本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條技術(shù)，用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒。

背景技術(shù)：

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的革蘭氏陰性病原菌，一般寄生于動(dòng)物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可引起帶菌動(dòng)物發(fā)生以出血性敗血病或呼吸系統(tǒng)疾病。家畜中以牛、豬、兔、綿羊發(fā)病較多，山羊、鹿、駱駝、馬、驢、犬、貓和水貂等亦可感染發(fā)病。禽類中以雞、火雞和鴨最易感，鵝、鴿次之。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將Pm分為5個(gè)血清型(A、B、D、E、F)。在我國，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛的主要為莢膜A型和B型Pm，莢膜A型主要表現(xiàn)為牛纖維素性化膿性肺炎，莢膜B型主要表現(xiàn)為牛出血性敗血癥。由于Pm可以在同種或不同種動(dòng)物間互相傳染，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重。

多殺性巴氏桿菌病的病原學(xué)診斷方法主要有細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等，這些方法費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、準(zhǔn)確率低，不適合臨床快速診斷的需要。近年來PCR方法已經(jīng)大量應(yīng)用在巴氏桿菌病的診斷中，根據(jù)多殺性巴氏桿菌保守基因設(shè)計(jì)引物，可以診斷莢膜A、B、D、E和F 5個(gè)血清型。但由于PCR方法需要特殊的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，在基層條件差和技術(shù)人員匱乏的情況下，現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地快速診斷很難實(shí)現(xiàn)。此外，現(xiàn)有的采用PCR診斷多殺性巴氏桿菌的報(bào)道中，其設(shè)計(jì)引物所依據(jù)的保守基因序列有多種，有的以多殺性巴氏桿菌毒素基因(toxA)作為保守序列設(shè)計(jì)引物(CN104073567A)；有的以多殺性巴氏桿菌的的PlpB基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物(“豬多殺性巴氏桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立”，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014年12月)，而根據(jù)不同的靶標(biāo)(保守基因)設(shè)計(jì)的引物序列不同，對(duì)巴氏桿菌的診斷和檢測(cè)效果也存在較大差異，因此，選擇何種靶標(biāo)作為引物設(shè)計(jì)的依據(jù)也是PCR診斷多殺性巴氏桿菌的難點(diǎn)之一。

LAMP技術(shù)雖然可以進(jìn)行核酸的恒等溫?cái)U(kuò)增，但由于它的反應(yīng)溫度在60℃-65℃，反應(yīng)時(shí)間在30-60min，仍然不能在常溫下進(jìn)行，并且不能對(duì)核酸粗提物的DNA樣本進(jìn)行直接擴(kuò)增。因此，從診斷的時(shí)效性方面考慮，亟需一種可用于現(xiàn)場(chǎng)恒等溫條件下的簡易核酸檢測(cè)技術(shù)。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)是目前新出現(xiàn)的一種體外快速核酸擴(kuò)增技術(shù)，在37℃左右就能發(fā)生反應(yīng)，并且僅需十幾分鐘就能擴(kuò)增出痕量級(jí)的檢測(cè)產(chǎn)物。同時(shí)RPA可以完成核酸粗提物的擴(kuò)增，它可以通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴(kuò)增曲線和側(cè)流層析試紙條(Lateral Flow Dipstick，LFD)三種方式檢測(cè)結(jié)果，這三種方式的引物與探針反應(yīng)原理是不同的?；镜腞PA擴(kuò)增只需上下游引物，產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測(cè)，而RPA-nfo和RPA-exo反應(yīng)，是通過不同的探針結(jié)合到模板互補(bǔ)鏈后再通過核酸內(nèi)切酶IV(nfo)和核酸內(nèi)切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，這兩種方法分別通過LFD(nfo)和實(shí)時(shí)熒光(exo)兩種不同的手段檢測(cè)結(jié)果。凝膠電泳和熒光擴(kuò)增曲線法仍然依賴實(shí)驗(yàn)室和特殊儀器設(shè)備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)方法。將RPA技術(shù)與LFD技術(shù)結(jié)合，通過LFD讀取結(jié)果，既不要求特殊儀器設(shè)備，也無需復(fù)雜的樣品處理，借助恒溫水浴鍋用LFD就可以通過肉眼觀察結(jié)果。

