一種蛋白在煙草耐旱性檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白在煙草耐旱性檢測中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 干旱嚴(yán)重影響作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)。提高植物的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代 植物研究工作中的關(guān)鍵問題之一?？购禉C理的研究是抗旱育種的基礎(chǔ)，也是育種的關(guān)鍵因 素之一。經(jīng)歷了幾十年的努力，對植物抗旱的研究已從抗旱指標(biāo)的表觀因素分析，進入到分 子及基因水平的探索。
[0003] 近年來，隨著全球氣候變暖，干旱已成為我國作物生產(chǎn)中頻繁發(fā)生的自然災(zāi)害。煙 草作為中國重要的經(jīng)濟作物，在整個生育期對水分的要求很高。中國大部分煙區(qū)處于干旱、 半干旱環(huán)境中，而且優(yōu)質(zhì)煙區(qū)多位于丘陵山區(qū)，常因土壤干旱而影響煙株的生長發(fā)育，導(dǎo)致 煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)降低，干旱已成為制約我國煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)提高的主要限制因子之一。 因此，加強煙草抗旱基因資源的挖掘和利用，對于煙草抗旱新品種培育，實現(xiàn)煙草農(nóng)業(yè)可持 續(xù)發(fā)展具有重大意義。
[0004] 自20世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)外學(xué)者在干旱對煙草生長、發(fā)育、代謝的影響等方面 做了大量研究，取得了一些重要進展。歸納起來主要有以下幾個方面：第一，干旱對煙草生 理的影響，主要表現(xiàn)在：（1)干旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進了葉綠素的分解，從而影 響了葉片的光合效率（Plant Molecular Biology，1979, 20:37-44)。（2)干旱脅迫導(dǎo)致植 株氮素代謝關(guān)鍵酶-硝酸還原酶（NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增強引起脯氨酸、谷 氨酰胺、天冬酰胺和纈氨酸等大量積累。（3)干旱脅迫導(dǎo)致葉片膜脂過氧化作用增強，膜透 性增加，丙二醛（MDA)含量升高，出現(xiàn)電解質(zhì)外滲。抗氧化保護酶S0D、P0D、CAT等酶活性顯 著下降。第二，干旱對煙草生長發(fā)育的影響，主要表現(xiàn)在：（I)干旱脅迫降低了種子的萌發(fā) 和幼苗的成活。（2)抑制了根系的生長，從而影響了礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收。（3)干旱脅迫導(dǎo)致植 株矮小，節(jié)間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了干旱對煙草生長、發(fā)育及代謝影響 的生理生化基礎(chǔ)，但缺乏對煙草抗旱分子遺傳機理的研究。
[0005] 近年來，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，抗旱基因的發(fā)掘成為目前作物 抗逆遺傳資源與品種改良研究的熱點，越來越多的抗旱相關(guān)基因相繼被克隆和鑒定。按 照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關(guān)基因分為兩大類：第一類基因為功能基因，主要 在植物抗性中起保護作用。這一類基因主要包括滲透調(diào)芐基因如：海藻糖合成酶基因 77^7/八氨酸合成酶基因甘露醇合成基因?以從甜菜堿醛脫氫酶基因似及多胺合 成基因 PA等；保護生物大分子的活性基因如：脫水蛋白基因說W/、水通道蛋白基因乂以和 晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白LEA等。第二類基因為調(diào)芐基因，主要在信號傳導(dǎo)和逆境基因表達 過程中起調(diào)節(jié)作用，主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子基因如：伽觀、從於/八原《7、等。這些基 因已在植物基因工程中得到應(yīng)用。
[0006] 目前，這些研究都還只是集中在轉(zhuǎn)錄水平的研究，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA會進一步的 翻譯成蛋白質(zhì)，翻譯后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過各種修飾加工，其中部分翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì) 甚至?xí)苯颖唤到獾?。所以在轉(zhuǎn)錄水平的研究不能夠完全反映出植物耐旱機制。同時煙草 耐旱性狀很難再表型上予以定量的鑒定。以上這些需要一種更為準(zhǔn)確的鑒定煙草耐旱性的 方法。
[0007] 煙草 histone H4 isoform Xl 型組蛋白的 NCBI 登錄號為 GI :698497211。H4 型組 蛋白是組成真核細胞染色體核小體主要成分之一，一個核小體由兩個H2A，兩個H2B，兩個 H3,兩個H4組成的八聚體和147bp纏繞在外面的DNA組成。研究表明：這些組成成分的核 心部分狀態(tài)大致是均一的，游離在外的N-端則可以受到各種各樣的修飾，包括組蛋白末 端的乙?；?，甲基化，磷酸化，泛素化等等。所以組蛋白的修飾與基因表達調(diào)控有關(guān)。
[0008] heat shock protein 82 的 NCBI 登錄號為 GI :697107663。該蛋白為 HSP90(熱激 蛋白90)類似蛋白。熱激蛋白為生物體受熱或其他理化作用，新合成的或含量增加的一類 分子伴侶。熱激蛋白根據(jù)分子量可以分為HSP60、HSP70、HSP90、HSPllO級小分子量熱激蛋 白 [13]。HSP90是受ATP調(diào)節(jié)的二聚體分子伴侶家族，它包含三個高度保守的結(jié)構(gòu)域，N端 結(jié)構(gòu)域、中間段結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域 [4]。
