本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及LTA基因單核苷酸多態(tài)性rs2009658在檢測(cè)結(jié)核易感性中的應(yīng)用，特別涉及LTA基因rs2009658位點(diǎn)標(biāo)志物在人群對(duì)結(jié)核病易感性篩查和評(píng)估中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的全球性疾病，其已成為人類(lèi)三大感染性疾病殺手之一。世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報(bào)告指出，大約1/3的人被結(jié)核分枝桿菌感染，其中僅有10％的感染者發(fā)病。這就意味著結(jié)核感染者是否發(fā)病與宿主-病原體之間的相互作用、環(huán)境、遺傳等有著密切的關(guān)系。最近，許多研究證明結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)與免疫系統(tǒng)和炎性反應(yīng)相關(guān)基因的多態(tài)性有密切的聯(lián)系。
淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)在炎性疾病的發(fā)病中至關(guān)重要，編碼LTA和TNF蛋白的基因位于人類(lèi)6號(hào)染色體上的MHC III區(qū)域。TNF在系統(tǒng)性炎性反應(yīng)及誘導(dǎo)急性期反應(yīng)過(guò)程中扮演著重要的角色，同時(shí)其能夠刺激細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化。LTA也是一種淋巴因子，其在宿主抵抗結(jié)核分枝桿菌急性感染過(guò)程中起決定性作用。
LTA和TNF基因多態(tài)性與一些炎性疾病易感性之間的關(guān)系已經(jīng)被廣泛報(bào)道。Santos等人報(bào)道TNF-308GA和LTA 252AG基因多態(tài)性與狼瘡腎罹患風(fēng)險(xiǎn)之間存在著關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)上述基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、口腔癌、急性呼吸窘迫綜合癥、缺血性腦卒中、感染性休克、敗血癥和非霍奇金淋巴瘤等疾病之間也存在一定的聯(lián)系。
隨著基因組學(xué)的發(fā)展和結(jié)核分枝桿菌全基因組測(cè)序的完成，成千上萬(wàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)從結(jié)核患者身上被鑒定。研究者利用這些數(shù)據(jù)繪制出結(jié)核分枝桿菌SNP系譜樹(shù)并提出了結(jié)核分枝桿菌譜系的進(jìn)化假說(shuō)。盡管結(jié)核分枝桿菌SNP研究在方法學(xué)和基因組學(xué)上取得了舉世矚目的成就，但是很多SNP與結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系卻依舊知之甚少，特別是LTA和TNF基因SNP與結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系至今仍然不清楚。
因此，確定LTA和TNF基因的SNP并深入研究其與結(jié)核患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系顯得非常有必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供LTA基因單核苷酸多態(tài)性rs2009658在檢測(cè)結(jié)核易感性中的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體可為兩個(gè)，即應(yīng)用A和應(yīng)用B。
應(yīng)用A：用于檢測(cè)rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)在制備評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
其中，所述rs2009658位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體中自5’末端起第31570467位核苷酸；所述rs2009658位點(diǎn)的核苷酸為G或C。
進(jìn)一步，所述應(yīng)用A為所述用于檢測(cè)rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)以及記載有如下(a1)或(a2)所示內(nèi)容的可讀性載體在制備評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；(a1)在共顯性遺傳模型下，所述rs2009658位點(diǎn)為GC基因型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于所述rs2009658位點(diǎn)為CC基因型的待測(cè)人；(a2)在顯性遺傳模型下，所述rs2009658位點(diǎn)為GC基因型或GG基因型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于所述rs2009658位點(diǎn)為CC基因型的待測(cè)人。
應(yīng)用B：用于檢測(cè)單體型M的物質(zhì)在制備評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
