本發(fā)明涉及NtRLK2基因在煙草抗青枯病中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植物從胚胎發(fā)生到完整的植株，整個(gè)生活史，要經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程。這個(gè)過程由自身的遺傳物質(zhì)和環(huán)境共同調(diào)控。實(shí)質(zhì)上，就是一個(gè)如何完成協(xié)調(diào)生活環(huán)境和自身遺傳信息，使得調(diào)控基因有序的在時(shí)空表達(dá)，完成生命活動(dòng)的過程。這就要求植物個(gè)體存在接收內(nèi)外信號(hào)分子的受體，而蛋白激酶在這信息傳導(dǎo)的一些列過程發(fā)揮著重要作用。真核生物的蛋白激酶通過轉(zhuǎn)移ATP的磷酸基團(tuán)，催化蛋白的氨基酸側(cè)鏈，這種功能可被蛋白磷酸酶的作用所抵消。據(jù)估計(jì)，真核生物1%~3%功能基因都用來編碼蛋白激酶。根據(jù)作用底物不同，蛋白激酶主要分為絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸兩類，而酪氨酸類主要是在動(dòng)物細(xì)胞中，植物類發(fā)現(xiàn)的大多為絲氨酸/蘇氨酸類。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞中也存在一類結(jié)構(gòu)上跟動(dòng)物細(xì)胞受體蛋白激酶（RPKs）相似的蛋白，稱為類受體蛋白激酶（RLKs）。RLKs主要由三部分構(gòu)成，即胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)的蛋白激酶區(qū)域。

RLKs蛋白激酶由于胞外結(jié)構(gòu)域的差異，各行使不同的生理功能。如屬于Lectin類RLK的擬南芥At1g70130（命名：LecRK-b2）基因，在擬南芥種子發(fā)芽階段響應(yīng)ABA信號(hào)，并在生長(zhǎng)的初期參與鹽脅迫和滲透調(diào)節(jié)； Lectin類另外一個(gè)基因，跟花粉的發(fā)育相關(guān)。水稻中OsWAK1是一個(gè)細(xì)胞壁相關(guān)RLK類蛋白激酶，具有稻瘟病菌的抗性。擬南芥中一個(gè)LRR-RLK基因（RPK2），是一個(gè)控制花藥生長(zhǎng)的新因子。玉米中的ZmLrk-1，在胚乳發(fā)育和種子萌發(fā)時(shí)期受真菌感染誘導(dǎo)表達(dá)，但不受SA、茉莉酸和物理?yè)p傷誘導(dǎo)。油菜中，S-受體蛋白（SRKs），通過與SLG形成異二聚體復(fù)合物，與SRP胞外的受體結(jié)構(gòu)結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生改變，繼而引起胞內(nèi)激酶磷酸化和去磷酸化交替變化，參與了花粉雜交不親和的信號(hào)傳導(dǎo)。水稻OsBISERK1的表達(dá)受4-氨基-2,1,3-苯并噻二唑（BTH）誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因具有防御作用。

