特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖7為副溶血弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖8為溶藻弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖9為鰻弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖10為哈維氏弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖11為創(chuàng)傷弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖12為燦爛弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖13為副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌混合模版基因芯片檢測結(jié)果圖；圖14為溶藻弧菌環(huán)境菌株基因芯片檢測結(jié)果圖；圖15為未知病原菌XZBYJ01基因芯片檢測結(jié)果圖；圖16為未知病原菌XZBYJ02基因芯片檢測結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1探針的設(shè)計(jì)及合成1、目標(biāo)檢測菌種及靶基因本發(fā)明選擇參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群作為檢測對象，包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌。副溶血弧菌使用thermostabledirecthemolysin和multidrugresistanceprotein為靶基因、溶藻弧菌使用23rDNA為靶基因、鰻弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、哈維氏弧菌使用glycolipidtransferprotein為靶基因、創(chuàng)傷弧菌使用methyl-acceptingchemotaxisprotein為靶基因、燦爛弧菌使用putativepermeasesofthedrug/metabolitetransporter為靶基因。2、探針設(shè)計(jì)本發(fā)明采用18-30bp的寡核苷酸探針。探針參數(shù)基本要求是特異性和高效性的雜交，應(yīng)滿足以下條件：①探針Tm值保持相近，在上下10℃范圍內(nèi)浮動；②形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的連續(xù)互補(bǔ)堿基數(shù)少于4個；③探針與非目標(biāo)基因序列的連續(xù)匹配堿基數(shù)少于7個堿基；④探針與目標(biāo)基因的錯配堿基數(shù)少于4個堿基。本發(fā)明針對不同菌種靶基因共設(shè)計(jì)10條探針，如表1所示：表1探針信息表3、探針合成將表1的探針在5’端加上15個T的間隔臂，以減少DNA雜交時的空間位阻，提高雜交效率。同時在探針5’端進(jìn)行氨基修飾，以備下一步與玻片上的醛基交聯(lián)，將探針固定在玻片上。如表2所示：表2合成探針信息表實(shí)施例2基因芯片的制作利用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的探針制備用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群的基因芯片，具體步驟如下：1、探針母液的配制用雙蒸水將合成的探針(表2)稀釋成100μmol/L的母液，再用點(diǎn)樣緩沖液稀釋至濃度20μmol/L；2、點(diǎn)樣前的準(zhǔn)備取100μL移至96/384孔板的A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、I1、J1孔，在K1孔加入100μL點(diǎn)樣緩沖液；3、點(diǎn)樣用美國Bio-Dot公司的AD1500基因芯片點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)定好的程序在醛基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣；每點(diǎn)點(diǎn)樣量為0.5μL，點(diǎn)直徑為200μm，點(diǎn)心間距為1.5mm，點(diǎn)樣時環(huán)境相對濕度55-65％，溫度23℃；4、基因芯片的制備將表2中經(jīng)合成的檢測探針以表3所示的點(diǎn)陣形式分布在醛基基片上，每條探針重復(fù)3次；表35、點(diǎn)樣后的處理將點(diǎn)完樣的芯片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內(nèi)，密閉后靜置于30℃烘箱過夜，得到用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群基因芯片。實(shí)施例3用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群基因芯片(實(shí)施例2制備的)的使用方法，具體步驟如下：1、待測樣品采集及處理將獲得的水樣用8μm無菌濾膜除去雜質(zhì)，之后用0.22μm的濾膜過濾并收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20℃下保存；泥樣取自養(yǎng)殖環(huán)境底部2-5cm處底泥100g，采集樣品于冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；動物樣品用無菌剪刀剪取，無菌水沖洗3次，裝入凍存管，放入液氮保存。