但RPA技術(shù)屬于新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其應(yīng)用并不十分普遍，其主要技術(shù)難點(diǎn)在于特異性引物和探針的設(shè)計(jì)和篩選，而引物/探針的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA-nfo的結(jié)果是至關(guān)重要的，目前并沒有像PCR擴(kuò)增技術(shù)那樣專門的引物/探針的設(shè)計(jì)軟件，也沒有較多的文獻(xiàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)提供技術(shù)依據(jù)。經(jīng)相關(guān)檢索，目前還未有針對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

綜上，對(duì)于多殺性巴氏桿菌的RPA-LFD檢測(cè)，目前尚無明確可借鑒的思路和結(jié)果，還需要技術(shù)人員做大量和深入的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針；其RPA-nfo正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，其RPA-nfo探針序列如SEQ ID NO.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；(SEQ ID NO.2)

探針：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'(SEQ ID NO.3)。

本發(fā)明的探針，在其5'端用FAM標(biāo)記，距離5'端30個(gè)堿基左右的位置處用dSpacer替代一個(gè)堿基，3’端用C3-spacer阻斷。

需要說明的是，與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA-nfo反應(yīng)所需引物的長度通常為30～35bp，引物過短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性；但長引物也并不一定能提高擴(kuò)增性能，反而還會(huì)增加形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性。LF探針長度一般在46～52bp，nfo核酶距離探針5'端30個(gè)堿基左右，距離3'端16～22個(gè)堿基左右，個(gè)別堿基的替換或增減都會(huì)對(duì)探針的特異性產(chǎn)生影響。因此，引物的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。RPA技術(shù)正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設(shè)計(jì)軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引物設(shè)計(jì)原則提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針組合，然后進(jìn)行試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化、篩選才能得到。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了多組不同的引物和探針組合，經(jīng)試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證后，確定本發(fā)明所列出的上述引物和探針組合，其檢測(cè)效果最佳。

本發(fā)明的第二方面，提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。

進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和RPA-nfo反應(yīng)液。

所述陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為：包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；

優(yōu)選的，所述包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有192個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；

所述含有192個(gè)堿基的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示。

5'-CGATTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTGAAATGGGAAATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCTTTTATTTGGCTTGTGGCAAAGAAAAGCACAGTTTTGTTGGGCGGAGTTTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATT-3'；(SEQ ID NO.4)

上述含有192個(gè)堿基的核苷酸片段是從多殺性巴氏桿菌核酸陽性的臨床病料DNA模板中克隆得到。

所述陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為為pEASY-Y3空載質(zhì)粒。

所述RPA-nfo反應(yīng)液，包括：recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂(MgAc)溶液、側(cè)流層析試紙條(LFD；特異性檢測(cè)生物素與FAM標(biāo)記基因擴(kuò)增產(chǎn)物)、LFD檢測(cè)緩沖液(1×PBS+0.1％吐溫20)、滅菌去離子雙蒸水(ddH₂O)，TE緩沖液、10％(w/v)SDS、2％(w/v)蛋白酶K和多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

本發(fā)明的第三方面，提供一種非診斷目的的檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：

(1)檢測(cè)樣本DNA的提取或檢測(cè)樣本的現(xiàn)場(chǎng)裂解處理；

(2)以步驟(1)中處理的樣本為模板，篩選優(yōu)化引物和探針，進(jìn)行RPA-nfo擴(kuò)增；

(3)用LFD檢測(cè)上述RPA-nfo擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌。

步驟(2)中，RPA-nfo擴(kuò)增體系為25μL：其中包括1.0μL(10μM)的正向引物，1.0μL(10μM)的反向引物，0.3μL(10μM)的探針，rehydration緩沖液14.75μL，待測(cè)樣本DNA或粗裂解產(chǎn)物2μL，ddH₂O 4.7μL；將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應(yīng)管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接在37℃恒溫水浴鍋處理25min。