單體型(Haplotype)是位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)，并傾向于以整體遺傳給后代的單核苷酸多態(tài)的組合。雙體型為位于同源染色體上的單體型對(duì)。
其中，所述單體型M的單核苷酸多態(tài)組合如下：rs2009658位點(diǎn)、rs1800683位點(diǎn)、rs2229094位點(diǎn)、rs1041981位點(diǎn)和rs1800629位點(diǎn)。
所述rs2009658位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體中自5’末端起第31570467位核苷酸；所述rs2009658位點(diǎn)的核苷酸為G或C。
所述rs1800683位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572294位核苷酸；所述rs1800683位點(diǎn)的核苷酸為A或G。
所述rs2229094位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572779位核苷酸；所述rs2229094位點(diǎn)的核苷酸為C或T。
所述rs1041981位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31573007位核苷酸；所述rs1041981位點(diǎn)的核苷酸為C或A。
所述rs1800629位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31575254位核苷酸；所述rs1800629位點(diǎn)的核苷酸為A或G。
進(jìn)一步，所述應(yīng)用B為所述用于檢測(cè)單體型M的物質(zhì)以及記載有如下(b1)或(b2)所示內(nèi)容的可讀性載體在制備評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；(b1)攜帶GGCCG”單體型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶“CATAG”單體型的待測(cè)人；(b2)攜帶雙體型“GGCCG”1份拷貝的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于不攜帶“GGCCG”單體型的待測(cè)人。
其中，“GGCCG”單體型是指所述單體型M的各SNP位點(diǎn)依次為“GGCCG”?！癈ATAG”單體型是指所述單體型M的各SNP位點(diǎn)依次為“CATAG”。雙體型“GGCCG”1份拷貝是指位于同源染色體上的兩個(gè)所述單體型M其中一個(gè)的各SNP位點(diǎn)依次為“GGCCG”，另一個(gè)不為“GGCCG”。
本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，含有用于檢測(cè)rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)；所述產(chǎn)品具有評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的功能。
其中，所述rs2009658位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體中自5’末端起第31570467位核苷酸；所述rs2009658位點(diǎn)的核苷酸為G或C。
在本發(fā)明中，所述用于檢測(cè)rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)具體為引物對(duì)甲或成套單鏈DNA分子甲；所述引物對(duì)甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA、序列表中序列2所示的單鏈DNA和序列表中序列3所示的單鏈DNA組成。
所述產(chǎn)品中，還可含有記載有如上(a1)或(a2)所示內(nèi)容的可讀性載體。
本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，含有用于檢測(cè)單體型M的物質(zhì)；所述單體型M的單核苷酸多態(tài)組合如下：rs2009658位點(diǎn)、rs1800683位點(diǎn)、rs2229094位點(diǎn)、rs1041981位點(diǎn)和rs1800629位點(diǎn)；所述產(chǎn)品具有評(píng)價(jià)或輔助評(píng)價(jià)待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)性的功能。
其中，所述rs2009658位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體中自5’末端起第31570467位核苷酸；所述rs2009658位點(diǎn)的核苷酸為G或C。
所述rs1800683位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572294位核苷酸；所述rs1800683位點(diǎn)的核苷酸為A或G。
所述rs2229094位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572779位核苷酸；所述rs2229094位點(diǎn)的核苷酸為C或T。
所述rs1041981位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31573007位核苷酸；所述rs1041981位點(diǎn)的核苷酸為C或A。
所述rs1800629位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31575254位核苷酸；所述rs1800629位點(diǎn)的核苷酸為A或G。
