本發(fā)明涉及有機化合物合成領(lǐng)域，具體涉及一種4-苯基喹啉類化合物、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可以侵及許多臟器，以肺部結(jié)核感染最為常見。近年來隨著遷移人口的增加，結(jié)核病特別是耐藥結(jié)核病再次成為危害人類健康的頭號殺手。耐藥結(jié)核病主要細分為以下4類：(1)單耐藥結(jié)核病(monoresistance-tuberculosis,mr-tb)，是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外dst證實對1種一線抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核?。?2)多耐藥結(jié)核病(polydrugresistance-tuberculosis,pdr-tb)，是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外dst證實對1種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥(但不包括同時對異煙肼和利福平耐藥)的結(jié)核?。?3)耐多藥結(jié)核病(multidrugresistance-tuberculosis,mdr-tb)，是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外dst證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核??；(4)廣泛耐藥結(jié)核病(extensivedrugresistance-tuberculosis,xdr-tb)，是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外dst證實除至少同時對異煙肼和利福平耐藥外，還對任何氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，以及3種二線注射類藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥的結(jié)核病。據(jù)《2016年全球結(jié)核病報告》統(tǒng)計，2015年世界范圍內(nèi)估計有1040萬新發(fā)病例，其中男性590萬(56％)，女性350萬(34％)，兒童100萬。全球估計有48萬新發(fā)的mdr-tb病例和10萬耐利福平結(jié)核病(rr-tb)病例?，F(xiàn)有抗結(jié)核一線藥物均研發(fā)于上世紀70年代，分別為利福平(rfp)、異煙肼(inh)、鏈霉素(sm)和乙胺丁醇(emb)。嚴峻的耐藥結(jié)核發(fā)展形式，要求加速新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。喹啉類化合物是一種氮雜環(huán)化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域可以通過對喹啉環(huán)在不同的位點引入活性基團來改變或增強其抗腫瘤、抗瘧疾、抗病菌等作用。2012年由楊森制藥所研發(fā)的sirturo打開了喹啉類藥物在抗結(jié)核領(lǐng)域的新局面。sirturo的主要活性成分為貝達喹啉(tmc-207)。貝達喹啉是一種二芳基喹啉類藥物，其具有較高的口服利用率，不良反應(yīng)發(fā)生率低，且與異煙肼、利福平、鏈霉素、莫西沙星交叉耐藥性小，能最大限度的減少與現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物的交叉耐受。因此開發(fā)喹啉類抗結(jié)核藥物具有較好的應(yīng)用前景。然而，以往的制備喹啉類化合物的反應(yīng)大多采用交叉脫氫偶聯(lián)反應(yīng)，其缺點在于該反應(yīng)中必須使用過量的氧化劑，在反應(yīng)過程中會產(chǎn)生如含硫化合物等有機或無機副產(chǎn)物，造成環(huán)境污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明人等進行了深入研究，提供了一種4-苯基喹啉類化合物，改化合物的制備產(chǎn)生的副產(chǎn)物不會對環(huán)境造成污染，是一種環(huán)保的制備方法。并同時發(fā)現(xiàn)了該化合物的對耐藥結(jié)核菌株也有較好的殺菌和抑菌效果，本發(fā)明所述的化合物可應(yīng)用在制備抗結(jié)核桿菌藥物中，特別是可應(yīng)用在制備抗耐藥結(jié)核桿菌藥物中。具體地，本發(fā)明提供一種4-苯基喹啉類化合物，其特征在于，所述4-苯基喹啉類化合物的結(jié)構(gòu)如下述式(ⅰ)所示：其中，r1為–oh、–cl、–och3或–ch3；r2為–h、–ch2co2ch2ch3。本發(fā)明還提供一種如上所述的4-苯基喹啉類化合物的制備方法，其反應(yīng)路線如下述式(ⅱ)所示，其中，r及r1為–oh、–cl、–och3或–ch3；r2為–h、–ch2co2ch2ch3。