步驟(3)的具體步驟為：取RPA反應(yīng)產(chǎn)物1μL與49μL LFD檢測(cè)緩沖液混合，將LFD垂直浸入，5min之內(nèi)觀察結(jié)果，若同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶，則該樣品中多殺性巴氏桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對(duì)照條帶則說明該樣品中不含多殺性巴氏桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測(cè)不成立。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明提供的RPA技術(shù)是最新的一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，在檢測(cè)時(shí)間上均優(yōu)于PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，其反應(yīng)在25min內(nèi)就能從單個(gè)模板分子得到大約10¹²擴(kuò)增產(chǎn)物。

(2)本發(fā)明提供的多殺性巴氏桿菌RPA-nfo檢測(cè)引物與探針組合以及試劑盒，最低可以檢測(cè)到6拷貝/反應(yīng)的多殺性巴氏桿菌DNA，RPA-nfo檢測(cè)引物與探針可特異性擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌，但與牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、絲狀支原體絲狀亞種SC型等細(xì)菌均無交叉反應(yīng)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特性。

(3)本發(fā)明提供的多殺性巴氏桿菌RPA-nfo引物與探針組合以及試劑盒不僅可用于多殺性巴氏桿菌分菌株的檢測(cè)，還可用于鼻拭子、氣溶膠、血液、組織等臨床樣本的檢測(cè)。

(4)本發(fā)明提供的多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)方法使用方便，無需特殊儀器設(shè)備，在37℃恒溫水浴鍋中處理25min就能對(duì)待測(cè)樣本的粗裂解物進(jìn)行多殺性巴氏桿菌DNA的檢測(cè)，適合現(xiàn)場(chǎng)或基層巴氏桿菌病的診斷工作。

(5)使用本發(fā)明的試劑盒能夠有效診斷出多殺性巴氏桿菌病原，及時(shí)的發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌陽性動(dòng)物，為巴氏桿菌病的防制提供技術(shù)保障。

附圖說明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說明書附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)的進(jìn)一步理解，本申請(qǐng)的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本申請(qǐng)，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)的不當(dāng)限定。

圖1：多殺性巴氏桿菌RPA-nfo引物與探針的篩選，A：3對(duì)引物與探針的電泳圖，B：A圖對(duì)應(yīng)引物與探針的LFD結(jié)果，其中，1：Kmt1-F1-R-LF(192bp和150bp)，2：Kmt1-F2-R-LF(189bp和150bp)，3：Kmt1-F3-R-LF(179bp和150bp)。B圖中a：為3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，b：是以pEASY-T3空載質(zhì)粒的陰性對(duì)照。

圖2：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD靈敏性檢測(cè)，其中，1～7：模板分別為6.0×10⁶～6.0×10⁰拷貝/μL陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，8：陰性對(duì)照，9：模板為ddH₂O。

圖3：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD特異性檢測(cè)，其中，+：模板為3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA，－：陰性對(duì)照。1～5：模板分別為莢膜A、B、D、E、F型巴氏桿菌基因組DNA；6～12：模板依次分別為牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、絲狀支原體絲狀亞種SC型基因組DNA。

圖4：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD重復(fù)性檢測(cè)，其中1、2、3：分別在三個(gè)獨(dú)立時(shí)間段進(jìn)行的試驗(yàn)，模板為3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA，2是1檢測(cè)完1周后進(jìn)行的重復(fù)性試驗(yàn)，3是2檢測(cè)完1個(gè)月后進(jìn)行的重復(fù)性試驗(yàn)。