[0009] HSP90作為分子伴侶，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白折疊，蛋白降解，正常和脅迫下植物的發(fā)育 都起到重要的作用[5]。已有研究結(jié)果表明，貨堪因家族廣泛參與各類生物及非生物的 脅迫響應(yīng)。
[0010] Wang等[6]從小麥中克隆了 3個細胞質(zhì)你9貨嗾基因--TaHsp90. l、TaHsp90. 2 和過表達域遵因的小麥植株對小麥條銹病產(chǎn)生抗性。 AtHsp90.1 通過與 R蛋白 RARl (required for MLA12 resistance 1)和SGTl (suppressor of G2 allele of suppressor of kinetochore protein 1)結(jié)合能對小麥葉銹病、大麥 抗白粉病等產(chǎn)生抗性[78]。同時，Hsp90s能被如鹽、旱、低溫、熱激、重金屬、堿等非生物脅 迫強烈誘導(dǎo) [9 12]。在擬南芥中已經(jīng)克隆了 7個思φ貨堪因，Hsp90. l~Hsp90. 4定位于細 胞質(zhì)，Hsp90. 5、Hsp90. 6、Hsp90. 7分別定位于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[13 14]。AtHsp90. 2、 AtHsp90. 3、AtHsp90. 4的蛋白序列高度相似，相似度至少達到96%，推測它們的功能存在 重復(fù)[9]。
[0011] 研究發(fā)現(xiàn)在不同的溫度條件下，過表達J 7或J i基因的啤酒酵母 都能生長，表現(xiàn)出分子伴侶的功能一致性[15]。當(dāng)水稻受到鹽、堿、旱、高溫脅迫，尤其是 鹽脅迫時，堪因表達量顯著增加；在酵母和煙草中過表達堪因，能提高植 株對高鹽脅迫的耐受性[16]。大腸桿菌中表達PgHsp90蛋白后，增強了對熱、鹽和脫水脅迫 耐受性，在不同的脅迫下貨堪因表達量都會相應(yīng)增加以滿足蛋白折疊的需要 [17]。 研究還發(fā)現(xiàn)：Hsp90s在植物體內(nèi)的平衡對細胞脅迫反應(yīng)或耐受性的產(chǎn)生有一定的作用。在 擬南芥中過表達義故切如.么義故切如.釾p義故切如.7，雖然降低了植株對高鹽和旱的耐受 能力，但是提高了對Ca 2+離子濃度的耐受性[14]。過表達J 使酵母在高溫條件 下生長；過表達貨λ猶擬南芥植株對高溫敏感、對重金屬離子的耐受性低，但是同 樣耐受高Ca2+濃度[18]。
[0012] 到目前為止，尚未有關(guān)于histone Η4 isoform Xl型組蛋白及heat shock protein 82蛋白參與耐旱的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明目的在于提供一種蛋白在煙草耐旱性檢測中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的，通過測定作為煙草耐旱性標(biāo)記物的所述蛋白的差異表 達來判斷煙草的耐旱性。
【附圖說明】
[0015] 圖1為對照(左）與干旱處理(右）煙草植株； 圖2為不同樣品的CV值分布； 圖3為圖3不同樣品CV值的盒形圖； 圖中：盒子的上下兩邊為上下四分位數(shù)線，盒子上的黑色橫線代表了中位數(shù)所在位 置； 圖4為樣品相關(guān)性分析； 圖中：對角線上的值代表了不同樣品，下三角為兩兩樣品之間的蛋白質(zhì)豐度分布的線 性回歸擬合圖，上三角的數(shù)字代表了兩兩樣品之間的相關(guān)系數(shù)。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于 本發(fā)明教導(dǎo)所做的任何變換，均落入本發(fā)明保護范圍。
[0017] 本發(fā)明所述的一種蛋白在煙草耐旱性檢測中的應(yīng)用為通過測定作為煙草耐旱性 標(biāo)記物的所述蛋白的差異表達來判斷煙草的耐旱性。
[0018] 所述蛋白為histone H4 isoform Xl型組蛋白。
[0019] 所述histone H4 isoform Xl型組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :1所示。
[0020] 所述蛋白也可為heat shock protein 82蛋白。
[0021] 所述heat shock protein 82蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0022] 本發(fā)明通過篩選在煙草干旱處理與未處理植株差異表達的蛋白質(zhì)，找到了兩種在 干旱處理與未處理植株存在顯著差異表達的蛋白質(zhì)（在干旱處理煙株中上調(diào)表達），經(jīng)質(zhì) 譜鑒定為histone H4 isoform Xl型組蛋白及heat shock protein 82蛋白。用同位素 標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記不同抗性煙草品種葉片蛋白質(zhì)酶解之后的肽 段，通過鳥槍法（shotgun)技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)hi stone H4 isoform Xl型組蛋白及heat shock protein 82蛋白在干旱處理煙株中上調(diào)表達。
[0023] 基于蛋白質(zhì)煙草histone H4 isoform Xl 型組蛋白及heat shock protein 82 蛋 白與煙草耐旱性這種相關(guān)性，本發(fā)明首次提供了蛋白質(zhì)煙草histone H4 isoform Xl型組 蛋白及heat shock protein 82蛋白在煙草耐旱性檢測中的應(yīng)用。如果蛋白質(zhì)煙草histone H4 isoform Xl型組蛋白及heat shock protein 82蛋白煙草品種中呈上調(diào)表達，則提示該 待檢煙草品種對干旱具有較高的抗性。
[0024] 通過histone H4 isoform Xl 型組蛋白及heat shock protein 82 蛋白在煙草耐 旱性檢測中的應(yīng)用，可以可靠、靈敏地檢測煙草耐旱性，為篩選煙草耐旱性品種以及輔助傳 統(tǒng)雜交育種提供一條全新的途徑，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0025] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特列舉以下具體實施例詳細說明。然 而，具體實施例僅僅是用于舉例說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0026] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。