本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，要求發(fā)酵培養(yǎng)基的組成應(yīng)豐富、完全，碳、氮源要注意速效和遲效的互相搭配，少用速效營養(yǎng)，多加遲效營養(yǎng)；還要考慮適當(dāng)?shù)奶嫉龋泳彌_劑穩(wěn)定pH值；并且還要有菌體生長所需的生長因子和產(chǎn)物合成所需要的元素、前體和促進(jìn)劑等。除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。
發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。目前的發(fā)酵液培養(yǎng)基菌種發(fā)酵的雜質(zhì)較多，組分復(fù)雜，影響產(chǎn)品的效價。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供了一種高效發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
一種高效發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備方法，具體步驟如下：
(一)制備高有效含量的氯化膽堿水劑：
(1)將鹽酸與三甲胺在常溫下混合，合成濃度為62wt％～64wt％的三甲胺鹽酸鹽；
(2)向三甲胺鹽酸鹽中通入環(huán)氧乙烷，生成縮合溶液；
(3)將生成的縮合溶液轉(zhuǎn)入負(fù)壓濃縮蒸發(fā)器中，蒸發(fā)得到高有效含量的氯化膽堿水劑；
(二)制備甜菜堿：
(1)在反應(yīng)釜中打入水，再投入氯乙酸，攪拌至氯乙酸全部溶解，緩慢投入無水碳酸鈉，投料時注意反應(yīng)速度，以不析出大量的二氧化碳為準(zhǔn)，當(dāng)溫度超過50℃吋，開啟少量的冷卻水，使物料溫度保持在50℃～60℃之間，投料完成后穩(wěn)定30分鐘；
(2)定量投入三甲胺，調(diào)節(jié)三甲胺的通料速度以及冷卻水的給水量，使反應(yīng)溫度控制在55℃～60℃之間，反應(yīng)釜壓力最大不允許超過0.1Mpa，當(dāng)三甲胺總加入量剩余15％以內(nèi)時，減小冷卻水的給水量，使反應(yīng)溫度上升至60℃～70℃之間，投料完畢后穩(wěn)定ー小時；
(3)濃縮打開蒸汽閥，使蒸汽壓力逐步提升、穩(wěn)定在0.3MPa，給物料加熱進(jìn)行濃縮，真空壓力應(yīng)穩(wěn)定在-0.08MPa，甜菜堿濃度達(dá)到60％時，停止加熱，此時物料溫度為115℃，停止攪拌，真空放空，停止攪拌30分鐘后，待鹽全部沉降，將物料中的上清液移至另ー濃縮釜，剩余的鹽分進(jìn)行甩干，甩出的母液打入濃縮釜中重新進(jìn)行濃縮使用；
(4)烘干將溫度保持在110～120℃，壓力保持在-0.15～-0.2Mpa，進(jìn)行烘干，烘干至水份低于1％時放出物料；
(5)包裝干燥后的產(chǎn)品放入到大托盤中冷卻，溫度小于40℃后對物料進(jìn)行包裝，檢測合格后入庫；
(三)混合攪拌：
將步驟(一)制備得到的氯化膽堿水劑與步驟(二)制備得到的甜菜堿在常溫下、以50轉(zhuǎn)/秒的速度混合攪拌。
上述步驟(一)中鹽酸為高純鹽酸，三甲胺的濃度為99.95wt％，二者混合時，鹽酸的流速為33L/min，三甲胺的流速為20L/min。
上述步驟(一)中生成縮合溶液的過程通過調(diào)節(jié)環(huán)氧乙烷的流速控制PH在8～10之間。
本發(fā)明生產(chǎn)方法具有操作簡單、生產(chǎn)成本低、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢，采用該生產(chǎn)方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基主要成分為氯化膽堿、甜菜堿作為培養(yǎng)基中的甲基供體，促進(jìn)菌種組分優(yōu)化，誘導(dǎo)菌種單一方向發(fā)酵，減少副產(chǎn)物，提高產(chǎn)品效價量。
具體實施方式
例1
以制備1000ml發(fā)酵液培養(yǎng)基為例。
第一步：制備高有效含量的氯化膽堿水劑
1、合成三甲胺鹽酸鹽
