一種抗青枯病的婁徹氏鏈霉菌菌株及其生物有機肥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗青枯病的拮抗菌，該菌株命名為婁徹氏鏈霉菌(Streptomyces rochei)L?9，已于2013年09月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.8264。本發(fā)明菌株L?9表現(xiàn)出較強的拮抗青枯菌的性能，拮抗圈半徑達到15mm。本發(fā)明為青枯病的生物防治提供新的微生物資源，克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。CGMCC No.826420130925
【專利說明】
一種抗青枯病的婁徹氏鏈霉菌菌株及其生物有機肥
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗青枯病的拮抗菌，具體涉及一種婁徹 氏鏈霉菌(Streptomyces rochei)L-9菌株，同時涉及該菌株在抗青枯病方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草青枯病是熱帶、亞熱帶地區(qū)煙草的主要病害之一，目前在中國長江流域及其 以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺灣、湖南、江西、廣西東部、安徽南部、四川及貴州 局部煙區(qū)為害嚴重，個別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。近幾年來，該病的發(fā)病和為 害范圍有向北方煙區(qū)擴展的趨勢，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害 較重。目前該病造成的損失已居各類病害的第4位。常用防治青枯病的策略包括化學農(nóng)藥、 土壤改良、抗病品種、嫁接與輪作等，但效果均不穩(wěn)定。此外，過量施用化學農(nóng)藥帶來的環(huán)境 污染和食品安全問題，引起人們廣泛關(guān)注和擔憂。因此，如何發(fā)展環(huán)境友好型的防病措施、 實現(xiàn)減少農(nóng)藥用量、抑制病害發(fā)展、恢復(fù)土壤健康是目前亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種抗青枯病的婁徹氏鏈霉菌菌株及其生物 有機肥，為青枯病的生物防治提供新的微生物資源。
[0004]本發(fā)明所述的抗青枯病的詰抗菌，該菌株命名為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei)L-9,已于2013年09月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No.8264。
[0005] 本發(fā)明的菌株L-9具有如下特性：
[0006] 1、L_9在高氏一號固體培養(yǎng)基上，菌絲發(fā)達，乳白色略帶褐色，中心呈黑色，氣絲豐 茂，絨狀，灰色?；z無色，有時轉(zhuǎn)接后略帶微紅色調(diào)。
[0007] 2、L-9表現(xiàn)出較強的詰抗青枯菌的性能，詰抗圈半徑達到15mm。
[0008] 3、采用細菌基因組DNA小量試劑盒(AxyPrep，美國）高鹽沉淀法提取DNA1CR擴增 通用引物為27F/1541R。即正向引物：5' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物^'-AAGGAGGTGATCCA GCCGCAI^ieS rRNA基因序列測序結(jié)果表明，L-9的16S rRNA基因序列為 1488bp，序列在NCBI網(wǎng)站的Genbank在線序列比對結(jié)果顯示，L-9與Streptomyces rochei的 同源性在99%以上，根據(jù)形態(tài)特征和16S rDNA鑒定為婁徹氏鏈霉菌。
[0009] 將本發(fā)明的菌株以5%的接種重量接入菜柏酶解的菜柏有機肥與牛糞堆肥以重量 比1:1混合而成的有機肥中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30~45 °C，含水量30~40 %，時 間4~5天，發(fā)酵完成后含水量達到34.9 %，即為生物有機肥。該生物有機肥對青枯病有明顯 的防治效果。
