專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因米粉標(biāo)準(zhǔn)樣品、其建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因米粉BT63的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因米粉BT63中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是人民生活的主糧，我國(guó)又是水稻的主產(chǎn)區(qū)，毎年我國(guó)出口到日本、韓國(guó)等國(guó)家的糙米、大米等產(chǎn)品占我國(guó)水稻產(chǎn)量的近1/3。為提高水稻產(chǎn)量，我國(guó)在轉(zhuǎn)基因水稻研究方面已經(jīng)進(jìn)行了廣泛深入的研究，并取得了可喜的成果 ，但并未批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化種植。然而，去年在湖北等國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上出現(xiàn)了未經(jīng)商業(yè)化批準(zhǔn)種植的轉(zhuǎn)BT基因大米的銷(xiāo)售，并被國(guó)外檢測(cè)公司公布于眾。這給我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的貿(mào)易帶來(lái)了非常不好的影響。為此，韓國(guó)、日本等國(guó)對(duì)我國(guó)出口的糙米、大米等產(chǎn)品要求批批實(shí)施轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)水稻尚未在全球任何地區(qū)獲準(zhǔn)種植，對(duì)于Bt轉(zhuǎn)基因水稻也未通過(guò)任何環(huán)境影響評(píng)估和人類(lèi)食品安全評(píng)估。但是，從其它Bt轉(zhuǎn)基因作物(如玉米和棉花)的研究結(jié)果中，已經(jīng)可以推斷出Bt水稻會(huì)對(duì)環(huán)境造成極大的影響，并且引起人類(lèi)食品安全問(wèn)題。2006年以來(lái)，我國(guó)出口的米制品中多次被歐盟和日本檢出轉(zhuǎn)基因水稻成分，其中多為我國(guó)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因水稻汕優(yōu)63號(hào)(BT63)。由于我國(guó)尚未向轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)放生物安全證書(shū)，出口米制品中檢出轉(zhuǎn)基因水稻成分對(duì)我國(guó)的米制品出口貿(mào)易造成了一定影響。與出ロ米制品類(lèi)似，我國(guó)檢驗(yàn)檢疫部門(mén)也從美國(guó)進(jìn)ロ的大米中檢出了未經(jīng)我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)境的抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻成分。開(kāi)展轉(zhuǎn)基因成分檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制在保證測(cè)試結(jié)果的可比性和溯源性，保障食品安全，解決貿(mào)易爭(zhēng)端，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面均具有重要的意義。2008年，我們首次研制了轉(zhuǎn)基因玉米Mon810品系、NK603品系、T25品系、BTll品系、轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系標(biāo)準(zhǔn)樣品以及相應(yīng)的分子DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。這些標(biāo)準(zhǔn)樣品在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)工作中發(fā)揮了巨大作用。然而，在我國(guó)米制品出口被檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因BT63成分后，國(guó)內(nèi)外各食品安全管理機(jī)構(gòu)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)，開(kāi)始大量地開(kāi)展米制品中轉(zhuǎn)基因成分BT63的檢測(cè)，但國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)卻始終沒(méi)有轉(zhuǎn)基因BT63的標(biāo)準(zhǔn)樣品。國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因BT63品系標(biāo)準(zhǔn)樣品緊缺。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因水稻BT63品系標(biāo)準(zhǔn)樣品緊缺的狀況，我們研制了轉(zhuǎn)基因米粉BT63品系標(biāo)準(zhǔn)樣品，本發(fā)明中，所述的轉(zhuǎn)基因米粉BT63即轉(zhuǎn)基因水稻BT63磨制成粉狀之后的產(chǎn)品，本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備完成，對(duì)全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，積極開(kāi)展我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測(cè)量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。轉(zhuǎn)基因水稻BT63品系簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因水稻BT63在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)轉(zhuǎn)入的外源基因是抗蟲(chóng)基因crylAb/crylAc，由NOS終止子調(diào)控。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)路線(xiàn)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一方面在于公開(kāi)ー種轉(zhuǎn)基因米粉BT63標(biāo)準(zhǔn)樣品，其由下述方法制備，步驟包括a.在無(wú)菌操作間中，使用研缽粉磨水稻樣品，過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩，制成了米粉，向粉末中加入4倍質(zhì)量的水，攪拌均勻；b.將混合樣品放置于中試凍干機(jī)中低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；c.