如上所述的制備方法，其具體步驟如下所示：(1)將溴乙酰溴溶于二氯甲烷中制得第一溶液，將化合物a和碳酸鉀溶于二氯甲烷中制得第二溶液，將第一溶液滴加入第二溶液中，0℃攪拌4～7h，反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃取3～5次，干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到中間產(chǎn)物b；(2)向中間產(chǎn)物b中加入原料c和乙酸鈉，20～30℃緩慢加入乙醇，逐步升溫至40～50℃回流攪拌3～6h，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾，得中間產(chǎn)物d；(3)將中間產(chǎn)物d、苯乙烯和三氯化銦在乙腈中溶解，控溫于30～40℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑tbpa·+，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全，反應(yīng)結(jié)束后，三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e。其中，催化劑tbpa·+不參與反應(yīng)，其用量無特殊限定，可發(fā)揮有效催化作用即可?？梢詢?yōu)選中間產(chǎn)物d與催化劑的摩爾比為1:0.05～0.15。如上所述的制備方法，在步驟(1)中，溴乙酰溴與二氯甲烷的摩爾比為1:10～20；化合物a與碳酸鉀的摩爾比為1:1～3，溶解后二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為70-80％；在步驟(2)中，所述中間產(chǎn)物b與原料c及乙酸鈉的摩爾比為1:1～1.5:05～2；在步驟(3)中，所述中間產(chǎn)物d、苯乙烯及三氯化銦的摩爾比為1:4～6:1～3。本發(fā)明還提供一種如權(quán)利要求1所述的4-苯基喹啉類化合物在制備抗結(jié)核桿菌藥物中的應(yīng)用。在如上所述的應(yīng)用中，所述抗結(jié)核桿菌為抗單耐藥結(jié)核桿菌、或抗耐多藥結(jié)核桿菌。在如上所述的應(yīng)用中，所述抗單耐藥結(jié)核桿菌為單耐鏈霉素、或單耐異煙肼。在如上所述的應(yīng)用中，所述抗耐多藥結(jié)核桿菌同時耐異煙肼、利福平、乙胺丁醇。在如上所述的應(yīng)用中，所述抗耐多藥結(jié)核桿菌同時耐鏈霉素、異煙肼。本發(fā)明的4-苯基喹啉類化合物、其制備方法及應(yīng)用，具有如下有益效果：1.本發(fā)明4-苯基喹啉類化合物的制備采用交叉脫氫偶聯(lián)(crossdehydrogenativecoupling，cdc)反應(yīng)，其直接利用底物中的c-h鍵，在催化量的氧化劑存在下，進行脫氫偶聯(lián)反應(yīng)形成c-c鍵。但以往制備喹啉類化合物的cdc反應(yīng)的一個缺點在于此反應(yīng)中使用過量的氧化劑，這使得反應(yīng)產(chǎn)生一定量的有機或無機副產(chǎn)物如含硫化合物等，這些副產(chǎn)物將造成環(huán)境污染。本發(fā)明的4-苯基喹啉類化合物采用空氣中的氧氣作為cdc反應(yīng)的氧化劑，可以避免以上問題，因為使用氧氣作為氧化劑，副產(chǎn)物是水，不會造成環(huán)境污染。本發(fā)明創(chuàng)新性的以少量的tbpa·+為催化劑，以空氣中的氧氣為氧化劑，建立一種全新的c-h鍵催化氧化反應(yīng)，合成5個目標產(chǎn)物h1-h5，克服了以往cdc反應(yīng)需大量使用tbpa·+和氧化劑，從而造成各類污染。2.在標準結(jié)核桿菌(h37rv)上，通過比例法和絕對濃度法，均顯示目標產(chǎn)物(如上述結(jié)構(gòu)式(ⅰ)所示的4-苯基喹啉類化合物)具有抑制標準結(jié)核分枝桿菌生長的作用，其中高濃度的h1、h3、h4、h5對結(jié)核分支桿菌生長具有抑制作用，而h2無論高低濃度都對結(jié)核分枝桿菌均具有殺滅作用。h2對標準菌株的最小抑菌濃度(mic)應(yīng)為0.1μg/ml，最小殺菌濃度(mbc)在0.1～0.25μg/ml范圍。與一線藥物(rfp、inh、sm和emb)對比，h2與inh的mic和mbc相近；而與其他一線受試藥相比，則h2的mic和mbc更低。提示h2具有較有較好的殺菌、抑菌效果。3.在耐藥結(jié)核桿菌上即耐單藥菌株(標本編號為8155為單耐sm；標本編號為7204為單耐inh)、耐多藥菌株(標本編號為7975對inh、rfp、emb耐藥)、多耐藥菌株(標本編號為7821對sm、inh耐藥)，目標產(chǎn)物h1、h3、h5對8155菌株和7204菌株有抑制作用；h4僅對7975菌株有抑制作用。而h2對上述耐藥菌株均有抑菌和殺菌作用，且mic、mbc均不大于現(xiàn)有一線藥物。具體實施方式下面對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細解說，但本發(fā)明并不受實施例限定，對本發(fā)明中本領(lǐng)域常規(guī)手段的替代均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。一、藥物制備1.催化劑tbpa·+的制備將三苯胺(3g)溶于20ml氯仿與二氯甲烷混合溶液中，溫度控制在-6℃以下(冰鹽浴)，緩慢滴加含有液溴(2ml)的氯仿溶液(10ml)。攪拌40min，溶液逐漸變?yōu)辄S綠色，把反應(yīng)液倒入25ml熱的無水乙醇中，有少量晶體出現(xiàn)。冷卻至0℃，抽濾，得到白色針狀晶體。再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色塊狀晶體對溴三苯胺4.7g，產(chǎn)率80％，熔點141-142℃(文獻值:143-144℃)。將對溴三苯胺(2.4g)溶解在10ml的無水二氯甲烷中，0℃下緩慢加入含有五氯化銻(1ml)的二氯甲烷溶液10ml，反應(yīng)立即發(fā)生，溶液變?yōu)樯钏{色。然后將干燥的無水乙醚倒入到反應(yīng)液中，出現(xiàn)深藍色的沉淀，將其抽濾，并用干燥的乙醚洗滌后，在室溫下真空干燥，得到深藍色針狀晶體(tbpa·+)，產(chǎn)率98％，熔點143-144℃。