在本發(fā)明中，所述用于檢測(cè)單體型M的物質(zhì)由用于檢測(cè)所述rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)、用于檢測(cè)所述rs1800683位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)、用于檢測(cè)所述rs2229094位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)、用于檢測(cè)所述rs1041981位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)和用于檢測(cè)所述rs1800629位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)組成。
其中，用于檢測(cè)所述rs2009658位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)甲或成套單鏈DNA分子甲；所述引物對(duì)甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子甲由序列表中序列1所示的單鏈DNA、序列表中序列2所示的單鏈DNA和序列表中序列3所示的單鏈DNA組成。用于檢測(cè)所述rs1800683位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)乙或成套單鏈DNA分子乙；所述引物對(duì)乙由序列表中序列4所示的單鏈DNA和序列表中序列5所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子乙由序列表中序列4所示的單鏈DNA、序列表中序列5所示的單鏈DNA和序列表中序列6所示的單鏈DNA組成。用于檢測(cè)所述rs2229094位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)丙或成套單鏈DNA分子丙；所述引物對(duì)丙由序列表中序列7所示的單鏈DNA和序列表中序列8所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子丙由序列表中序列7所示的單鏈DNA、序列表中序列8所示的單鏈DNA和序列表中序列9所示的單鏈DNA組成。用于檢測(cè)所述rs1041981位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)丁或成套單鏈DNA分子??；所述引物對(duì)丁由序列表中序列10所示的單鏈DNA和序列表中序列11所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子丁由序列表中序列10所示的單鏈DNA、序列表中序列11所示的單鏈DNA和序列表中序列12所示的單鏈DNA組成。用于檢測(cè)所述rs1800629位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)為引物對(duì)戊或成套單鏈DNA分子戊；所述引物對(duì)戊由序列表中序列13所示的單鏈DNA和序列表中序列14所示的單鏈DNA組成；所述成套單鏈DNA分子戊由序列表中序列13所示的單鏈DNA、序列表中序列14所示的單鏈DNA和序列表中序列15所示的單鏈DNA組成。
所述產(chǎn)品中，還可含有記載有如上(b1)或(b2)所示內(nèi)容的可讀性載體。
在本發(fā)明中，所述待測(cè)人最好來(lái)自中國(guó)漢族人群。
本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)中國(guó)漢族人群病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)LTA基因SNP-rs2009658位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)核罹患風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著的相關(guān)性。攜帶LTA-rs2009658GC基因型和LTA-TNF“GGCCG”單體型的人群在結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高。本發(fā)明為炎性及免疫相關(guān)基因SNP與結(jié)核易感性之間的關(guān)聯(lián)提供了新見(jiàn)解，對(duì)結(jié)核易感基因篩查與預(yù)防有重大價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。
下述實(shí)施例中利用全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP304試劑盒)進(jìn)行全血基因組DNA的提取。目標(biāo)SNP的篩選采用The International HapMap(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)。中國(guó)漢族人基因型數(shù)據(jù)從Haploview4.2數(shù)據(jù)庫(kù)獲取(http：//www.broad.mit.edu/haploview)。應(yīng)用Sequenom公司的基質(zhì)輔助激光解析時(shí)間飛行質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF)中的iPLEX試劑盒進(jìn)行SNP基因型分析。
實(shí)施例1、LTA基因單核苷酸多態(tài)性rs2009658在檢測(cè)結(jié)核易感性中的應(yīng)用
一、患者及分組情況