2、模板DNA制備水樣和泥樣DNA分別用OMEGA水樣DNA提取試劑盒(OMEGAWaterDNAKit,D5525)和土壤DNA提取試劑盒(OMEGASoilDNAKit,D5625)提取，動物樣品致病菌DNA用天根細(xì)菌基因組試劑盒提取。3、引物和探針的設(shè)計(jì)從副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌6種不同致病弧菌相應(yīng)基因序列以及部分相鄰菌種的上述基因的序列，進(jìn)行多基因序列比對，對每種致病菌引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而建立了由10條寡核苷酸探針和8對引物組成的參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群基因芯片。表4副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌和燦爛弧菌的靶基因的擴(kuò)增引物4、PCR擴(kuò)增(1)PCR反應(yīng)體系將表5中所示試劑分別加入PCR管中，震蕩混勻，瞬時離心。表5PCR反應(yīng)體系試劑體積(μL)Mix12.5上游引物(20μmol/L)0.2下游引物(20μmol/L)1模板DNA1ddH2O10.3(2)PCR反應(yīng)條件將以上提取的DNA作為PCR擴(kuò)增模板，分別以對應(yīng)的引物和PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行反應(yīng)，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測、觀察PCR擴(kuò)增效果。表6PCR反應(yīng)條件注：DJ1、DJ2、DJ6、DJ11退火溫度為61℃；DJ7、D8、DJ13、DJ17退火溫度為55℃。5、熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物(1)取各模板PCR合并后的產(chǎn)物8μL于無菌的0.2mL離心管中，作為模板；(2)向每個樣品管中加入雜交緩沖液8μL和1μL陽控，震蕩混勻，瞬時離心(3)將離心后的樣品管放入PCR儀，99℃變性3min，立即冰浴3min，瞬時離心，然后，進(jìn)行下一步芯片雜交。6、雜交(1)芯片預(yù)雜交①將預(yù)雜交緩沖液在50℃預(yù)熱；②預(yù)雜交緩沖液與鮭精DNA按照體積比10:1的比例混合，置于PCR儀上99℃變性5min，立即冰浴3min，然后用移液器加到芯片的點(diǎn)樣區(qū)，用適當(dāng)大小的原位雜交專用蓋玻片覆蓋點(diǎn)樣區(qū)；③將芯片放入濕盒，置于水浴鍋，65℃，1h；預(yù)雜交結(jié)束后，用ddH2O沖洗，后離心干燥。(2)樣品與芯片雜交①將芯片正面朝上，平放于桌面，將芯片圍欄貼于各點(diǎn)樣區(qū)之間，放上芯片蓋片(有凸臺的一面朝向芯片)，上端先接觸芯片，再緩緩蓋下；②用移液器通過蓋玻片加樣孔緩慢注入16μL熒光標(biāo)記后的樣品，樣品會憑借液體表面張力在蓋玻片下面的凹臺和芯片表面之間形成一道液膜；(注意：不要震動蓋片或芯片，以免破壞液膜。)③將芯片放入濕盒，置于水浴鍋，65℃，2h，避光；④雜交完畢的芯片依次用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)、洗液C(0.1×SSC)在振蕩培養(yǎng)箱中150r/min各洗15min。7、掃描芯片芯片洗滌完畢后，離心干燥，放于微陣列芯片掃描儀上檢測，電腦收集數(shù)據(jù)。8、結(jié)果判定一個有效的雜交結(jié)果要符合二點(diǎn)要求：(1)空白點(diǎn)的信號平均值，即背景平均值要小于10；(2)質(zhì)控點(diǎn)信號的平均值要高于背景平均值10倍以上。陽性雜交信號還要符合：(1)陽性點(diǎn)的信號平均值要高于背景平均值10倍以上；(2)陽性點(diǎn)與質(zhì)控點(diǎn)的平均值比值要在0.4以上。非特異性信號的判定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)陽性點(diǎn)與質(zhì)控點(diǎn)的平均值比值要小于0.35；(2)非特異性點(diǎn)的信號平均值要小于8倍的背景平均信號值。實(shí)施例4將實(shí)施例2制備得到的用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群基因芯片的特異性效果驗(yàn)證將實(shí)驗(yàn)菌株靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后再進(jìn)行雜交顯色，用于基因芯片特異性驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如圖1至圖6所示，10條探針都能特異性結(jié)合各自目標(biāo)病原菌的靶基因，無非特異性雜交信號。因此，所有自主設(shè)計(jì)的探針具有高度的特異性。圖1為副溶血弧菌VP2和VP3特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖2為溶藻弧菌VA2特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖3為鰻弧菌LA3和LA4特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖4為哈維氏弧菌VH1和VH2特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖5為創(chuàng)傷弧菌VV7特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；圖6為燦爛弧菌VS3和VS6特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖。檢測結(jié)果所示，10條探針都能特異性結(jié)合各自目標(biāo)病原菌的靶基因。