本發(fā)明針對(duì)以上背景技術(shù)，前期對(duì)煙草經(jīng)不同激素和環(huán)境脅迫處理后，獲得各處理混合和相應(yīng)對(duì)照混合兩個(gè)樣品，進(jìn)行羅氏454測(cè)序獲得抗逆相關(guān)unigene基礎(chǔ)上，結(jié)合網(wǎng)上已發(fā)布的2.4萬(wàn)條煙草EST unigene，設(shè)計(jì)了當(dāng)時(shí)國(guó)際上密度最高的12×135K煙草基因芯片，對(duì)煙草優(yōu)良品種K326在青枯菌接種脅迫下的差異表達(dá)譜進(jìn)行研究，共分離上下調(diào)2倍以上的差異基因2398個(gè)，獲得一批RLKs基因，從中得到一個(gè)類受體蛋白基因（LRR receptor-like serine threonine-protein kinase）。通過RACE技術(shù)從煙草翠碧一號(hào)品種克隆了該基因全長(zhǎng)（命名為NtRLK2），包含完整的閱讀框。保守結(jié)構(gòu)域與特征區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，含有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，與RLK類激酶的結(jié)構(gòu)類似，其中與水稻一個(gè)LRR-RLK類蛋白（登錄號(hào)：NP_001042346）相似性為42%。進(jìn)而從煙草高抗青枯病品種系3中克隆了該基因用于構(gòu)建超表達(dá)和RNAi表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入煙草中感青枯病煙草品種翠碧一號(hào)，接種鑒定表明該基因的RNAi干擾明顯增強(qiáng)植株的抗病性，初步預(yù)測(cè)該基因可能是內(nèi)源抗病基因的互作基因，抑制了抗病基因的表達(dá)。這將為煙草抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了煙草LRR類受體蛋白激酶類基因NtRLK2基因在煙草抗青枯病中的應(yīng)用。其目的在于提供煙草LRR類受體蛋白激酶類基因NtRLK2基因的編碼序列及其所編碼的蛋白，提供含有上述NtRLK2基因的過表達(dá)載體以及RNAi干擾載體，并應(yīng)用于提高煙草對(duì)青枯菌的抗性，進(jìn)而培育抗青枯病煙草品種（系）。為利用基因工程手段培育抗青枯病煙草新品種提供了基因資源，具有重要的應(yīng)用前景。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明通過設(shè)計(jì)引物，從抗青枯病煙草品種系3中克隆NtRLK2基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明提供了含有所述煙草LRR類受體蛋白激酶類基因NtRLK2基因的過表達(dá)載體以及RNAi載體。在pCAMBIA1301載體中引入一個(gè)帶有35S強(qiáng)啟動(dòng)子的基因表達(dá)盒改造為中間工程載體，暫將其命名為pSC1301，基于pSC1301引入NtRLK2基因，由增強(qiáng)型啟動(dòng)子35S啟動(dòng)，構(gòu)建超表達(dá)載體pSC1301- NtRLK2；RNAi載體基于本實(shí)驗(yàn)室已有改造載體，構(gòu)建后的RNAi載體為pSC1300-347- NtRLK2。分別將上述載體轉(zhuǎn)化EHA105 農(nóng)桿菌，通過葉盤法分別將其導(dǎo)入中感青枯病品種翠碧一號(hào)中。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代植株進(jìn)行青枯菌接種鑒定，結(jié)果表明NtRLK2基因的RNAi干擾明顯增強(qiáng)植株的抗病性，初步預(yù)測(cè)該基因可能是內(nèi)源抗病基因的互作基因，抑制了煙草抗青枯病基因的表達(dá)。這將為煙草抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明的煙草NtRLK2基因RNAi干擾載體轉(zhuǎn)基因煙草相比野生型煙草對(duì)青枯病抗病能力顯著提高，表明該基因沉默表達(dá)在煙草抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

有益效果

本發(fā)明克隆的煙草CC-NBS-LRR類抗病基因NtRRS2基因可提高煙草對(duì)青枯菌的抗性，對(duì)于煙草抗青枯病的遺傳改良以及培育抗青枯病煙草新品種（系）具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1 RACE獲得NtRLK2基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框電泳圖。A：5’RACE目的片段；B：3’RACE目的片段；C：ORF框目的片段。

圖2NtRLK2蛋白激酶區(qū)的多序列比對(duì)。

圖3 NtRLK2超表達(dá)載體和RNAi載體的構(gòu)建示意圖。

圖4 NtRLK2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草T0代鑒定。M：DL2,000 DNA Marker。1：陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；其余泳道為以T0代植株個(gè)體的DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖5 NtRLK2-RNAi轉(zhuǎn)基因煙草T0代鑒定。M：DL2,000 DNA Marker。1：陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；其余泳道為以T0代植株個(gè)體的DNA為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖6NtRLK2超表達(dá)與RNAi轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌的表型。

圖7 NtRLK2轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草接種青枯菌后的病情指數(shù)。