本發(fā)明所涉及的病例-對(duì)照研究共選擇解放軍第三○九醫(yī)院收治的已確診病例2039例，分為兩組：(1)結(jié)核病組：全軍結(jié)核病研究所收治的臨床上經(jīng)影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查及抗結(jié)核治療而確診的活動(dòng)性結(jié)核病患者1032例，其中男605例，女427例，平均年齡(39.30±19.29)歲。包括肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性心包炎、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性腹膜炎、泌尿系結(jié)核、骨關(guān)節(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核等。(2)非結(jié)核對(duì)照組：臨床上經(jīng)影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查及治療效果而確診的非結(jié)核疾病患者1007例，其中男534例，女473例，平均年齡(45.23±24.23)歲。
二、人外周血白細(xì)胞基因組DNA提取
采集患者外周靜脈血2ml，置于抗凝管中。應(yīng)用全基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司產(chǎn)品)，按照說(shuō)明書(shū)從1ml外周血中提取白細(xì)胞基因組DNA，溶解于0.1×TE緩沖液中(10mmol/L Tris-1mmol/LEDTA，pH8.0)，于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
三、標(biāo)簽SNP的選擇
使用HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)的人類(lèi)全基因組SNP的基因型數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)簽位點(diǎn)的選擇。篩選標(biāo)簽位點(diǎn)遵循連鎖不平衡系數(shù)r2＞0.8的原則，即標(biāo)簽位點(diǎn)與被它代表的位點(diǎn)之間有足夠強(qiáng)的連鎖不平衡(r2值＞0.8)的連鎖強(qiáng)度。再使用Haploview 4.2程序，對(duì)從HapMap下載下來(lái)的中國(guó)漢族人(CHB)基因型數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)簽位點(diǎn)的選擇，所選擇的位點(diǎn)僅限最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)＞0.05。
四、SNP質(zhì)譜分析
應(yīng)用Sequenom公司的基質(zhì)輔助激光解析時(shí)間飛行質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF)中的iPLEX試劑盒進(jìn)行SNP基因型分析。其步驟簡(jiǎn)述如下：
(1)多重PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增：5μl反應(yīng)體系中包括：1×反應(yīng)buffer，10ng基因組DNA，0.5U熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(HotStarTaq，Qiagen)，500μmol脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，每個(gè)位點(diǎn)100nmol上游和下游引物，置于384孔板中，使用ABI-9700PCR擴(kuò)增儀，于94℃ 15min活化DNA聚合酶后，于94℃變性20s，56℃退火30s和72℃延伸60s，循環(huán)45次。PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(2)去除未反應(yīng)的引物和dNTPs：PCR擴(kuò)增后，在反應(yīng)體系中加入2μl 0.3U蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)，于37℃下恒溫20min進(jìn)行多余堿基消減反應(yīng)，再置于85℃放置5min進(jìn)行滅活。
(3)單堿基延伸PCR反應(yīng)：應(yīng)用iPLEX試劑盒。調(diào)節(jié)延伸引物的濃度，降低質(zhì)譜峰圖的背景噪音后，在9μl反應(yīng)體系中，加入100μmol ddNTP 0.2μl、0.04μl 0.05U的上述DNA聚合酶、625-1250nmol/L的延伸引物。先置PCR擴(kuò)增儀94℃ 30s；再進(jìn)行延伸PCR反應(yīng)循環(huán)：置94℃5s，5×(52℃5s+80℃5s)，該循環(huán)進(jìn)行200次；然后置94℃5s，52℃ 5s，80℃5s，該循環(huán)進(jìn)行40次；最后置72℃延伸3min，置4℃保存。
(4)純化的延伸反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析：上述樣品應(yīng)用6mg樹(shù)脂脫鹽處理后，應(yīng)用自動(dòng)機(jī)械臂點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至Sequenom的384孔質(zhì)譜芯片上，另在384孔質(zhì)譜芯片上設(shè)置4個(gè)孔的重復(fù)質(zhì)控樣品。在質(zhì)譜分型系統(tǒng)中對(duì)點(diǎn)樣后的質(zhì)譜芯片進(jìn)行基因分型。