2.4-苯基喹啉類化合物的制備實施例1(化合物h1的制備)h1：將0.012mol溴乙酰溴(純度97％)溶于10ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸鉀溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸鉀0.01mol、溶解后的二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為75％。用恒壓漏斗將溶液1逐滴滴加到裝有溶液2的圓底燒瓶中，冰浴下攪拌6h。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸鈉干燥有機層0.5h，濾出硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝-h)。在0.010mol反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)中加入0.010mol對氨基苯酚(原料c、r1＝-oh)和0.010mol乙酸鈉，控溫于20℃以下緩慢加入5ml乙醇，逐步升溫至40℃回流攪拌，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌6h，用tlc檢測反應(yīng)完全后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾得反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-oh)。將0.005mol反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-oh)、0.025mol苯乙烯和0.010mol三氯化銦在乙腈中溶解?？販赜?0℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑溴三苯胺自由基正離子六氯銻酸鹽(tbpa·+)，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全。用tlc檢測其反應(yīng)完全后，1ml三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e(r2＝-h、r1＝-oh)，結(jié)構(gòu)如下述h1所示。h1：目標產(chǎn)物e(h1)的結(jié)構(gòu)表征：6-hydroxy-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,dmso)δ10.27(s,oh,1h),8.82(d,nh,j＝4.8hz,1h),8.05(d,j＝9.1hz,1h),7.89(d,j＝1.9hz,1h),7.67–7.49(m,5h),7.42(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),7.21–7.15(m,1h),2.89(dd,j＝4.8,1.6hz,3h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ164.9,157.3,146.9,146.8,141.9,137.7,131.6,129.2,128.9,128.7,128.5,123.0,118.6,106.2,26.1；ei-msm/z(relativeintensity,％):278(31.0％),249(10.5％),235(9.0％),221(100％),190(12.1％),165(9.1％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc17h14n2o2+h+,279.1134；found,279.1145.實施例2(化合物h2的制備)h2：將0.012mol溴乙酰溴(純度97％)溶于15.4ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸鉀溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸鉀0.03mol、溶解后的二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為80％。用恒壓漏斗將溶液1逐滴滴加到裝有溶液2的圓底燒瓶中，冰浴下攪拌7h。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸鈉干燥有機層0.5h，濾出硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)。在0.010mol反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)中加入0.015mol對氯苯胺(原料c、r1＝-cl)和0.005mol乙酸鈉，控溫于30℃以下緩慢加入5ml乙醇，逐步升溫至50℃回流攪拌，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌4h，用tlc檢測反應(yīng)完全后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾得反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝h、r1＝-cl)。將0.005mol反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝h、r1＝-cl)、0.02mol苯乙烯和0.015mol三氯化銦在乙腈中溶解?？販赜?0℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑溴三苯胺自由基正離子六氯銻酸鹽(tbpa·+)，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全。