具體實(shí)施方式

【實(shí)施例1】RACE獲得NtRLK2基因3’未知序列和5’未知序列

從煙草454測(cè)序的結(jié)果中獲得候選基因片段，根據(jù)煙草非生物和生物脅迫454測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組合成花生的表達(dá)譜基因芯片，利用抗青枯病品種接種前后芯片雜交篩選青枯菌誘導(dǎo)前后基因的差異表達(dá)獲得候選基因片段，設(shè)計(jì)一對(duì)基因引物9-F（5′-AGCAGACTATCTAAGGGAAG-3′）和9-R（5′-CTTACTCCATCTGCTTTTCTGATCCAC-3′），根據(jù)模板接頭序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物RACE-F（5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT-3′）和RACE-R（5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30N-1N-3′(N=A，G，C，or T；N-1=A，G，or C)）。利用P9-R引物和RACE-F引物以及9-F引物和RACE-R引物配對(duì)分別進(jìn)行5′和3′-RACE反應(yīng)，5′-RACE反應(yīng)條件是94℃ 5min→(94℃ 30s→60℃ 30s→72℃ 2min)30 cycles→72℃10min；3′-RACE反應(yīng)條件是94℃ 5min→(94℃ 30s→72℃ 2min)5cycles →(94℃ 30s→65℃ 30s→72℃ 2min)30 cycles→72℃10min；根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的目的條帶基因的大小對(duì)PCR產(chǎn)物有目的的回收連接進(jìn)行T-A克隆，陽(yáng)性克隆送華大基因有限公司測(cè)序。

將獲得的5′和3′未知序列經(jīng)拼接后獲得其全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cNDA引物NtRLK2-FL-F（5’-CACACATTTTTTGTGAATCTTTCTTC-3’）和NtRLK2-FL-R（5’-GCTCTAAAGCAAATCTTGAC-3’）引物從單鏈cDNA擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)cDNA序列，反應(yīng)條件是94℃ 5min→(94℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 3min)30 cycles→72℃10min。對(duì)PCR產(chǎn)物有目的的回收連接進(jìn)行T-A克隆，陽(yáng)性克隆送華大基因有限公司測(cè)序并保存質(zhì)粒。

NtRLK2基因的3’未知序列和5’未知序列以及全長(zhǎng)cDNA克隆的電泳圖如圖1所示；其全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID No.1所示，該基因的cDNA序列全長(zhǎng)3352bp，命名NtRLK2，經(jīng)分析該基因編碼992個(gè)氨基酸，5‘非翻譯區(qū)長(zhǎng)約為122 bp，3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)為251bp，包含有31bp的Poly(A)尾巴。

利用NCBI進(jìn)行保守域預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)歸屬兩個(gè)超基因家族，即LRRNT_2（N端富含亮氨酸的家族2）和PKc_like（蛋白激酶催化類家族），包含有激酶類的功能位點(diǎn)：激活位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)、活性環(huán)（又稱A環(huán)）。從GenBank上，分別找出來源于擬南芥、葡萄、水稻和蓖麻的激酶區(qū)，利用ClustalW軟件進(jìn)行同源性比較。結(jié)果如圖2所示，盡管來源于不同的科屬，激酶區(qū)還是相當(dāng)保守的，這對(duì)該類蛋白行使生理功能是必需的。

【實(shí)施例2】NtRLK2超表達(dá)載體構(gòu)建與驗(yàn)證

通過NtRLK2-OE-F（5’-CGGCTCTAGAACCATGAAGCAAATTCTGATGGACAG-3’）和NtRLK2-OE-R（5’-CAACGGTACCCATAACATTCTCCAATGGTTG-3’）這對(duì)引物從具有完整讀碼框的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到包括終止密碼的NtRLK2基因

cDNA開放閱讀框，5′端3′端分別帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的由2×CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pSC1301和擴(kuò)增得到的NtRLK2目的片段同時(shí)用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株，構(gòu)建pSC1301-NtRLK2超表達(dá)載體（圖3A）。

在其非保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物NtRLK2-RNAi-SpeⅠ-F（5’-CAACACTAGTGAGCTTTTGTAATATCTGCA-3’）和NtRLK2-RNAi-KpnⅠ-R（5’-AATTGGTACCGTCTGTTCCAAGAGCTTCC-3’）以及NtRLK2-RNAi-XbaⅠ-F（5’-CAACTCTAGAGTCCGGTCATTAAGCTTCC-3’）和NtRLK2-RNAi-ClaⅠ-R（5’-CAACATCGATGACGCTGATTTAATTTGTCA-3’）。