圖5：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD臨床樣本的檢測(cè)，其中，+：模板為3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA，－：陰性對(duì)照組，1～5：多殺性巴氏桿菌核酸陽性鼻拭子樣本DNA，7：多殺性巴氏桿菌核酸陽性氣溶膠樣本DNA，9～11：多殺性巴氏桿菌核酸陽性奶牛肺臟組織DNA樣本，13：多殺性巴氏桿菌核酸陽性血液樣本DNA，6、8、12、14：分別為多殺性巴氏桿菌核酸陰性鼻拭子、氣溶膠、牛肺臟組織和血液臨床樣本DNA。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請(qǐng)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請(qǐng)的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中還未有針對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。基于此，本發(fā)明提出了一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒。

在本申請(qǐng)的一種實(shí)施方案中，提供了一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針的序列如下所示：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；

探針：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。

莢膜是多殺性巴氏桿菌表面的主要組分之一，也是其重要的毒力因子之一，在多殺性巴氏桿菌抗吞噬的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。多殺性巴氏桿菌中負(fù)責(zé)莢膜合成的基因在其基因組中成簇存在，在所有與多殺性巴氏桿菌莢膜形成的相關(guān)基因中，hyaD、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD等基因表現(xiàn)出了相應(yīng)的莢膜型特異性，Townsend等(2001)利用這些基因不同位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)引物，用于鑒定多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的分型。

脂多糖是多殺性巴氏桿菌表面的另一種重要組成成分，也是其主要毒力因子之一。有報(bào)道在多殺性巴氏桿菌Heddleston1、2、3、4、5、8、10、11、12、13、14及15型菌株的外核編碼簇中均存在一個(gè)高度保守的基因hptE，該基因與fpg相鄰，其所編碼的庚糖基轉(zhuǎn)移酶(HptE)對(duì)于多殺性巴氏桿菌LPS內(nèi)核多糖和外核多糖之間的相互連接是必需的。由于多殺性巴氏桿菌LPS的外核編碼簇位于兩個(gè)保守的基因priA和fpg之間，并且不同Heddleston血清型菌株外核編碼簇的長短不一，因此可以分別基于priA和HptE作為起始和終止位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)Heddleston血清型多殺性巴氏桿菌的診斷。

綜上，對(duì)于多殺性巴氏桿菌而言，能夠作為靶標(biāo)序列的保守基因的種類有多種，但以不同的保守基因區(qū)域設(shè)計(jì)的引物不同，對(duì)多殺性巴氏桿菌的診斷和檢測(cè)的效果不同。本申請(qǐng)對(duì)用于設(shè)計(jì)引物的多殺性巴氏桿菌的靶標(biāo)序列進(jìn)行了優(yōu)化篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Kmt1基因作為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)RPA引物，可以同時(shí)診斷多殺性巴氏桿菌莢膜A、B、D、E和F 5個(gè)血清型，并能提高檢測(cè)分析的特異性。

另外，RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)，常規(guī)的PCR引物多半是不適用于RPA分析的，因?yàn)镽PA引物比一般的PCR引物要長，通常需要達(dá)到30-35個(gè)堿基，引物過短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性，降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；但長引物也并不一定能提高擴(kuò)增性能，反而還會(huì)增加形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性。另外，在設(shè)計(jì)RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴(kuò)增的關(guān)鍵因素。但RPA的引物和探針設(shè)計(jì)不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，目前還不能僅根據(jù)序列判斷引物的擴(kuò)增性能，需要不斷的摸索條件進(jìn)行優(yōu)化，通過設(shè)計(jì)多組候選引物進(jìn)行測(cè)試和篩選。對(duì)于RPA引物的設(shè)計(jì)，目前，只有設(shè)計(jì)引物和探針的長度、GC含量等簡單信息，試驗(yàn)表明，一個(gè)堿基的刪減都有可能影響RPA的擴(kuò)增性能與成敗。RPA技術(shù)沒有相應(yīng)的引物和探針的設(shè)計(jì)軟件，需要通過多次的試驗(yàn)篩選和優(yōu)化。

本申請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)過程中，設(shè)計(jì)了多組不同的引物和探針，并分別進(jìn)行組合，經(jīng)RPA反應(yīng)后分別檢測(cè)其特異性和擴(kuò)增效率，以篩選最優(yōu)的可用于臨床檢測(cè)的引物和探針組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上述的引物和探針組合對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)的特異性和靈敏度最優(yōu)。