用tlc檢測其反應(yīng)完全后，1ml三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e(r2＝h、r1＝-cl)，結(jié)構(gòu)如下述h2所示。h2：目標產(chǎn)物e(h2)的結(jié)構(gòu)表征：6-chloro-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(s,1h),8.16(s,nh,1h),8.01(d,j＝9.0hz,1h),7.87(d,j＝2.2hz,1h),7.62(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.51–7.41(m,5h),3.04(d,j＝5.0hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ164.8,149.6,149.3,145.5,137.0,134.0,131.6,130.8,129.4,128.9,128.4,124.8,124.7,119.8,26.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):298(8.7％),296(28.6％),269(3.4％),267(9.1％),241(34.0％),239(100％),204(31.3％),203(32.3％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc17h13cln2o+h+,297.0795；found,297.0808.實施例3(化合物h3的制備)h3：將0.012mol溴乙酰溴(純度97％)溶于8ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸鉀溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸鉀0.02mol、溶解后的二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為70％。用恒壓漏斗將溶液1逐滴滴加到裝有溶液2的圓底燒瓶中，冰浴下攪拌4h。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸鈉干燥有機層0.5h，濾出硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝-h)。在0.010mol反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)中加入0.0125mol對甲氧基苯胺(原料c、r1＝-och3)和0.020mol乙酸鈉，控溫于30℃以下緩慢加入5ml乙醇，逐步升溫至50℃回流攪拌，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌4h，用tlc檢測反應(yīng)完全后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾得反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-och3)。將0.005mol反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-och3)、0.03mol苯乙烯和0.010mol三氯化銦在乙腈中溶解?？販赜?0℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑溴三苯胺自由基正離子六氯銻酸鹽(tbpa·+)，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全。用tlc檢測其反應(yīng)完全后，1ml三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e(r2＝-h、r1＝-och3)，結(jié)構(gòu)如下述h3所示。h3：目標產(chǎn)物e(h3)的結(jié)構(gòu)表征：6-methoxy-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.30–8.19(m,2h),8.02(dd,j＝9.2,3.0hz,1h),7.59–7.44(m,4h),7.43–7.36(m,1h),7.28–7.20(m,2h),3.79(s,3h),3.10(d,j＝4.8hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.4,158.9,148.3,147.2,143.1,138.0,131.4,129.3,128.9,128.7,128.5,122.6,119.4,103.5,55.5,26.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):292(22.0％),263(6.2％),235(100％),191(18.3％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc18h16n2o2+h+,293.1290；found,293.1289.實施例4(化合物h4的制備)h4：將0.012mol溴乙酰溴(純度97％)溶于11.5ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸鉀溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸鉀0.02mol、溶解后的二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為75％。