實(shí)施例5將實(shí)施例2制備得到的用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病弧菌群基因芯片的具體應(yīng)用效果檢測采用模式菌株：副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌；環(huán)境菌株：溶藻弧菌；未知病原菌：XZBYJ01和XZBYJ02檢測驗(yàn)證。結(jié)果如圖7至圖15所示，所有自主設(shè)計(jì)的探針用來檢測相應(yīng)的致病弧菌只能特異性結(jié)合相應(yīng)的靶基因，無非特異性雜交信號。因此，所有自主設(shè)計(jì)的探針具有高度的特異性。圖7為副溶血弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖8為溶藻弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖9為鰻弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖10為哈維氏弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖11為創(chuàng)傷弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖12為燦爛弧菌模式菌株基因芯片的檢測結(jié)果；圖13為副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌混合模版基因芯片檢測結(jié)果圖；圖14為溶藻弧菌環(huán)境菌株基因芯片檢測結(jié)果圖；圖15為未知病原菌XZBYJ01基因芯片檢測結(jié)果圖；經(jīng)鑒定為燦爛弧菌，圖16為未知病原菌XZBYJ02基因芯片檢測結(jié)果圖；經(jīng)鑒定為溶藻弧菌。以上僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>大連海洋大學(xué)<120>用于檢測參蝦貝養(yǎng)殖區(qū)致病弧菌群的基因芯片和使用方法<130><160>26<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<212>人工序列<400>1Atttggatgaccgaagtagaca22<210>2<211>19<212>DNA<212>人工序列<400>2cacccacaaggtcgaaaga19<210>3<211>22<212>DNA<212>人工序列<400>3gtcagttgatcggtttattcag22<210>4<211>20<212>DNA<212>人工序列<400>4gcgagcgttgtcaggtgtag20<210>5<211>18<212>DNA<212>人工序列<400>5atggggggacggagaagg18<210>6<211>21<212>DNA<212>人工序列<400>6tacaagggtggtatttcaagg21<210>7<211>22<212>DNA<212>人工序列<400>7ccgacaaactgattattactgc22<210>8<211>22<212>DNA<212>人工序列<400>8tgaagactaaagcgattaacgt22<210>9<211>20<212>DNA<212>人工序列<400>9actggatgcaaacacgctga20<210>10<211>18<212>DNA<212>人工序列<400>10ttgttgcgcccagtggta18<210>11<211>20<212>DNA<212>人工序列<400>11gatgcgggcaataacctgac20<210>12<211>20<212>DNA<212>人工序列<400>12agcaaccactgcgaagccac20<210>13<211>19<212>DNA<212>人工序列<400>13tgttgccgccaaccaaact19<210>14<211>19<212>DNA<212>人工序列<400>14ggtcgccacaagatccact19<210>15<211>19<212>DNA<212>人工序列<400>15cataccgacattgccttcc19<210>16<211>19<212>DNA<212>人工序列<400>16ccaagcgggtttactgttc19<210>17<211>28<212>DNA<212>人工序列<400>17caagatcccagacgagatctctgacgat28<210>18<211>29<212>DNA<212>人工序列<400>18ttacgggcgtggcaatcgtcatttgtatg29<210>19<211>23<212>DNA<212>人工序列<400>19gcgcagtcgctagattgcgtgga23<210>20<211>28<212>DNA<212>人工序列<400>20tcatccgacggcacaaccatagcccacc28<210>21<211>26<212>DNA<212>人工序列<400>21gcaatgccgttatcgccgaagagcct26<210>22<211>23<212>DNA<212>人工序列<400>22cgacgggcacttcaccaaaagcg23<210>23<211>30<212>DNA<212>人工序列<400>23cttaaggtttctaagtcggttgctggtttc30<210>24<211>30<212>DNA<212>人工序列<400>24tcaacaccgacagcgaaagcattcaaaccg30<210>25<211>30<212>DNA<212>人工序列<400>25cgattaaagaggtgattcagaccactgagc30<210>26<211>30<212>DNA<212>人工序列<400>26acaccactaaacaccaaagccgagccaatc30當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3