分別以上述兩對(duì)引物擴(kuò)增NtRLK2基因的正向插入片段和反向插入片段，通過雙酶切和連接將正向和反向插入片段插入實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的中間表達(dá)載體pSC1300-347中，構(gòu)建pSC1300-347-NtRLK2（圖3B）。經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證插入片段是否正確。通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105以備煙草轉(zhuǎn)基因用。

【實(shí)施例3】煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定

采取根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，把分別帶有質(zhì)粒pSC1301-NtRLK2超表達(dá)載體和pSC1300-347-NtRLK2 RNAi干擾載體的農(nóng)桿菌通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草品種翠碧一號(hào)（CB-1），用15mg/L Hyg篩選葉芽及根系生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過程中用500 mg/L（Cef）來抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件溫度25℃±2℃，光照每天14h白天/10h黑夜。共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.1mg/L NAA+ 1mg/L 6-BA，誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+ 15mg/L Hyg +500mg/L Cef，生根培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+15mg/L Hyg +500mg/L Cef。

對(duì)于超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)，根據(jù)35S啟動(dòng)子和NtRLK2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物引物35S-F（5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’）和NtRLK2-R（5’-ATAACATTCTCCAATGGTTG-3’），CTAB法提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草DNA，以兩種轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，未轉(zhuǎn)化煙草DNA為對(duì)照，利用設(shè)計(jì)的35S-F和NtRLK2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.0μl，dNTP 1.5μl，35S-F 0.5μl，NtRLK2-R 0.5μl，Taq酶0.1μl，ddH₂O 14.4μl，模板DNA 1.0μl，總體積為20μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→58℃ 30 s→72 ℃ 60 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。對(duì)RNAi干擾載體轉(zhuǎn)基因植株，設(shè)計(jì)TNOS引物（Tnos-F: GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG，Tnos-R: CCGATCTAGTAACATAGATGACAC），CTAB法提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草DNA，以兩種轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，未轉(zhuǎn)化煙草DNA為對(duì)照，利用設(shè)計(jì)的Tnos-F和Tnos-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.0μl，dNTP 1.5μl，Tnos-F 0.5μl，Tnos-R 0.5μl，Taq酶0.1μl，ddH₂O 14.4μl，模板DNA 1.0μl，總體積為20μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min→（94 ℃ 30 s→55℃ 30 s→72 ℃ 30 s）40 cycles→72 ℃ 10min→ hold at 4℃。

超表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因植株用啟動(dòng)子下游正向引物與基因下游反向引物作為鑒定引物，得到長(zhǎng)1970bp大小的條帶（圖4），以超表達(dá)載體作為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對(duì)照，得到61株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植株，陽(yáng)性率為80.2%。以Tnos-F和Tnos-R為鑒定引物，以非轉(zhuǎn)基因?yàn)殛幮詫?duì)照，得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增到256bp的Tnos片段（圖5），得到58株陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率79.3%。

【實(shí)施例4】轉(zhuǎn)基因植株抗青枯病鑒定

將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株在8葉期分別用葉脈注射青枯菌，每株接種3葉，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定，同時(shí)接處非轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照組。接種2周后，陸續(xù)看到對(duì)照組開始發(fā)病，而轉(zhuǎn)基因植株葉片開始出現(xiàn)過敏斑，少數(shù)植株莖部發(fā)黑，開始輕微發(fā)病。一個(gè)月后，觀察其整體發(fā)病情況，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M出現(xiàn)明顯發(fā)病，三分之一植株凋萎死亡，大部分葉片枯黃褪綠。轉(zhuǎn)基因組出現(xiàn)不同程度的抗病性，RNAi干擾植株比超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)更明顯的抗性（圖6）。取接種葉片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組葉片嚴(yán)重枯黃萎蔫皺縮；超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株接種葉片出現(xiàn)病斑，少量傳播，部分葉片過敏死亡，小部分枯死；RNAi表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株葉片接種位置出現(xiàn)過敏死亡，幾乎不擴(kuò)散，顯現(xiàn)強(qiáng)抗性（圖6）。