用恒壓漏斗將溶液1逐滴滴加到裝有溶液2的圓底燒瓶中，冰浴下攪拌5h。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸鈉干燥有機層0.5h，濾出硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝-h)。在0.010mol反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)中加入0.010mol對甲基苯胺(原料c、r1＝-ch3)和0.015mol乙酸鈉，控溫于20℃以下緩慢加入5ml乙醇，逐步升溫至50℃回流攪拌，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌4h，用tlc檢測反應(yīng)完全后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾得反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-ch3)。將0.005mol反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-h、r1＝-ch3)、0.025mol苯乙烯和0.005mol三氯化銦在乙腈中溶解?？販赜?0℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑溴三苯胺自由基正離子六氯銻酸鹽(tbpa·+)，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全。用tlc檢測其反應(yīng)完全后，1ml三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e(r2＝-h、r1＝-ch3)，結(jié)構(gòu)如下述h4所示。h4：目標產(chǎn)物e(h4)的結(jié)構(gòu)表征：n,6-dimethyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.20(s,nh,1h),8.15(s,1h),7.96(d,j＝8.5hz,1h),7.65(s,1h),7.51(d,j＝8.5hz,1h),7.45(s,5h),3.04(d,j＝5.1hz,3h),2.41(s,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.3,149.1,148.5,145.7,138.1,137.9,132.2,129.6,129.6,128.6,128.5,127.7,124.6,119.1,26.2,22.0；ei-msm/z(relativeintensity,％):276(20.6％),247(5.4％),219(100％),204(14.0％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc18h16n2o+h+,277.1341；found,277.1351.實施例5(化合物h5的制備)h5:將0.012mol溴乙酰溴(純度97％)溶于11.5ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％氨基乙酸乙酯水溶液和碳酸鉀溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中氨基乙酸乙酯0.01mol、碳酸鉀0.02mol、溶解后的二氯甲烷的質(zhì)量分數(shù)為75％。用恒壓漏斗將溶液1逐滴滴加到裝有溶液2的圓底燒瓶中，冰浴下攪拌5h。反應(yīng)后，反應(yīng)溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸鈉干燥有機層0.5h，濾出硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)干燥二氯甲烷溶劑，得到反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝-ch2co2ch2ch3)。在0.010mol反應(yīng)中間產(chǎn)物b(r2＝h)中加入0.0125mol對氨基苯酚(原料c、r1＝-oh)和0.010mol乙酸鈉，控溫于20℃以下緩慢加入5ml乙醇，逐步升溫至50℃回流攪拌，待固體溶解，再升溫至微沸，回流攪拌4h，用tlc檢測反應(yīng)完全后，將鹽過濾出來，在熱乙醇中結(jié)晶、抽濾得反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)。將0.005mol反應(yīng)中間產(chǎn)物d(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)、0.020mol苯乙烯和0.015mol三氯化銦在乙腈中溶解?？販赜?0℃，緩慢加入用乙腈溶解的催化劑溴三苯胺自由基正離子六氯銻酸鹽(tbpa·+)，將反應(yīng)液置于氧氣氣氛中，攪拌至反應(yīng)完全。用tlc檢測其反應(yīng)完全后，1ml三乙胺溶液淬滅，以石油醚/丙酮體系進行柱色譜分離，得到目標產(chǎn)物e(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)，結(jié)構(gòu)如下述h5所示。