將混合凍干粉樣品分裝于經(jīng)160° C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶?jī)?nèi)裝混合凍干粉樣品lg。d.獲500瓶轉(zhuǎn)基因米粉標(biāo)準(zhǔn)樣品。瓶裝后的樣品加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于陰涼干燥處(TC 4°C貯存。上述步驟(a) Cd)中任ー項(xiàng)所述的凍干，其具體步驟如下低溫真空冷凍干燥程序①樣品預(yù)凍先把樣品在_80°C冷凍2h ；②冷凍過(guò)程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門(mén)，開(kāi)始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C時(shí)，開(kāi)始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時(shí)，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門(mén)；啟動(dòng)真空泵開(kāi)始抽真空；當(dāng)真空度降至O. 5Torr時(shí)，結(jié)束冷凍過(guò)程；③樣品干燥干燥室的溫度設(shè)置為15°C，當(dāng)真空度降至O. ITorr吋，樣品已干燥好;④關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開(kāi)干燥室門(mén)，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。本發(fā)明的另一方面在于公開(kāi)ー種轉(zhuǎn)基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測(cè)試劑盒，包括轉(zhuǎn)基因米粉BT63檢測(cè)基因和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，其中，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品是利用上述a d的方法制備的轉(zhuǎn)基因米粉BT63標(biāo)準(zhǔn)樣品；轉(zhuǎn)基因米粉BT63檢測(cè)基因，包括SPS基因的檢測(cè)引物和探針序列正向引物5，-ttgcgcctgaacggatat-3’SEQ ID NO 1反向引物5，-cggttgatcttttcgggatg-3，SEQ ID NO 2探針5，-FAM-tccgagccgtccgtgcgtc-TAMRA-3，SEQ ID NO 3crylAc/NOS基因的檢測(cè)引物和探針序列正向引物5，-gactgctggagtgattatcgacaga-3，SEQ ID NO 4反向引物5，-agctcggtacctcgacttattcag-3，SEQ ID NO 5探針5，-FAM-tcgagttcattccagttactgcaacactcgag-TAMRA-3，SEQ ID NO 6其中FAM為 6-carboxyfluorescein, TAMRA 為 6-carboxytetramethylrhodamine。本發(fā)明中，上述檢測(cè)試劑盒中，采用了開(kāi)放式的描述形式，其含義是均未限定檢測(cè)試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，并通過(guò)配置或商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)獲得，檢測(cè)試劑盒的使用方法和檢測(cè)條件，技術(shù)人員可以依據(jù)實(shí)施例中所列條件做參考依據(jù)進(jìn)行調(diào)整。這些關(guān)于制劑方式和方法的選擇，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從現(xiàn)有技術(shù)中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。
試劑盒的使用方法是以待測(cè)樣品的基因組為模板，利用轉(zhuǎn)基因米粉BT63檢測(cè)基因，經(jīng)過(guò)Real-Time PCR反應(yīng)，結(jié)束后確認(rèn)Real-Time PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最后可以利用公式計(jì)算待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量?；蛘咄ㄟ^(guò)PCR特異性的引物和探針序列，擴(kuò)增待測(cè)樣品與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，并將擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻BT63品種，具體制作和檢測(cè)方法參照實(shí)施例。上文所描述的使用方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方式，以此為例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的公知常識(shí)進(jìn)行更多拓展。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備完成及其制備方法的建立，對(duì)解決轉(zhuǎn)基因BT63品系檢測(cè)分子標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，開(kāi) 展我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測(cè)量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用價(jià)值。


圖I :轉(zhuǎn)基因米粉BT63標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、檢測(cè)エ藝流程。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。轉(zhuǎn)基因水稻BT63在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)轉(zhuǎn)入的外源基因是抗蟲(chóng)基因crylAb/crylAc，由NOS終止子調(diào)控。我國(guó)尚未發(fā)放轉(zhuǎn)基因水稻BT63生物安全證書(shū)。轉(zhuǎn)基因水稻BT63品系原料獲贈(zèng)于遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局；研缽，100目標(biāo)準(zhǔn)篩，DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司(貨號(hào)D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購(gòu)于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7500型；核酸蛋白分析儀日本日立公司。實(shí)施例I轉(zhuǎn)基因米粉狀標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟a.在無(wú)菌操作間中，使用研缽粉磨水稻樣品，過(guò)100目標(biāo)準(zhǔn)篩，向粉末中加入4倍質(zhì)量的水，攪拌均勻；b.將混合樣品放置于中試凍干機(jī)中低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；c.將混合凍干粉樣品分裝于經(jīng)160°C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶?jī)?nèi)裝混合凍干粉樣品lg。d.獲500瓶轉(zhuǎn)基因米粉標(biāo)準(zhǔn)樣品。瓶裝后的樣品加貼唯一性標(biāo)識(shí)，放置于陰涼干燥處(TC 4°C貯存。上述步驟(a) Cd)中任ー項(xiàng)所述的凍干，其具體步驟如下低溫真空冷凍干燥程序