通過病情指數(shù)具體評(píng)價(jià)接種植株整體的抗病性。在對(duì)54株NtRLK2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定中，有6株完全沒有發(fā)病，其他48株均有不同程度的發(fā)病，根據(jù)煙草抗性鑒定病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行病情進(jìn)行分級(jí)，計(jì)算出病情指數(shù)為35.9，根據(jù)表2 煙草抗青枯病抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，初步斷定為中抗（MR）。用同樣的方法對(duì)51株RNAi表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)有10株無(wú)發(fā)病，2株發(fā)病凋萎，余35株部分輕微發(fā)病，計(jì)算病情指數(shù)為19.6，表現(xiàn)為抗性（R）。對(duì)照組48株非轉(zhuǎn)基因植株接種青枯菌后，基本出現(xiàn)發(fā)病情況，根據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)算其病情指數(shù)為61.8，表現(xiàn)為感病（S）（圖7）。接種鑒定表明NtRLK2基因的RNAi干擾明顯增強(qiáng)植株的抗病性，初步預(yù)測(cè)該基因可能是內(nèi)源抗病基因的互作基因，抑制了煙草抗青枯病基因的表達(dá)。這將為煙草抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農(nóng)林大學(xué)

<120> NtRLK2基因在煙草抗青枯病中的應(yīng)用

<130> 18

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3352

<212> DNA

<213> NtRLK2全長(zhǎng)cDNA序列

<400> 1

acagactact gatgatcagt cgatgggggc gaaattaagg aagaacaaat gcatacctgg 60

ccataggttg gttagagtat tgtatcagag atagaagaaa caaagggaac tgtgaaacaa 120

aaatgagaac ctcattgtgt tgtagcatta ttctgttaag tttcgtcttc atttggctga 180

ataatgtaac agtaacagtg ttaggctctt ccttcagcga cctcgacacg ttgttgaagc 240

tcaaggaagc catgaaagga tcaaaagcca aacccgacgc gcttcaagat tggaaattct 300

caacctctat ctccgctcac tgttcattct ccggcgtcac ctgcgaccgc cagaacctcc 360

gcgtcgtggc ccttaacgtc tcctttgttc cccttttcgg cagcattccg ccggagatag 420

gcctcttgga caagctcgag agccttaccc tctcatcgga caatctcacc aaggagcttc 480

ccatggagct cgccaatctc acctccctca ggctcctcaa catctcgcac aaccttttct 540

ctggtcgctt ccccggcgat atcaccgtgg ccatgacaga actcgaaacg ctggacatct 600

acgacaacag cttcagcgga accttaccag aggagttcgt gagactggag aagctccggt 660

ccctcaacct ctctggaaac tatttctccg gcgagattcc tgagagttac tctgagttcg 720

aaagcttgga ggttctgaac ctggccacaa acagcttaac cggcaagatt ccgagaagct 780

tggtgaaatt gaagaagctg aaaagactat ccctcgggta tgataattcc tactcagatg 840

tagtacctac agaattcggt tcgttcgagt cgttgcaact gcttgatttg tccagctgta 900

acttgagcgg tgagattcct cccacgctcg gcgcgttaac tcacttgcac actctcttcc 960

ttcaaatgaa caaccttacc ggaaccattc cttcacaact ctccactatg ataagcctca 1020

agtcgttgga tctctcctac aacgagttaa cgggcgagtt tccgttgaca ttctctaagc 1080

tcaccaatct cacgctaatc aatttcttcc ataacaaact ccgaggcaac atccctccct 1140

tcgttgggga cctcccgaac ctggagacct ttcaggtttg gggtaacaac ttctccaacg 1200

tgcttccacc caaccttggc caaaacgcca gattcttata cttcgacgtc actaataacc 1260

acttcactgg agagctccct agggacctgt gcaaatccgg caggttgaga acgttcttgg 1320

ccaccggtaa cttcttttac ggcaccattc ctgaaggaat aggaggttgc gtttcgttgg 1380