h5:目標產(chǎn)物e(h5)的結(jié)構(gòu)表征：ethyln-[(6-methoxy-4-phenylquinolin-2-yl)carbonyl]aminoacetate1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(t,j＝5.5hz,nh,1h),8.19(s,1h),8.08(d,j＝9.2hz,1h),7.60–7.46(m,5h),7.42(dd,j＝9.2,2.7hz,1h),7.24(d,j＝2.6hz,1h),4.34(d,j＝5.7hz,2h),4.28(q,j＝7.1hz,2h),3.81(s,3h),1.33(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.9,165.0,159.0,148.2,146.4,143.2,138.0,131.7,129.3,129.0,128.7,128.5,122.7,119.4,103.4,61.5,55.5,41.5,14.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):364(29.0％),318(18.3％),291(25.4％),235(100％),234(81.1％),191(22.8％),190(13.2％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc21h20n2o4+na+,387.1321；found,387.1310.二、本發(fā)明的4-苯基喹啉類化合物抗結(jié)核桿菌活性評價1.材料與方法1.1材料鏈霉素(sm，生物效價為0.771，批號：806120)、異煙肼(inh，批號：7013252)、利福平(rfp，批號：80201401041)、乙胺丁醇(emb，批號：n3072474)生產(chǎn)廠家：沈陽紅旗制藥有限公司。1.2菌株標準菌株(h37rv)為甘肅傳染病醫(yī)院分枝桿菌菌株庫保存菌株。耐藥菌株即耐單藥菌株(標本編號為8155為單耐sm；標本編號為7204為單耐inh)、耐多藥菌株(標本編號為7975對inh、rfp、emb耐藥)、多耐藥菌株(標本編號為7821對sm、inh耐藥)為甘肅傳染病醫(yī)院臨床病例標本分離培養(yǎng)菌株。1.3儀器設(shè)備隔水式培養(yǎng)箱(gh-600,北京科偉永興儀器有限公司)；壓力蒸汽滅菌器(yxqg,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(dhg-9245a,上海一恒科技有限公司)；蒸汽恒溫箱(xz-1,北京新中大業(yè)儀表有限公司)；電子天平(fa2004n,上海箐海儀器有限公司)；生物安全柜(hfsafe-1800b2，healforce)1.4方法1.4.1受試藥的配制和稀釋。異煙肼(inh)、利福平(rfp)、乙胺丁醇(emb)、4-苯基喹啉類化合物的生物效價為1000μg/mg,鏈霉素硫酸鹽(sm-so4)的生物效價為771μg/mg。rfp、4-苯基喹啉類藥物用二甲基甲酰胺溶解，再用滅菌蒸餾水稀釋，emb、inh、sm直接用滅菌蒸餾水溶解、稀釋。1.4.2培養(yǎng)基制備改良羅氏培養(yǎng)基：基礎(chǔ)液：制備方法按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[12]進行。將表2中的無機鹽于蒸餾水，加熱溶解，121℃30min高壓蒸汽滅菌，冷卻至室溫后加入馬鈴薯淀粉，再次加熱溶解，并煮沸1min。冷卻后于4℃冰箱保存。表2.基礎(chǔ)培養(yǎng)基的主要成分谷氨酸鈉(純度99％以上)7.2g磷酸二氫鉀(kh2po4)2.4g硫酸鎂(mgso4·7h2o)0.24g檸檬酸鎂0.6g馬鈴薯淀粉10g丙三醇12ml蒸餾水600ml稱取2g孔雀綠染料，用100ml蒸餾水溶解，放于溫箱中助溶解2h，于當周使用。選取不超過7d的新鮮雞蛋20個左右，用普通的堿性肥皂液將徹底刷洗，并在肥皂液中浸泡30min，徹底沖洗雞蛋后在75％乙醇中浸泡15min，晾干后使用。含藥培養(yǎng)基:將表2.所示成分充分混均，空白對照組不加抗結(jié)核藥液，溶液靜置30～60min后，進行無菌分裝，每支加量7ml，培養(yǎng)基斜面高度為試管的2/3，且需底部充滿培養(yǎng)基為佳。培養(yǎng)基分裝結(jié)束后要盡快開始凝固過程，以防沉淀發(fā)生。斜面放置于培養(yǎng)基蒸汽凝固滅菌箱內(nèi),85℃凝固50min。表3.含藥培養(yǎng)基基礎(chǔ)液600ml孔雀綠溶液20ml勻質(zhì)全卵液1000ml受試藥藥液1ml/100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)量控制：冷卻后的整批培養(yǎng)基或抽取其中一部分置37℃、24h進行無菌試驗。檢查無污染情況后,4℃避光保存,1個月內(nèi)使用。1.4.3接種方法(1)菌懸液制備:刮取臨床分離菌齡2～3周的結(jié)核分枝桿菌菌落，放玻璃磨菌器底部，研磨使之呈乳酪樣，以0.5％吐溫-80生理鹽水磨菌稀釋，與標準麥氏比濁管比濁，配成1mg/ml的菌懸液。(2)絕對濃度法:將1mg/ml的菌懸液10倍稀釋至10-2mg/ml，以滅菌吸管準確吸取菌液0.1ml分別接種于含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為10-3mg。斜面向上置于37℃溫箱，四周后觀察結(jié)果。(3)比例法:用22swg標準接種環(huán)將1mg/ml的菌液上清逐步稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml后。分別沾取1環(huán)(即0.01ml)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面，最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。接種后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，至四周后報告結(jié)果，并計算耐藥百分比。