(5)數(shù)據(jù)采集和基因型分析：不同的波譜峰形狀代表電荷標(biāo)記的不同質(zhì)量。如果產(chǎn)物中存在2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)有1個(gè)等位基因，那么該等位基因是純合子；如果質(zhì)譜儀捕捉到4個(gè)不同的波譜峰，那么2個(gè)單核苷酸多態(tài)性是雜合子。通過(guò)操作界面Typer 4.0軟件包讀取質(zhì)譜峰圖，獲得基因型數(shù)據(jù)。
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用Stata statistical package(version 10.0；StataCorp LP，College Station，TX，USA)軟件，結(jié)核組與非結(jié)核對(duì)照組等位基因頻率和基因型差異采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)表明有顯著性差異。非結(jié)核對(duì)照樣本的各個(gè)SNP位點(diǎn)采用Hardy-Weinberg Equilibrium(HWE)平衡采用數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwal.p1)中的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行平衡檢驗(yàn)，當(dāng)P＞0.05時(shí)表示通過(guò)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)。Akaike信息標(biāo)準(zhǔn)被用于選取每個(gè)SNP最保守的遺傳模型。通過(guò)非條件logistic回歸計(jì)算目標(biāo)SNP基因型的比值比(OR)和95％置信區(qū)間(CI)并輔以年齡和性別加以校正。
各SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡(LD)強(qiáng)度按照常規(guī)的做法采用Lewontin標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)D和連鎖不平衡系數(shù)r2來(lái)表示，單體域采用Haploview 4.2軟件的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行劃分。在各個(gè)單體域內(nèi)，采用基于Bayesian算法的PHASE 2.1軟件，推斷出每個(gè)樣品的單體型。隨后采用HAPLO.STATS軟件進(jìn)行單體型分析。具體的方法是：基于廣義線(xiàn)性模型，并輔以各種混雜因子的校正，進(jìn)行全局性(global)和針對(duì)單體型(haplotype-specific)的Hap.Score分析。各個(gè)單體域內(nèi)頻率＜0.03的單體型，合并為其他(others)項(xiàng)。使用100000次置換(simulations)檢驗(yàn)得到觀察P值，并計(jì)算各個(gè)單體型的Hap.Score值。對(duì)Bayesian算法獲得的雙單體型(diplotype)數(shù)據(jù)，同樣進(jìn)行非條件性logistic回歸分析，并校正年齡和性別。某一單體型的雙體型分為3類(lèi)：0份拷貝樣本、1份拷貝樣本和2份拷貝樣本，以0份拷貝樣本為參照，分析1份拷貝樣本和2份拷貝的結(jié)核易感性或抗結(jié)核性。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
通過(guò)基因型分析，從LTA和TNF基因選出7個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，即rs2009658位點(diǎn)、rs1800683位點(diǎn)、rs2229094位點(diǎn)、rs2229092位點(diǎn)、rs1041981位點(diǎn)、rs1800629位點(diǎn)和rs3093662位點(diǎn)。其中，所述rs2009658位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體中自5’末端起第31570467位核苷酸；所述rs2009658位點(diǎn)的核苷酸為G或C。所述rs1800683位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572294位核苷酸；所述rs1800683位點(diǎn)的核苷酸為A或G。所述rs2229094位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31572779位核苷酸；所述rs2229094位點(diǎn)的核苷酸為C或T。所述rs1041981位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31573007位核苷酸；所述rs1041981位點(diǎn)的核苷酸為C或A。所述rs1800629位點(diǎn)為人類(lèi)基因組6號(hào)染色體自5’末端起第31575254位核苷酸；所述rs1800629位點(diǎn)的核苷酸為A或G。
步驟四中用于檢測(cè)所述rs2009658位點(diǎn)的上下游引物為引物1和引物2，延伸引物為引物3。引物1和引物2是一對(duì)引物，擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)前后約200-300bp的產(chǎn)物，引物3是第3條引物即單堿基延伸引物，約15-20bp，只在200-300bp產(chǎn)物的一條鏈上延伸1個(gè)堿基。最終通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)16-21bp延伸子的分子量大小對(duì)應(yīng)基因型。