agaagataag aattagtgat aacttcctcc aaggccaggt tcctcctggg atctttaaat 1440

tgccagctgt ccagatcatc gagatggcga ataaccgttt taacggaaat attccttctg 1500

atatttccgg ggattccctc agcatcctaa ccctctccac taacaacttc gccggcagga 1560

tcgcgccgga gctcaagaat ctccagaaac tgcagacgct tgcgcttgac gcgaaccagt 1620

tcgttggaga gattccaggg gaggtgtttg acttgccggc gttgatcaag gtcaacttga 1680

gcggcaacaa cctcaccggt gagattccgg agtcggtgat tcactgtggt tctctgacgg 1740

cggttgattt tagccggaac atgctcaccg gagaaattcc caaggggata aaaagcctca 1800

cagttctaag catcttgaac ctctcgcgca accacatcac cggaactgtc cccgacgaga 1860

ttcgcttcat gacgagcctc aacacgctgg atctctccaa caacaacttc attggaagag 1920

tccccacggg tggccagttc gtggccttca atgacaagtc gtttgcaggg aaccctaacc 1980

tctgctctcc gcaccagccg tattgtcctt cctccgtcaa cactgcctct ggaaaaagcc 2040

acaatcctct gagttcaaaa tcaactaagg tagttataat cgtgatcggg atctccacgg 2100

cagtgctcct ggctatggtg acggtataca ttatgaggaa gaggaagcac cagaaagaaa 2160

tgtcgtggaa gctgacggcg ttccagtcaa cgctgaaaat gaaggcagag gaggtggtgg 2220

aatgcttgaa ggaagagaac atcattggaa aaggaggagc aggaatcgtg taccgcggga 2280

caacaccgaa gggaacggag gtggcaatca agagacttgt ggggcaagga agtggaagaa 2340

acgattacgg tttcaaggcg gagatagaaa cgttagggaa gataaggcac aggaacataa 2400

tgaggctctt ggggtacgtg tcaaataagg acacgaacct gttgctgtat gagtacatgc 2460

cgaatggaag cttgggagag tggctgcatg gtgcgaaggg agggcacctc acgtgggaaa 2520

tgagataccg cattgcggtg gaggctgcca aggggctctg ctacttgcac catgattgct 2580

cgcccttgat cattcacagg gatgttaagt ccaataacat cttgcttgat gaggactttg 2640

aggctcacgt tgctgatttt gggctcgcca agttcttgca ggaccctgga gcgtctcagt 2700

ccatgtcctc cattgctggc tcctacggct acattgctcc agagtacgct tacacgctga 2760

aagtggacga gaagagcgat gtatacagct ttggagtagt gctgttggag ctgatcgtag 2820

gaaggaagcc agtgggtgag ttcggagatg gtgttgacat cgttggatgg gtcaacaaga 2880

ccatgtcgga gctgtctcag ccgtctgatg cggcttccgt gttggcagtg gtggacccca 2940

ggctcaatgg gtatccattg ggcagcgtca tccacatgtt caacatagct atgatgtgtg 3000

ttagagaaat tggccatgct aggcctacca tgagggaagt tgtttatatg ctcactaatc 3060

cacctcaatc taccacccat cataacctaa ttaatctcta gttcattacc ctttttaatt 3120

tcccctttgt aaataaatta acacagatga aactgtgcaa aatataataa ccttcatcta 3180

tatatatatg ggtagacgtg tattaatacc aaatgtaaaa taggtttgaa ttttggtttg 3240

atgttatttg tcaaagggag gggtttgtcc tgattgtgtt attatcagaa gttttgtata 3300

aaagataata tatgttgttg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3352

<210> 2

<211> 992

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Arg Thr Ser Leu Cys Cys Ser Ile Ile Leu Leu Ser Phe Val Phe