2.藥物敏感試驗2.1抗結(jié)核活性篩選分別將本發(fā)明的5種4-苯基喹啉類化合物通過絕對濃度法、比例法接種標準結(jié)核菌株，經(jīng)過四周培養(yǎng)后，從5個目標產(chǎn)物中篩選出對標準結(jié)核菌株具有殺菌效果的藥物。采用絕對濃度法時，需空白組培養(yǎng)基分枝桿菌生長旺盛，才報告含藥培養(yǎng)基上菌落生長情況，低濃度含藥培養(yǎng)基菌落生長1+以上者即為耐藥。而比例法則是通過計算耐藥比來判斷結(jié)核桿菌對該藥物是否耐藥，含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)與空白培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)的比值，即為耐藥比，耐藥百分比大于1％，則認為受試菌對該抗結(jié)核藥耐藥，反之，對該抗結(jié)核藥敏感。當比例法接種菌量10-4mg/ml與10-6mg/ml培養(yǎng)結(jié)果不一致時，本實驗采取“就高不就低”原則，即該藥有一個接種菌量培養(yǎng)結(jié)果為耐藥即是耐藥。表4.含藥培養(yǎng)基藥物終濃度(μg/ml)2.2目標化合物的mic和mbc測定第一次篩選余下的4-苯基喹啉類，和作為陽性對照的鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇4種一線藥物，設(shè)置十個濃度階梯，采用比例法接種標準菌株，經(jīng)過四周培養(yǎng)后，記錄各藥物的最小抑菌濃度(mic)、最小殺菌濃度(mbc)。將目標化合物與四種一線受試藥的mic、mbc進行比較，從中選出比一線受試藥作用效果更好的抗結(jié)核化合物。其中含藥培養(yǎng)基內(nèi)藥物濃度分別為40、20、10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/ml。2.3目標化合物對耐藥菌株的作用效果研究耐藥菌株的選擇：從臨床病人標本中隨機選擇，采用比例法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中藥物終濃度按《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》：inh0.2μg/ml，sm4μg/ml，rfp40μg/ml，emb2μg/ml。四周之后，選擇至少在一種含藥培養(yǎng)基上生長的菌株。與第一次篩選采用相同的方法，但接種耐藥菌株，經(jīng)過四周培養(yǎng)，從中選出比一線受試藥作用效果更好的4-苯基喹啉類的抗結(jié)核化合物。3.抗菌活性結(jié)果3.14-苯基喹啉化合物對標準結(jié)核桿菌的作用表5、表6結(jié)果顯示在5個目標產(chǎn)物中，h1、h3、h4和h5僅在高濃度時對結(jié)核分支桿菌的生長具有抑制作用，提示h1、h3、h4和h5具有一定的抑菌作用。其中h2具有抑制標準結(jié)核分枝桿菌生長的作用，且無論高低濃度都對結(jié)核分枝桿菌均具有殺滅作用。h2對標準菌株的最小抑菌濃度(mic)應(yīng)為0.1μg/ml，最小殺菌濃度(mbc)在0.1～0.25μg/ml范圍內(nèi)。與一線藥物(rfp、inh、sm和emb)對比，h2與異煙肼的mic和mbc相近，而與其他一線受試藥相比，則h2的mic和mbc更低。表54-苯基喹啉類化合物對標準結(jié)核分枝桿菌耐作用效果(比例法)注：菌落數(shù)能數(shù)清楚的用數(shù)字表示，“0”表示無菌生長，“1+”表示菌落生長占斜面面積的1/4，“2+”表示菌落生長占斜面面積的1/2，“3+”表示菌落生長占斜面面積的3/4，“4+”表示菌落生長布滿整個斜面。下面各表均同。表6.4-苯基喹啉類化合物對標準結(jié)核分枝桿菌的作用效果(絕對濃度法)3.2對耐藥結(jié)核桿菌的作用對耐藥結(jié)核桿菌的作用以h2的結(jié)果為主要說明，h1、h3、h4和h5的試驗方法及結(jié)果表示參照h2。其中h1、h3、h5對8155菌株和7204菌株有抑制作用；h4僅對7975菌株有抑制作用。表7結(jié)果顯示：目標產(chǎn)物h2對8155菌株在0.1μg/ml的耐藥比小于1％，故其的mic為0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范圍內(nèi)。而一線藥物inh對8155菌株mic、mbc在0.1～0.25μg/ml范圍內(nèi)，rfp的mic、mbc在10～20μg/ml范圍內(nèi)，emb的mic、mbc在0.5～1μg/ml范圍內(nèi)。表7.不同濃度的h2對8155菌株的作用效果表8結(jié)果顯示：目標產(chǎn)物h2對7204菌株的mic為0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范圍內(nèi)。而sm對7204菌株的mic、mbc在2.5～5μg/ml范圍內(nèi)，rfp的mic、mbc在20μg/ml左右，emb的mic、mbc在0.5～1μg/ml范圍內(nèi)。表8.不同濃度的h2對7204菌株的作用效果表9.結(jié)果顯示h2對7975菌株的mic為0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范圍內(nèi)；而sm對7975菌株mic、mbc在2.5～5μg/ml范圍內(nèi)。表9.不同濃度的h2對7975菌株的作用效果表10結(jié)果顯示h2對7821菌株的mic為0.1μg/ml，rfp的mic、mbc在20μg/ml左右，emb的mic、mbc在1μg/ml左右。表13.不同濃度的h2對7821菌株的作用效果當前第1頁12