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用于現(xiàn)場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒的制作方法

文檔序號:12584684閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種用于現(xiàn)場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合,包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針,其特征在于,所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針的序列如下所示:

正向引物:5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3';

反向引物:5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3';

探針:5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。

2.權(quán)利要求1所述的引物和探針組合在制備多殺性巴氏桿菌檢測的試劑盒、芯片和/或擴增反應(yīng)試劑中的用途。

3.一種檢測多殺性巴氏桿菌的試劑盒,其特征在于,該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物和探針組合。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于,試劑盒中還包括有:陽性質(zhì)控標準品、陰性質(zhì)控標準品和RPA-nfo反應(yīng)液。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,所述陽性質(zhì)控標準品為包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質(zhì)控標準品;

優(yōu)選的,所述的包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質(zhì)控標準品,由含有192個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成;

所述含有192個堿基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No.4所示。

6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于,所述陰性質(zhì)控標準品為pEASY-T3空載質(zhì)粒。

7.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于,所述RPA-nfo反應(yīng)液,包括下述試劑中的至少一種:

recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂溶液、側(cè)流層析試紙條、LFD檢測緩沖液、滅菌去離子雙蒸水,TE緩沖液、SDS、蛋白酶K和多殺性巴氏桿菌標準陽性模板。

8.一種非診斷目的的檢測多殺性巴氏桿菌的方法,其特征在于,步驟如下:

(1)檢測樣本DNA的提取或檢測樣本的現(xiàn)場裂解處理;

(2)以步驟(1)中處理的樣本為模板,利用權(quán)利要求1所述的引物和探針組合進行RPA-nfo擴增;

(3)用LFD檢測上述RPA-nfo擴增產(chǎn)物,根據(jù)檢測結(jié)果判定樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌。

9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,步驟(2)中,所述RPA-nfo擴增體系為25μL:其中包括1.0μL的正向引物,1.0μL的反向引物,0.3μL的探針,rehydration緩沖液14.75μL,待測樣本DNA或粗裂解產(chǎn)物2μL,ddH2O 4.7μL;將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應(yīng)管,充分混勻、溶解,最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL,上下顛倒混勻后直接在37℃恒溫水浴鍋處理25min。

10.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟(3)的具體步驟為:取1μL RPA擴增產(chǎn)物與49μL的LFD檢測緩沖液混合,將LFD置入上述混合液中,5min內(nèi)觀察結(jié)果,若同時出現(xiàn)檢測條帶和對照條帶,則該樣品多殺性巴氏桿菌核酸陽性,僅出現(xiàn)對照條帶則說明該樣品中不含多殺性巴氏桿菌,如果僅出現(xiàn)檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。

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