1 5 10 15

Ile Trp Leu Asn Asn Val Thr Val Thr Val Leu Gly Ser Ser Phe Ser

20 25 30

Asp Leu Asp Thr Leu Leu Lys Leu Lys Glu Ala Met Lys Gly Ser Lys

35 40 45

Ala Lys Pro Asp Ala Leu Gln Asp Trp Lys Phe Ser Thr Ser Ile Ser

50 55 60

Ala His Cys Ser Phe Ser Gly Val Thr Cys Asp Arg Gln Asn Leu Arg

65 70 75 80

Val Val Ala Leu Asn Val Ser Phe Val Pro Leu Phe Gly Ser Ile Pro

85 90 95

Pro Glu Ile Gly Leu Leu Asp Lys Leu Glu Ser Leu Thr Leu Ser Ser

100 105 110

Asp Asn Leu Thr Lys Glu Leu Pro Met Glu Leu Ala Asn Leu Thr Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Leu Asn Ile Ser His Asn Leu Phe Ser Gly Arg Phe Pro

130 135 140

Gly Asp Ile Thr Val Ala Met Thr Glu Leu Glu Thr Leu Asp Ile Tyr

145 150 155 160

Asp Asn Ser Phe Ser Gly Thr Leu Pro Glu Glu Phe Val Arg Leu Glu

165 170 175

Lys Leu Arg Ser Leu Asn Leu Ser Gly Asn Tyr Phe Ser Gly Glu Ile

180 185 190

Pro Glu Ser Tyr Ser Glu Phe Glu Ser Leu Glu Val Leu Asn Leu Ala

195 200 205

Thr Asn Ser Leu Thr Gly Lys Ile Pro Arg Ser Leu Val Lys Leu Lys

210 215 220

Lys Leu Lys Arg Leu Ser Leu Gly Tyr Asp Asn Ser Tyr Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Pro Thr Glu Phe Gly Ser Phe Glu Ser Leu Gln Leu Leu Asp Leu

245 250 255

Ser Ser Cys Asn Leu Ser Gly Glu Ile Pro Pro Thr Leu Gly Ala Leu

260 265 270

Thr His Leu His Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Gly Thr

275 280 285

Ile Pro Ser Gln Leu Ser Thr Met Ile Ser Leu Lys Ser Leu Asp Leu

290 295 300

Ser Tyr Asn Glu Leu Thr Gly Glu Phe Pro Leu Thr Phe Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Asn Leu Thr Leu Ile Asn Phe Phe His Asn Lys Leu Arg Gly Asn