在本申請(qǐng)的另一種實(shí)施方案中，提供了一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合、陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和RPA-nfo反應(yīng)液。

本申請(qǐng)通過將上述優(yōu)選的引物和探針組合設(shè)計(jì)成試劑盒，結(jié)合側(cè)流層析試紙條讀取檢測(cè)結(jié)果，方便對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。

本發(fā)明實(shí)施例中所用一些材料和試劑如下：多殺性巴氏桿菌A型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC390)、多殺性巴氏桿菌B型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC391)、多殺性巴氏桿菌D型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC392)、多殺性巴氏桿菌E型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC393)、多殺性巴氏桿菌F型標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC394)、絲狀支原體絲狀亞種SC型(MmmSC)PG1株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌等常見微生物核酸樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床上確診為巴氏桿菌病陽性的鼻拭子、血液、肺臟組織DNA樣本等均由山東師范大學(xué)反芻動(dòng)物疾病研究中心保存。引物與探針由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNAAmplification nfo Kits購自TwistDX公司，側(cè)流層析試紙條(HybriDetect Dipsticks)購自Milenia公司，pEASY-T3載體試劑盒和PCR mix購自北京全式金生物科技有限公司。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

本發(fā)明實(shí)施例中所用的未進(jìn)行具體說明試驗(yàn)材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗(yàn)材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

實(shí)施例1：引物與探針的設(shè)計(jì)和篩選

1.引物與探針的設(shè)計(jì)

目前，RPA-nfo引物與探針的設(shè)計(jì)沒有具體規(guī)則，必須經(jīng)過RPA反應(yīng)后檢測(cè)其特異性和擴(kuò)增效率，才能篩選獲得可用于臨床檢測(cè)的引物與探針。實(shí)驗(yàn)中需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引物與探針進(jìn)行優(yōu)化和篩選，個(gè)別堿基的替換或增減都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。

本發(fā)明根據(jù)多殺性巴氏桿菌特異性的Kmt1基因(GengBank No.AF016259)分別設(shè)計(jì)引物和探針，分別見表1。設(shè)計(jì)引物時(shí)，首先在Genebank數(shù)據(jù)上BLAST了引物設(shè)計(jì)區(qū)域Kmt1基因的保守性，均與現(xiàn)有多殺性巴氏桿菌菌株序列100％匹配。再對(duì)設(shè)計(jì)的上下游引物和探針進(jìn)行BLAST對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不與其他基因序列相匹配，保證了引物序列的特異性。

表1引物對(duì)與探針序列

注：Biotin：生物素標(biāo)記；FAM：羧基熒光素標(biāo)記；dSpacer：核苷酸堿基類似物，是nfo核酸酶切割位點(diǎn)；C3-Spacer：聚合酶延伸阻斷物。

2.利用RPA-nfo擴(kuò)增反應(yīng)篩選引物和探針

通過建立多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)方法，利用RPA擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)引物和探針進(jìn)行篩選，具體步驟如下：

(1)陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的制備：

①模板DNA的提?。簩?duì)本實(shí)驗(yàn)室通過PCR檢測(cè)多殺性巴氏桿菌陽性的奶牛肺臟組織提取基因組DNA。

②PCR擴(kuò)增：以提取的DNA為模板，用引物Kmt1-S：5'-C G A T T G C C G C G A A A T T G A G T-3'，Kmt1-A：5'-A A T A A C G T C C A A T C A G T T G C-3'，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL，包括2×PCR mix：25μL，上下游引物各2μL，模板2μL，ddH₂O 19μL。反應(yīng)條件為：94℃3min，94℃30sec、60℃30sec、72℃20sec，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。

③重組質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的建立：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化回收，然后連接pEASY-T3載體，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒后雙酶切鑒定，將陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)。序列正確的重組質(zhì)粒命名為pEAST-T3-Kmt1，將上述陽性質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，為110ng/μL，按照下述公式計(jì)算出每μL質(zhì)粒中的DNA拷貝數(shù)，結(jié)果為3.0×10¹⁰拷貝/μL，將該陽性質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。