引物1：5’-ACGTTGGATGCCCCTCTAACACTCTCCAAG-3’(序列1)；
引物2：5’-ACGTTGGATGAGCAGTTTCTAAAGATGAC-3’(序列2)；
引物3：5’-tCCTCAAATATTATTACTGCTACT-3’(序列3)。
步驟四中用于檢測(cè)所述rs1800683位點(diǎn)的上下游引物為引物4和引物5，延伸引物為引物6。引物4和引物5是一對(duì)引物，擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)前后約200-300bp的產(chǎn)物，引物6是第3條引物即單堿基延伸引物，約15-20bp，只在200-300bp產(chǎn)物的一條鏈上延伸1個(gè)堿基。最終通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)16-21bp延伸子的分子量大小對(duì)應(yīng)基因型。
引物4：5’-ACGTTGGATGTCTATAAAGGGACCTGAGCG-3’(序列4)；
引物5：5’-ACGTTGGATGTAGTCCAAAGCACGAAGCAC-3’(序列5)；
引物6：5’-ggggtAGCCTCACCTGCTGTG-3’(序列6)。
步驟四中用于檢測(cè)所述rs2229094位點(diǎn)的上下游引物為引物7和引物8，延伸引物為引物9。引物7和引物8是一對(duì)引物，擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)前后約200-300bp的產(chǎn)物，引物9是第3條引物即單堿基延伸引物，約15-20bp，只在200-300bp產(chǎn)物的一條鏈上延伸1個(gè)堿基。最終通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)16-21bp延伸子的分子量大小對(duì)應(yīng)基因型。
引物7：5’-ACGTTGGATGCCAGAAGGAGGAGGTGTAG-3’(序列7)；
引物8：5’-ACGTTGGATGTGACACCACCTGAACGTCTC-3’(序列8)；
引物9：5’-tTTCCTCCCAAGGGTG-3’(序列9)。
步驟四中用于檢測(cè)所述rs1041981位點(diǎn)的上下游引物為引物10和引物11，延伸引物為引物12。引物10和引物11是一對(duì)引物，擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)前后約200-300bp的產(chǎn)物，引物12是第3條引物即單堿基延伸引物，約15-20bp，只在200-300bp產(chǎn)物的一條鏈上延伸1個(gè)堿基。最終通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)16-21bp延伸子的分子量大小對(duì)應(yīng)基因型。
引物10：5’-ACGTTGGATGTGTTGGCCTCACACCTTCAG-3’(序列10)；
引物11：5’-ACGTTGGATGACCAATGAGGTGAGCAGCAG-3’(序列11)；
引物12：5’-GCAGCAGGTTTGAGG-3’(序列12)。
步驟四中用于檢測(cè)所述rs1800629位點(diǎn)的上下游引物為引物13和引物14，延伸引物為引物15。引物13和引物14是一對(duì)引物，擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)前后約200-300bp的產(chǎn)物，引物15是第3條引物即單堿基延伸引物，約15-20bp，只在200-300bp產(chǎn)物的一條鏈上延伸1個(gè)堿基。最終通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)16-21bp延伸子的分子量大小對(duì)應(yīng)基因型。
引物13：5’-ACGTTGGATGGGTCCCCAAAAGAAATGGAG-3’(序列13)；
引物14：5’-ACGTTGGATGGATTTGTGTGTAGGACCCTG-3’(序列14)；
引物15：5’-taggcCCCTGGAGGCTGAACCCCGTCC-3’(序列15)。
這些SNP的具體信息、染色體位置及等位基因頻率見(jiàn)表1。所有位點(diǎn)在非結(jié)核對(duì)照組樣本中均通過(guò)了Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P＞0.01)。如表1所示，LTA-rs2009658等位基因頻率在結(jié)核組和非結(jié)核對(duì)照組之間存在顯著性差異(P＝0.048)。如表2所示，在共顯性遺傳模型下，非條件logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)LTA-rs2009658位點(diǎn)GC基因型與顯著增加的結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P＝0.043，OR 1.123，95％CI 1.007-1.505)，而GG基因型則沒(méi)有(P＝0.480，OR 1.212，95％CI 0.711-2.066)。如表3所示，在顯性遺傳模型下，LTA-rs2009658位點(diǎn)((GC+GG)vs CC)基因型與顯著增加的結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P＝0.037，OR 1.229，95％CI 1.012-1.492)，而其它6個(gè)SNP無(wú)論是在顯性遺傳模型還是隱性遺傳模型下均沒(méi)有顯著的結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)。