將1000克鹽酸(高純鹽酸)與521克三甲胺(濃度為99.95wt％)在常溫下混合，合成三甲胺鹽酸鹽。二者混合時，鹽酸的流速為33L/min，三甲胺的流速為20L/min。
經(jīng)檢測，合成的三甲胺鹽酸鹽的濃度為64wt％。
2、生成縮合溶液
向三甲胺鹽酸鹽中通入環(huán)氧乙烷，環(huán)氧乙烷的流速為0.5t/h，控制pH在8-10之間，約20h后生成縮合溶液。
3、蒸發(fā)得到水劑
將生成的縮合溶液轉(zhuǎn)入四效蒸發(fā)器中，溫度125℃，壓力0.32MP，流量8000L/h，蒸發(fā)得到氯化膽堿水劑。
經(jīng)檢測，該水劑中氯化膽堿的含量為75.25wt％，總游離氨≤300ppm，重金屬≤0.002％，乙二醇≤0.05％，灰分≤0.2％。
第二步制備甜菜堿：
(1)在反應(yīng)釜中打入2噸水，投入1450-1550公斤氯乙酸，攪拌至氯乙酸全部溶解，緩慢投入800-900公斤無水碳酸鈉，投料時注意反應(yīng)速度，以不析出大量的二氧化碳為準(zhǔn)，當(dāng)溫度超過50℃吋，開啟少量的冷卻水，使物料溫度保持在50℃至60℃之間，投料完成后穩(wěn)定30分鐘；
(2)定量投三甲胺900-1000公斤，調(diào)節(jié)三甲胺的通料速度以及冷卻水的給水量，使反應(yīng)溫度控制在55℃-60℃之間，反應(yīng)釜壓力最大不允許超過0.1Mpa,當(dāng)通料至剩余三甲胺為150公斤時，減小冷卻水的給水量，使反應(yīng)溫度上升至60℃-70℃之間，投料完畢后穩(wěn)定ー小時；
(3)濃縮打開蒸汽閥，使蒸汽壓力逐步提升、穩(wěn)定在0.3MPa，給物料加熱進(jìn)行濃縮，真空壓力應(yīng)穩(wěn)定在-0.08MPa，甜菜堿濃度達(dá)到60％時，停止加熱，此時物料溫度為115℃，停止攪拌，真空放空，停止攪拌30分鐘后，待鹽全部沉降，將物料中的上清液移至另ー濃縮釜，剩余的鹽分進(jìn)行甩干，甩出的母液打入濃縮釜中重新進(jìn)行濃縮使用；
(4)烘干將溫度保持在110-120℃，壓力保持在-0.15至-0.2Mpa，進(jìn)行烘干，烘干至水份低于1％時放出物料。
經(jīng)測定，所得無水甜菜堿的純度為98％，收率為98.8％。
第三步：混合攪拌
將步驟一制備得到的氯化膽堿水劑與步驟二制備得到的甜菜堿在常溫下、以50轉(zhuǎn)/秒的速度混合攪拌。
我們對生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基的含量和性能進(jìn)行了測定。
一、有效含量
經(jīng)檢測，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基有效成分：氯化膽堿含量為71％，甜菜堿含量1％。
二、總游離氨
經(jīng)檢測，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基中總游離氨的含量為86ppm。
三、PH值
經(jīng)檢測，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基PH值為6.86。
所以，采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基不僅可以應(yīng)用到賴氨酸，螺旋霉素，輔酶Q10，蘇氨酸，色氨酸，多殺菌素中，更可以應(yīng)用到紅豆杉細(xì)胞、重組CHO細(xì)胞密度，提高細(xì)胞活力，增加目的蛋白的表達(dá)量，降低蛋白中的聚體含量。也可促進(jìn)紅霉素生物合成中的羥基化和甲基化進(jìn)程；改變次級代謝通路，為生產(chǎn)過程提供甲基，也可作為刺激因素刺激甲基化酶的合成，從而使代謝通量流入紅霉素A合成過程，改善紅霉素組分；提高紅霉素合成的溶氧，將代謝流引入次級代謝產(chǎn)物合成過程，從而加強發(fā)酵中的三羧酸循環(huán)。
采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出來的發(fā)酵液培養(yǎng)基，其從根本上解決了目前市場上發(fā)酵液培養(yǎng)基菌種發(fā)酵的雜質(zhì)較多，組分復(fù)雜，影響產(chǎn)品的效價等諸多難題，是一種高效的發(fā)酵液培養(yǎng)基的新型產(chǎn)品。