拷貝數(shù)(copies/μL)＝質(zhì)粒濃度×10^-9×6.02×10²³/(660×質(zhì)?？傞L度)

(2)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為pEASY-T3空載質(zhì)粒。

(3)多殺性巴氏桿菌RPA-nfo反應(yīng)體系的建立

RPA-nfo反應(yīng)體系為25μL：

將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應(yīng)管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接置于37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)25min。

反應(yīng)結(jié)束后取1μL與49μLLFD檢測(cè)緩沖液混合，將LFD垂直浸入上述混合緩沖液，5min之內(nèi)觀察結(jié)果，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀：若同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶，則該樣品中多殺性巴氏桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對(duì)照條帶則說明該樣本中不含多殺性巴氏桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測(cè)不成立。

3.引物和探針的篩選結(jié)果

RPA技術(shù)屬于新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，目前尚無多殺性巴氏桿菌RPA檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)有分子生物學(xué)技術(shù)如LAMP等的多殺性巴氏桿菌相關(guān)的引物和探針并不一定適用于RPA，其引物和探針的設(shè)計(jì)原理和規(guī)則與PCR等擴(kuò)增技術(shù)也不相同，需經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和分析。

對(duì)表1中的多殺性巴氏桿菌RPA-nfo引物與探針組合分別進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)篩選，優(yōu)化出1組最優(yōu)的引物和探針組合，結(jié)果如圖1所示，3：為最優(yōu)引物與探針組合擴(kuò)增結(jié)果。2和4也出現(xiàn)了檢測(cè)條帶，但在反應(yīng)模板和反應(yīng)條件相同的情況下，3的檢測(cè)條帶最亮，說明擴(kuò)增效率最高，3的引物與探針組合擴(kuò)增效率高于2和4。

引物與探針序列見表1，經(jīng)篩選，Kmt1-F2、Kmt1-R、Kmt1-LF為最優(yōu)的引物和探針組合，以上述引物和探針組合在進(jìn)行多殺性巴氏桿菌DNA的檢測(cè)時(shí)，靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好(圖1)。

實(shí)施例2：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)方法的靈敏性、特異性和重復(fù)性考察

1.試驗(yàn)方法：

(1)多殺性巴氏桿菌RPA-LFD靈敏性檢測(cè)

將陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍倍比稀釋成6.0×10⁶～6.0×10⁰拷貝/μL，以本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的引物與探針按照上述實(shí)施例1中步驟(3)進(jìn)行RPA-nfo擴(kuò)增，DNA為模板分別為2μL，同時(shí)以pEASY-T3空載為陰性對(duì)照，檢驗(yàn)本方法的敏感性。

(2)多殺性巴氏桿菌RPA-LFD特異性檢測(cè)

以本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的引物與探針分別對(duì)莢膜A型多殺性巴氏桿菌、莢膜B型多殺性巴氏桿菌、莢膜D型多殺性巴氏桿菌、莢膜E型多殺性巴氏桿菌、莢膜F型多殺性巴氏桿菌，牛支原體、溶血曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、睡眠嗜組織菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、絲狀支原體絲狀亞種SC型基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA為陽性對(duì)照，同時(shí)以pEASY-T3空載為陰性對(duì)照，驗(yàn)證本方法的特異性。

(3)多殺性巴氏桿菌RPA-LFD重復(fù)性檢測(cè)

以本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的引物與探針分別對(duì)3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA、pEASY-T3空載質(zhì)粒進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)，分別在不同三個(gè)時(shí)間段進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，首次檢測(cè)、第2和第3次分別間隔1周和1個(gè)月后進(jìn)行，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性。

2.試驗(yàn)結(jié)果

(1)靈敏性考察結(jié)果

以10倍倍比稀釋的7個(gè)梯度的多殺性巴氏桿菌陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，25μL體系的RPA-LFD檢測(cè)限為6拷貝/反應(yīng)。說明本發(fā)明提供的引物、探針及其檢測(cè)方法的靈敏性高。