①樣品預(yù)凍先把樣品在_80°C冷凍2h ；②冷凍過(guò)程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門(mén)，開(kāi)始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C時(shí)，開(kāi)始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C時(shí)，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門(mén)；啟動(dòng)真空泵開(kāi)始抽真空；當(dāng)真空度降至O. 5Torr時(shí)，結(jié)束冷凍過(guò)程；③樣品干燥干燥室的溫度設(shè)置為15°C，當(dāng)真空度降至O. ITorr時(shí)，樣品已干燥好;④關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開(kāi)干燥室門(mén)，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋，制備成混合凍干粉。e.將混合凍干粉樣品分裝于經(jīng)160°C干熱處理2h的潔凈的棕色玻璃瓶中封蓋密封，甸瓶?jī)?nèi)裝混合凍干粉樣品lg，獲500瓶轉(zhuǎn)基因米粉標(biāo)準(zhǔn)樣品。瓶裝后的樣品加貼卩隹一性標(biāo)識(shí)，放置于陰涼干燥處0°C 4°C貯存。實(shí)施例2定值方法采用《水稻及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》SN/T 2584-2010和《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定量PCR檢測(cè)方法》GB/T 19495. 5-2004進(jìn)行定值。(a) DNA提取試劑盒寶生物工程(大連)有限公司(貨號(hào)D9093)(b) TaqMan Universal Master Mix :ABI 公司(c)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7500型(d)核酸蛋白分析儀日本日立公司檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻BT63品系特異性及內(nèi)源SPS基因的引物序列和探針序列見(jiàn)下表I。表I檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻BT63品系特異性基因的引物序列和探針序列SPS棚的檢測(cè)11物和探針序列.
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因米粉BT63標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在干，由下述方法制備，步驟包括 將原料研磨成粉末，過(guò)100目篩，將過(guò)篩后的粉末收集，向粉末中加入4倍質(zhì)量的水，攪拌均勻后，放置于中試凍干機(jī)中低溫真空冷凍干燥制備成凍干粉；分裝后于0°C 4°C貯存；上述低溫真空冷凍干燥的步驟包括 ①樣品預(yù)凍先把樣品在_80°C冷凍2h； ②冷凍過(guò)程關(guān)好冰凍干燥機(jī)的干燥室門(mén)，開(kāi)始干燥室制冷；干燥室溫度降至-35°C吋，開(kāi)始冷卻阱制冷；冷卻阱制冷溫度降至-40°C吋，將步驟①處理的樣品迅速放入干燥室內(nèi)，關(guān)好干燥室門(mén)；啟動(dòng)真空泵開(kāi)始抽真空；當(dāng)真空度降至O. 5Torr時(shí)，結(jié)束冷凍過(guò)程； ③樣品干燥干燥室的溫度設(shè)置為15°C，當(dāng)真空度降至O.ITorr吋，樣品已干燥好； ④關(guān)閉真空泵，使干燥室與外界大氣相通，待內(nèi)外氣壓平衡后，打開(kāi)干燥室門(mén)，取出樣品，迅速旋緊瓶蓋。
2.—種轉(zhuǎn)基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括轉(zhuǎn)基因米粉BT63檢測(cè)基因和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品是權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因米粉BT63標(biāo)準(zhǔn)樣品； 轉(zhuǎn)基因米粉BT63檢測(cè)基因，包括 SPS基因的檢測(cè)引物和探針序列 正向引物 SEQIDN0:1 反向引物 SEQ ID NO :2 探針SEQ ID NO 3 crylAc/NOS基因的檢測(cè)引物和探針序列 正向引物 SEQ ID NO :4 反向引物 SEQ ID NO :5 探針SEQ ID NO :6。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種轉(zhuǎn)基因米粉BT63的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻BT63中的應(yīng)用，分別以轉(zhuǎn)基因水稻BT63為原料，將原料研磨、過(guò)篩、加水，攪拌、制備成凍干粉；再分裝,0℃~4℃貯存；通過(guò)上述方法獲得轉(zhuǎn)基因米粉BT63的標(biāo)準(zhǔn)樣品，也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻BT63的Real-Time PCR檢測(cè)試劑盒。這對(duì)全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，積極開(kāi)展我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測(cè)量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102690885SQ20121017220
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟 申請(qǐng)人:于兵, 徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