【附圖說明】
[0010] 附圖1為拮抗菌L-9的平板拮抗效果；
[0011] 附圖2為基于分離菌株和其親緣關(guān)系相近菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā) 育樹(鄰接法）；
[0012] 附圖3為盆栽基質(zhì)中茄科勞爾氏菌的數(shù)量；
[0013]附圖4為盆栽基質(zhì)中拮抗菌L-9的數(shù)量。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1本發(fā)明拮抗菌L-9的分離和鑒定
[0015] 1.1拮抗菌L-9的分離與篩選
[0016]從貴州省多處煙草青枯病發(fā)病田間采集未發(fā)病的煙株及根際土，低溫保存，用于 分離拮抗菌。對煙株樣品的處理:取根莖組織，先用2%的次氯酸鈉表面消毒2min，然后用 滅菌后的去離子水洗潤洗3~5次。對土壤樣品或或處理后的煙株樣品，按照稀釋涂布平板 法將土壤溶液或植株樣品溶液稀釋到ΠΓ 1~ΚΓ6待用。
[0017] 將土壤溶液或植株樣品溶液均勻的涂布于高氏一號培養(yǎng)基上，在30°C黑暗條件 下，培養(yǎng)24h后，待菌落長出后將青枯病病原菌Ralstonia solanacearum菌懸液均勾噴在平 板上，進行培養(yǎng)觀察。從土壤和煙株上分離、篩選到219株拮抗菌株，綜合評估其拮抗圈大 小、生長速度、貧營養(yǎng)下的生長情況、是否耐鹽等相關(guān)指標，最后選取到一株拮抗菌L-9。常 規(guī)鑒定結(jié)果顯示，L-9在高氏一號固體培養(yǎng)基上，菌絲發(fā)達，乳白色略帶褐色，中心呈黑色， 氣絲豐茂，絨狀，灰色?；z無色，有時轉(zhuǎn)接后略帶微紅色調(diào)。L-9表現(xiàn)出較強的拮抗青枯菌 的性能，詰抗圈半徑達到15mm。
[0018] 1.2拮抗菌的16S rRNA基因鑒定及基因序列分析
[0019] 采用細菌基因組DNA小量試劑盒(AxyPrep，美國）高鹽沉淀法提取DNAJCR擴增通 用引物為27F/1541R。即正向引物：57 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物：57 -AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3,。
[0020] 16S rRNA基因序列測序結(jié)果表明，L-9的16S rRNA基因序列為1488bp，序列在NCBI 網(wǎng)站的66油3111<:在線序列比對結(jié)果顯示兒-9與31:代口1:〇1115^8 1'〇(3116；[的同源性在99%以上， 根據(jù)形態(tài)特征和16S rDNA鑒定為婁徹氏鏈霉菌(詳見圖2)。
[0021] 1.3菌株L-9生產(chǎn)方法
[0022] 1.3.1菌株一級種子液制備
[0023] L-9在高氏一號液體培養(yǎng)基中，30°C搖床中170rpm培養(yǎng)48h，制成一級種子液。
[0024] 1.3.2功能菌種L-9菌株一級種子擴大培養(yǎng)
[0025] 經(jīng)多次一級種子小試擴大培養(yǎng)試驗，對L-9菌株一級種子擴大培養(yǎng)技術(shù)參數(shù)優(yōu) 化，初步形成以下中試生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。
[0026] 培養(yǎng)基配方:PDA改良培養(yǎng)基1號；
[0027]發(fā)酵pH:消前7 · 2，消后7 · 0;
[0028] 接種重量：1% ;
[0029] 培養(yǎng)溫度:37度；
[0030] 一級種子轉(zhuǎn)速：160~170轉(zhuǎn)/分鐘；
[0031] 培養(yǎng)時間：16~18h;
[0032] 含菌量：2~3X108cfu/mL。
[0033] 1.3.3功能菌種L-9菌株二級種子擴大培養(yǎng)