(2)特異性考察結(jié)果

對(duì)5種莢膜型多殺性巴氏桿菌和7種其他細(xì)菌作為對(duì)照菌株，分別進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，只有以多殺性巴氏桿菌DNA為模板的RPA-nfo反應(yīng)管在LFD的檢測(cè)線處出現(xiàn)條帶，為陽性結(jié)果；而其它細(xì)菌菌株以及pEASY-T3空載質(zhì)粒均未出現(xiàn)檢測(cè)條帶，均出現(xiàn)對(duì)照條帶。說明多殺性巴氏桿菌RPA-nfo引物與探針組合能特異性檢測(cè)多殺性巴氏桿菌，與其細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。

(3)重復(fù)性考察結(jié)果

在3個(gè)不同時(shí)間段進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，分別以3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果一致，結(jié)果如圖4所示，說明本試劑盒提供的引物、探針以及陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)。

需要說明的是，本發(fā)明的多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)方法之所以具有靈敏性高(檢測(cè)限達(dá)6拷貝/μL)、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，是基于特殊的靶標(biāo)(Kmt1基因)設(shè)計(jì)RPA引物，并對(duì)RPA引物進(jìn)行優(yōu)化篩選而實(shí)現(xiàn)的。首先根據(jù)特殊的靶標(biāo)設(shè)計(jì)RPA引物能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多殺性巴氏桿菌莢膜A、B、D、E和F 5個(gè)血清型的同時(shí)診斷；目前已報(bào)道的用于多殺性巴氏桿菌分型診斷的多殺性巴氏桿菌的保守基因序列有多個(gè)，但如何從眾多的保守基因序列中選擇靶標(biāo)進(jìn)行RPA引物設(shè)計(jì)是方案設(shè)計(jì)的難點(diǎn)所在。其次RPA的引物和探針設(shè)計(jì)不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，目前還不能僅根據(jù)序列判斷引物的擴(kuò)增性能，需要不斷的摸索條件進(jìn)行優(yōu)化。第三，通過不同的探針結(jié)合到模板互補(bǔ)鏈后再通過核酸內(nèi)切酶IV(nfo)切割掉3'端阻止序列，也會(huì)影響多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)的效果。

本申請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)過程中以不同的保守基因作為靶標(biāo)區(qū)域，設(shè)計(jì)了多組RPA引物，但在檢測(cè)過程中有出現(xiàn)與其他細(xì)菌之間的交叉反應(yīng)，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)的特異性不如以Kmt1基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的RPA引物。

本申請(qǐng)還以Kmt1基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了多組RPA引物，為與LFD技術(shù)相結(jié)合，另外設(shè)計(jì)了不同的探針序列，通過不同的引物和探針的組合，考察檢測(cè)的靈敏度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同引物和探針的組合，其檢測(cè)的靈敏度相差較大，以本發(fā)明實(shí)施例1中篩選和優(yōu)化得到的引物和探針組合的檢測(cè)靈敏度最優(yōu)。

實(shí)施例3：用于多殺性巴氏桿菌檢測(cè)的試劑盒

1.試劑盒的組成：實(shí)施例1篩選的引物和探針組合，陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，rehydration緩沖液，醋酸鎂(280mM)、ddH₂O和側(cè)流層析試紙條。

2.擴(kuò)增體系及檢測(cè)方法：

RPA-nfo反應(yīng)體系為25μL：

將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應(yīng)管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接置于37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)25min。

反應(yīng)結(jié)束后取1μL與49μL LFD檢測(cè)緩沖液混合，將LFD垂直浸入上述混合緩沖液，5min之內(nèi)觀察結(jié)果，若同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)條帶和對(duì)照條帶，則該樣品中多殺性巴氏桿菌核酸陽性；僅出現(xiàn)對(duì)照條帶則說明該樣本中不含多殺性巴氏桿菌核酸，如果僅出現(xiàn)檢測(cè)條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測(cè)不成立。