表1LTA和TNF基因SNP位點(diǎn)信息及基因頻率一覽表
表2共顯性遺傳模型下LTA和TNF基因7個(gè)SNP基因型頻率在結(jié)核組與對(duì)照組之間的分布
表3顯性或隱性遺傳模型下LTA和TNF基因7個(gè)SNP基因型頻率在結(jié)核組與對(duì)照組之間的分布
即根據(jù)以上結(jié)果，可知：(a1)在共顯性遺傳模型下，所述rs2009658位點(diǎn)為GC基因型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于所述rs2009658位點(diǎn)為CC基因型的待測(cè)人；(a2)在顯性遺傳模型下，所述rs2009658位點(diǎn)為GC基因型或GG基因型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于所述rs2009658位點(diǎn)為CC基因型的待測(cè)人。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)7個(gè)SNP兩兩位點(diǎn)間的連鎖不平衡強(qiáng)度，我們采用Haploview發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由rs2009658、rs1800683、rs2229094、rs1041981和rs1800629等5個(gè)SNP組成的單體域，該單體域同時(shí)覆蓋了LTA和TNF兩個(gè)基因，但是LTA-rs2229092和TNF-rs3093662在該單體域之外。從理論上來(lái)說(shuō)，該單體域應(yīng)該包含多達(dá)64個(gè)單體型，然而實(shí)際上我們從目標(biāo)人群中只發(fā)現(xiàn)了5個(gè)最常見(jiàn)的單體型(CATAG，CGTCG，GGCCG，CATAA，CGCCG)，這些常見(jiàn)單體型在結(jié)核組和對(duì)照組中占比分別為99.81％和97.58％(表4)。全局性分?jǐn)?shù)檢驗(yàn)表明該單體域中的這些單體型在結(jié)核組和非結(jié)核對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異(Global P＝0.06292，df＝5)，但是“GGCCG”單體型頻率在結(jié)核組和非結(jié)核對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.042)，這一統(tǒng)計(jì)學(xué)差異在經(jīng)過(guò)100000次置換后依然成立(Psim＝0.042，表4)。進(jìn)一步Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，單體型“GGCCG”與結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)增加之間存在顯著地聯(lián)系(P＝0.025，OR 1.239，95％CI 1.027-1.494，表4)。
表4LTA和TNF基因常見(jiàn)單體型與結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)間的聯(lián)系
a.P值：?jiǎn)误w型頻率在結(jié)核組與對(duì)照組之間的差異.
b.Psim：100000次置換后的差異.
c.非條件性logistic回歸分析，加以年齡和性別校正.
d.NA：不適用.
我們對(duì)LTA-TNF基因多態(tài)性雙體型與結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系也進(jìn)行了Logistic回歸分析。如表5所示，由“GGCCG”單體型組成的雙體型在0份拷貝與1份拷貝之間存在著相當(dāng)高的結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)(P＝0.030，OR 1.249，95％CI 1.022-1.526)。此外，我們發(fā)現(xiàn)雙體型頻率在結(jié)核組和非結(jié)核對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異(P＝0.064，表5)。
表5LTA和TNF基因SNP雙體型與結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系
a.非條件性logistic回歸分析，輔以年齡和性別校正.
b.全局性檢驗(yàn).
即根據(jù)以上結(jié)果可知：(b1)攜帶“GGCCG”單體型的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶“CATAG”單體型的待測(cè)人；(b2)攜帶雙體型“GGCCG”1份拷貝的待測(cè)人患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)高于不攜帶“GGCCG”單體型的待測(cè)人。
本發(fā)明通過(guò)中國(guó)漢族人群病例對(duì)照研究，首次發(fā)現(xiàn)LTA-rs2009658位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)聯(lián)，LTA-rs2009658GC基因型及“GGCCG”單體型攜帶者罹患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)更好。這一研究成果為篩選和預(yù)測(cè)結(jié)核病提供了新途徑，為研發(fā)人群結(jié)核篩查試劑盒提供了理論依據(jù)。