[0034] 經(jīng)多次二級種子小試擴大培養(yǎng)試驗，對L-9菌株二級種子擴大培養(yǎng)技術(shù)參數(shù)優(yōu)化， 初步形成以下中試生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。
[0035] 培養(yǎng)基配方:PDA改良培養(yǎng)基2號+0.1 %消泡劑；
[0036]培養(yǎng)pH:消前7.2,消后7.0;
[0037] 接種重量:5% ;
[0038] 培養(yǎng)溫度：35 Γ;
[0039] 二級培養(yǎng)轉(zhuǎn)速:45~50Hz;
[0040] 通氣量:35 ~40m3/h;
[0041] 壓力：0.045~0.05MPa;
[0042] 溶氧：80 ~85 %;
[0043] 培養(yǎng)時間：17~18h;
[0044] 含菌量：1 ~2X109cfu/mL。
[0045] 1.3.4功能菌種L-9菌株500L擴大培養(yǎng)
[0046] 經(jīng)多次擴大培養(yǎng)小試試驗，對L-9菌株擴大培養(yǎng)技術(shù)參數(shù)優(yōu)化，初步形成以下中試 生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。
[0047] 培養(yǎng)基配方:PDA改良培養(yǎng)基3號+0.15%消泡劑；
[0048]發(fā)酵pH:消前7.2,消后7.0;
[0049] 接種重量:10% ;
[0050] 培養(yǎng)溫度:32 Γ;
[0051 ] 擴大培養(yǎng)轉(zhuǎn)速:75~80Hz;
[0052] 通氣量:60 ~80m3/h;
[0053] 壓力：0.045~0.05MPa;
[0054] 溶氧:前期60~75%，中期90~100%，后期75~100% ;
[0055] 培養(yǎng)時間：24~27h;
[0056] 含菌量:4~5 X 109cfu/mL(芽孢率彡 90 % )。
[0057] 實施例2本發(fā)明生物有機肥的制備
[0058] 將拮抗菌L-9培養(yǎng)在在高氏一號液體培養(yǎng)基中，30°C搖床中170rpm培養(yǎng)48h。有機 肥為菜柏酶解的菜柏有機肥與牛糞堆肥以重量比1:1混合而成，經(jīng)測定含有機質(zhì)33.8%、氨 基酸4.3%、N4.20 %、P2〇52.26%、K201.08%。將拮抗菌L-9培養(yǎng)液以5 %的接種重量接入上 述有機肥中，調(diào)節(jié)溫度為30~45°C，含水量為30~40%，發(fā)酵4~5天，期間不斷翻拋。發(fā)酵完 成后含水量達到34.9 %，即為生物有機肥（以下簡稱"ΒΙ0"）。
[0059]實施例3 ΒΙ0在育苗試驗中抗青枯病的作用 [0060] 供試品種:K326和紅花大金元。
[0061 ] 蚓糞育苗基質(zhì)：制備方法見專利ZL200710202167.6。
[0062] 3.1試驗設(shè)計
[0063] 3.1.1 ΒΙ0對煙草發(fā)芽率的影響
[0064]每平板100粒K326種子或紅花大金元種子，基質(zhì)由常規(guī)育苗基質(zhì)添加不同比例的 蚓糞育苗基質(zhì)與ΒΙ0組成，處理見表1.1，約鋪lcm厚，每個處理5次重復(fù)，光照培養(yǎng)箱中25°C、 75 %水份中培養(yǎng)，定期測定出芽率。
[0065]表1.1 ΒΙ0對煙草種子萌發(fā)影響試驗設(shè)計
[0068] 3.1.2 ΒΙ0對煙草苗期生長的影響
[0069] 根據(jù)ΒΙ0對煙草發(fā)芽率影響的結(jié)果，采用對煙草萌發(fā)沒有抑制作用的比例（即蚓糞 育苗基質(zhì)68%、ΒΙ0 2%)施入煙草常規(guī)育苗基質(zhì)。分別采用兩種育苗方法，一種是常規(guī)的漂 浮育苗，另一種考慮到ΒΙ0中拮抗菌的生長繁殖問題，采用黑色塑膠育苗盤在相對于漂浮育 苗比較干旱的條件下育苗，即直接將黑色塑膠育苗盤置于育苗槽中，底部只存蓄lcm左右的 水。試驗處理見表1.2。
[0070] 表1.2 ΒΙ0育苗處理
[0072] 3.1.3盆栽試驗中ΒΙ0對煙苗生長的影響