實(shí)施例4：多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)方法的應(yīng)用

1.實(shí)驗(yàn)步驟

(1)臨床樣本的現(xiàn)場(chǎng)制備

將肺臟組織、氣溶膠離心沉淀、奶樣離心沉淀等臨床樣本用200μL TE緩沖液[1.0MTris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M Na₂EDTA·2H₂O(pH8.0)2mL，加蒸餾水至1000mL]重懸，鼻拭子溶解液、血液等液體樣本直接取200μL，然后加入30μL 10％(w/v)SDS和3μL 2％(w/v)蛋白酶K，混合后37℃溫育1h，期間上下顛倒數(shù)次。

(2)臨床樣本的檢測(cè)

按照步驟(1)中臨床樣本現(xiàn)場(chǎng)裂解處理的方法，分別對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的已經(jīng)用多殺性巴氏桿菌特異性PCR引物擴(kuò)增后測(cè)序正確的5份鼻拭子樣本，1份牛肺臟組織樣本，1份氣溶膠樣本，1份血液樣本以及1份奶樣樣本進(jìn)行Kmt1基因引物、探針組合的多殺性巴氏桿菌RPA-LFD檢測(cè)，同時(shí)將上述不同類型樣本各取1份陰性樣本進(jìn)行處理，以3.0×10⁴拷貝/μL多殺性巴氏桿菌DNA和pEASY-T3空載質(zhì)粒分別為陽性、陰性對(duì)照。

2.試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室確診的6份鼻拭子、2份氣溶膠、4份牛肺組織、2份奶樣樣本，分別應(yīng)用本發(fā)明中的試劑盒篩選的多殺性巴氏桿菌RPA-LFD進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖5。檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序確診結(jié)果均一致。

以上結(jié)果充分說明用本發(fā)明提供的多殺性巴氏桿菌RPA-LFD引物、探針組合以及試劑盒可用于不同臨床樣本的檢測(cè)，該方法具有較高的靈敏度和特異性，最重要的是可以對(duì)臨床鼻拭子、氣溶膠等樣本直接進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速的診斷。

3.結(jié)果對(duì)比

以本實(shí)驗(yàn)室建立的多殺性巴氏桿菌TaqMan熒光定量PCR和LAMP檢測(cè)方法為對(duì)照進(jìn)行6份鼻拭子的檢測(cè)。

將上述6份鼻拭子樣本(5個(gè)陽性樣本，1個(gè)陰性樣本)分別采用TaqMan熒光定量PCR、LAMP快速檢測(cè)和RPA-LFD檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果如下：

表2：對(duì)比結(jié)果

由上述對(duì)比結(jié)果可以看出，采用本申請(qǐng)的RPA-LFD檢測(cè)方法與LAMP快速檢測(cè)相比，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性更高，無假陽性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果；與TaqMan熒光定量PCR相比，本申請(qǐng)的RPA-LFD檢測(cè)無需特殊儀器設(shè)備，只需借助恒溫水浴鍋，25min就能對(duì)待測(cè)樣本的粗裂解物進(jìn)行多殺性巴氏桿菌DNA的靈敏、特異、快速地檢測(cè)，適合現(xiàn)場(chǎng)或基層試驗(yàn)條件差的地區(qū)多殺性巴氏桿菌的診斷工作。

以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東師范大學(xué)

<120> 用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgccgcgaa attgagtttt atgccacttg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aataacgtcc aatcagttgc gccgttgtca 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcattat tttatggctc gttgtgagtg gcttgtcggt agtctt 46

<210> 4

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgattgccgc gaaattgagt tttatgccac ttgaaatggg aaatggcatt attttatggc 60

tcgttgtgag tgggcttgtc ggtagtcttt tatttggctt gtggcaaaga aaagcacagt 120

tttgttgggc ggagtttggt gtgttgagcc aatctgcttc cttgacaacg gcgcaactga 180

ttggacgtta tt 192