325 330 335

Ile Pro Pro Phe Val Gly Asp Leu Pro Asn Leu Glu Thr Phe Gln Val

340 345 350

Trp Gly Asn Asn Phe Ser Asn Val Leu Pro Pro Asn Leu Gly Gln Asn

355 360 365

Ala Arg Phe Leu Tyr Phe Asp Val Thr Asn Asn His Phe Thr Gly Glu

370 375 380

Leu Pro Arg Asp Leu Cys Lys Ser Gly Arg Leu Arg Thr Phe Leu Ala

385 390 395 400

Thr Gly Asn Phe Phe Tyr Gly Thr Ile Pro Glu Gly Ile Gly Gly Cys

405 410 415

Val Ser Leu Glu Lys Ile Arg Ile Ser Asp Asn Phe Leu Gln Gly Gln

420 425 430

Val Pro Pro Gly Ile Phe Lys Leu Pro Ala Val Gln Ile Ile Glu Met

435 440 445

Ala Asn Asn Arg Phe Asn Gly Asn Ile Pro Ser Asp Ile Ser Gly Asp

450 455 460

Ser Leu Ser Ile Leu Thr Leu Ser Thr Asn Asn Phe Ala Gly Arg Ile

465 470 475 480

Ala Pro Glu Leu Lys Asn Leu Gln Lys Leu Gln Thr Leu Ala Leu Asp

485 490 495

Ala Asn Gln Phe Val Gly Glu Ile Pro Gly Glu Val Phe Asp Leu Pro

500 505 510

Ala Leu Ile Lys Val Asn Leu Ser Gly Asn Asn Leu Thr Gly Glu Ile

515 520 525

Pro Glu Ser Val Ile His Cys Gly Ser Leu Thr Ala Val Asp Phe Ser

530 535 540

Arg Asn Met Leu Thr Gly Glu Ile Pro Lys Gly Ile Lys Ser Leu Thr

545 550 555 560

Val Leu Ser Ile Leu Asn Leu Ser Arg Asn His Ile Thr Gly Thr Val

565 570 575

Pro Asp Glu Ile Arg Phe Met Thr Ser Leu Asn Thr Leu Asp Leu Ser

580 585 590

Asn Asn Asn Phe Ile Gly Arg Val Pro Thr Gly Gly Gln Phe Val Ala

595 600 605

Phe Asn Asp Lys Ser Phe Ala Gly Asn Pro Asn Leu Cys Ser Pro His

610 615 620

Gln Pro Tyr Cys Pro Ser Ser Val Asn Thr Ala Ser Gly Lys Ser His

625 630 635 640

Asn Pro Leu Ser Ser Lys Ser Thr Lys Val Val Ile Ile Val Ile Gly

645 650 655

Ile Ser Thr Ala Val Leu Leu Ala Met Val Thr Val Tyr Ile Met Arg

660 665 670

Lys Arg Lys His Gln Lys Glu Met Ser Trp Lys Leu Thr Ala Phe Gln

675 680 685

Ser Thr Leu Lys Met Lys Ala Glu Glu Val Val Glu Cys Leu Lys Glu

690 695 700

Glu Asn Ile Ile Gly Lys Gly Gly Ala Gly Ile Val Tyr Arg Gly Thr

705 710 715 720

Thr Pro Lys Gly Thr Glu Val Ala Ile Lys Arg Leu Val Gly Gln Gly

725 730 735

Ser Gly Arg Asn Asp Tyr Gly Phe Lys Ala Glu Ile Glu Thr Leu Gly

740 745 750

Lys Ile Arg His Arg Asn Ile Met Arg Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn

755 760 765

Lys Asp Thr Asn Leu Leu Leu Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu

770 775 780

Gly Glu Trp Leu His Gly Ala Lys Gly Gly His Leu Thr Trp Glu Met

785 790 795 800

Arg Tyr Arg Ile Ala Val Glu Ala Ala Lys Gly Leu Cys Tyr Leu His

805 810 815

His Asp Cys Ser Pro Leu Ile Ile His Arg Asp Val Lys Ser Asn Asn

820 825 830

Ile Leu Leu Asp Glu Asp Phe Glu Ala His Val Ala Asp Phe Gly Leu

835 840 845

Ala Lys Phe Leu Gln Asp Pro Gly Ala Ser Gln Ser Met Ser Ser Ile

850 855 860

Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Lys

865 870 875 880

Val Asp Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu

885 890 895

Leu Ile Val Gly Arg Lys Pro Val Gly Glu Phe Gly Asp Gly Val Asp

900 905 910

Ile Val Gly Trp Val Asn Lys Thr Met Ser Glu Leu Ser Gln Pro Ser

915 920 925

Asp Ala Ala Ser Val Leu Ala Val Val Asp Pro Arg Leu Asn Gly Tyr

930 935 940

Pro Leu Gly Ser Val Ile His Met Phe Asn Ile Ala Met Met Cys Val

945 950 955 960

Arg Glu Ile Gly His Ala Arg Pro Thr Met Arg Glu Val Val Tyr Met

965 970 975

Leu Thr Asn Pro Pro Gln Ser Thr Thr His His Asn Leu Ile Asn Leu

980 985 990

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcagactat ctaagggaag 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttactccat ctgcttttct gatccac 27

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcagtggt atcaacgcag agtggccat 29

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

attctagagg ccgaggcggc cgacatgdtn n 31

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacacatttt ttgtgaatct ttcttc 26

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctaaagc aaatcttgac 20

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggctctaga accatgaagc aaattctgat ggacag 36

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caacggtacc cataacattc tccaatggtt g 31

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caacactagt gagcttttgt aatatctgca 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aattggtacc gtctgttcca agagcttcc 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caactctaga gtccggtcat taagcttcc 29

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caacatcgat gacgctgatt taatttgtca 30

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgatgtgata tctccactga cgtaag 26

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ataacattct ccaatggttg 20

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatcgttcaa acatttggca ataaag 26

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccgatctagt aacatagatg acac 24