[0073]按表1.3處理將煙苗移栽于新的育苗基質(zhì)中，每盆10Kg育苗基質(zhì)，每處理12次重 復(fù)。向育苗基質(zhì)中添加一定比例的發(fā)酵好的茄科勞爾氏菌菌懸液、ΒΙ0或菜柏有機肥，使Rs 濃度達到107cfu 基質(zhì)，而BIO和菜柏有機肥分別以每盆50g的比例加入。分別以育苗期對 照基質(zhì)一移栽健康基質(zhì)和育苗期對照基質(zhì)一病原菌基質(zhì)兩個處理作為對照。移栽當天采集 不同基質(zhì)樣品，以后每隔10天采集一次根際基質(zhì)并統(tǒng)計發(fā)病率、用熒光定量PCR方法測定基 質(zhì)樣品中病原菌與拮抗菌的數(shù)量。
[0074] 表1.3 ΒΙ0育苗盆栽處理
[0076] 注前是育苗時的處理。后是移栽后的處理，其中，CK表示空白對照處理，η 表示基質(zhì)育苗處理，Ρ表示盆栽處理;+Rs表示在土壤中加入前科勞爾氏菌;OF指未加入詰抗 菌L-9的有機肥。
[0077] 3.2 結(jié)果：
[0078] 3.2.1 ΒΙ0對煙草發(fā)芽率的影響
[0079] 出芽率檢測結(jié)果見表2.1。與對照相比，當ΒΙ0濃度在2%以內(nèi)時，煙草的發(fā)芽率與 對照相比，無顯著差異;當ΒΙ0濃度高于2%時，發(fā)芽率大大降低。
[0080] 表2.1 ΒΙ0對煙草種子發(fā)芽率的影響
[0082] 3.2.2 ΒΙ0育苗對煙草發(fā)芽率和土傳青枯病發(fā)病率的影響
[0083]煙苗移栽后30天統(tǒng)計盆栽試驗的發(fā)病率詳見表2.2。從表2.2可以看出，K326青枯 病的發(fā)病率普遍較低，因此只考察紅花大金元的基質(zhì)中病原菌與拮抗菌在不同時期的變 化。
[0084]表2.2不同處理對煙草土傳青枯病發(fā)病率的影響
[0086] 從圖3中的30天取樣結(jié)果可以看出，BI02-BI0p+Rs HD(即旱培育苗，育苗和盆栽病 土中都施入ΒΙ0)相對于其它處理，可以將病原菌數(shù)量降到最低。這一結(jié)果可能是由于育苗 期間拮抗菌已經(jīng)定殖在煙苗根際，因此，當盆栽試驗基質(zhì)中有病原菌的存在時，拮抗菌照樣 可以發(fā)揮作用，從一開始就能降低病原菌的數(shù)量，起到保護煙株的作用。
[0087] 從圖4可以看出，拮抗菌在基質(zhì)中也會呈現(xiàn)一種先降后升的趨勢。而相對于傳統(tǒng)的 漂浮育苗，旱培的拮抗菌更易生存，因此在煙苗移栽后其拮抗菌的數(shù)量也是最多的。育苗時 就加入拮抗菌，比在煙苗移栽后加入拮抗菌的處理，拮抗菌可以更快地進入增長階段，由 此保證了拮抗菌在基質(zhì)中的數(shù)量，這樣對于拮抗病原菌就提供了有力的保障。
【主權(quán)項】
1. 一種抗青枯病的詰抗菌，該菌株命名為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei)L-9， 已于2013年09月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No.8264〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株在抗青枯病中的應(yīng)用。3. -種生物有機肥的制備方法，其特征在于:將權(quán)利要求1所述的菌株以5%的接種重 量接入有機肥中發(fā)酵培養(yǎng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述有機肥為菜柏酶解的菜柏有機肥 與牛糞堆肥以重量比1:1混合而成。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫度30~45°C， 含水量30~40 %，時間4~5天，發(fā)酵完成后含水量達到34.9 %。6. 根據(jù)權(quán)利要求3~5任一權(quán)利要求所述方法制備的生物有機肥在抗青枯病中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK105969686SQ201610329907
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】石俊雄, 劉艷霞, 李想, 孟琳, 蔡劉體, 張恒, 鄒焱
【申請人】貴州省煙草科學研究院, 貴州吉龍生態(tài)科技有限公司