本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬?？滤_奇病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱，呈球形，直徑約23～33nm，核衣殼裸露，無包膜和突起；柯薩奇病毒基因組只包含一個(gè)開放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)較長(zhǎng)的多聚蛋白前體。該ORF依次分為P1、P2和P3 3個(gè)區(qū)，其中P1區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4，組成病毒衣殼。P2和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。

柯薩奇病毒是引起兒童手足口病(HFMD)的主要病原體，尤其是3歲以內(nèi)的嬰幼兒，能夠?qū)е缕鋰?yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。引起HFMD的腸道病毒(EVs)主要包括四種類型：EV-A、EV-B、EV-C和EV-D?？滤_奇病毒A6型(CVA6)屬于腸道病毒A組，共16個(gè)亞型，其中亞型A組11個(gè)和B組5個(gè)。根據(jù)基因型的不同，CVA6劃分為A～E五個(gè)分支，E基因型又分為E1和E2基因亞型。自2008年CVA6首次爆發(fā)于芬蘭以來，E2亞型成為世界范圍內(nèi)流行的主要基因型。臨床數(shù)據(jù)表明，相比經(jīng)典的HFMD病例，E2亞型CVA6感染人后往往會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。更重要的是，該病毒感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的皰疹性咽峽炎，甚至引起新生兒的死亡。同時(shí)，該亞型病毒在流行季節(jié)很容易跟其它型腸道病毒混合感染，給疾病的治療和診斷帶來很多困難。

在2010年之前，HFMD主要由EV71和CA16兩種類型腸道病毒引起，關(guān)于CVA6的報(bào)道非常少。近幾年，CVA6在全世界范圍內(nèi)流行，尤其是泛太平洋地區(qū)，包括中國(guó)臺(tái)灣、新加坡、日本和泰國(guó)等，很多地區(qū)CVA6已取代EV71和CA16成為導(dǎo)致HFMD的主要流行株。自2011至2015年，歐洲和北美等其它國(guó)家和地區(qū)流行的腸道病毒也是CVA6。目前，在中國(guó)大陸的很多城市CVA6呈現(xiàn)爆發(fā)式流行，比如深圳、上海和青島等地，其發(fā)病率和死亡率逐年升高。所以，E2型CVA6已逐漸成為在全世界范圍內(nèi)流行且能導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的HFMD病原體。

由于其它型腸道病毒(非EV71和非CA16)所引起的臨床表現(xiàn)輕微，致病性較弱，并未引起人們對(duì)CVA6的關(guān)注。最近的報(bào)告表明，近期流行的E2型CVA6感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)急性并發(fā)癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、和急性弛緩性麻痹等。目前關(guān)于手足口病的發(fā)病機(jī)制還不清楚，特別是CVA6的致病機(jī)理尚未報(bào)道，篩選抗CVA6藥物和疫苗缺乏穩(wěn)定的動(dòng)物感染模型，抗CVA6藥物和疫苗的開發(fā)也受到制約，究其原因缺乏一合適的CVA6感染動(dòng)物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何治療和/或預(yù)防柯薩奇病毒A6型所致疾病。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型的制備方法。

本發(fā)明所提供的柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型的制備方法，包括：將柯薩奇病毒A6型毒株感染動(dòng)物，得到柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型；

所述柯薩奇病毒A6型毒株可為在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No.13393的毒株，該毒株的名稱為WF057R。

上述方法中，所述動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物具體可為小鼠。所述小鼠具體可為ICR小鼠。

上述方法中，所述動(dòng)物可為3-5日齡動(dòng)物。

上述方法中，所述柯薩奇病毒A6型毒株感染所述動(dòng)物的量可為10^5.5TCID₅₀/(3.5-4.5g)。所述柯薩奇病毒A6型毒株感染所述動(dòng)物的量具體可為10^5.5TCID₅₀/4g。

上述方法中，所述將柯薩奇病毒A6型毒株感染動(dòng)物可通過注射的方式進(jìn)行。所述注射可為肌肉注射或腹腔注射。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了利用所述方法制備的柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型在篩選抗柯薩奇病毒A6型藥物和/或疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明篩選了一株具有代表性的CVA6毒株WF057R，利用本發(fā)明的CVA6毒株WF057R還可以構(gòu)建穩(wěn)定且重復(fù)性好的柯薩奇病毒A6型感染動(dòng)物模型，該模型可為下一步進(jìn)行藥物的抗病毒治療和評(píng)估病毒滅活疫苗的免疫保護(hù)效果提供研究工具。

生物材料保藏說明

生物材料的分類命名：柯薩奇病毒A6型(Coxsackievirus)

生物材料的菌株編號(hào)：WF057R

生物材料的保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心

生物材料的保藏單位簡(jiǎn)稱：CGMCC

生物材料的保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101

生物材料的保藏日期：2016年12月26日

生物材料的保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.13393

附圖說明

圖1為不同感染條件組合下接種CVA6毒株WF057R乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化。A-C分別為5日齡乳鼠不同接種劑量和不同接種途徑組合；D-F為不同劑量經(jīng)IM途徑接種3、7、9日齡乳鼠。

圖2為5日齡乳鼠接種CVA6后不同組織內(nèi)病毒載量的變化。A-C的接種劑量均為10^5.5TCID₅₀/只，A為5日齡乳鼠經(jīng)肌肉注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，B為5日齡乳鼠經(jīng)腹腔注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，C為5日齡乳鼠經(jīng)腦內(nèi)注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況；D-F的接種劑量均為10⁷TCID₅₀/只，D為5日齡乳鼠經(jīng)肌肉注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，E為5日齡乳鼠經(jīng)腹腔注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況，F(xiàn)為5日齡乳鼠經(jīng)腦內(nèi)注射感染CVA6病毒后各組織病毒載量隨感染天數(shù)變化情況。其中，log的底數(shù)均為10。

圖3為5日齡乳鼠感染310LD₅₀劑量CVA6后1～5dpi外周血中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化。CVA6代表接毒組，NC代表未接毒組，縱坐標(biāo)的C表示表達(dá)量。

圖4為新生乳鼠感染CVA6毒株WF057R后大腦組織的HE染色和IHC結(jié)果。A:5dpi的HE染色；B:HE陰性對(duì)照；C:5dpi的IHC染色；D：IHC陰性對(duì)照。A和B放大200X，C和D放大400X。

圖5為新生乳鼠感染CVA6毒株WF057R后心臟組織的HE染色和IHC結(jié)果。A:5dpi的HE染色；B:HE陰性對(duì)照；C:5dpi的IHC染色；D：IHC陰性對(duì)照。A～D放大200X。

圖6為新生乳鼠感染CVA6毒株WF057R后肺臟組織的HE染色和IHC結(jié)果。A:5dpi的HE染色；B:HE陰性對(duì)照；C:5dpi的IHC染色；D：IHC陰性對(duì)照。A～D放大200X。

圖7為新生乳鼠感染CVA6毒株WF057R后骨骼肌的HE染色和IHC結(jié)果。A:5dpi的HE染色；B:HE陰性對(duì)照；C:5dpi的IHC染色；D：IHC陰性對(duì)照。A～D放大200X。

圖8為新生乳鼠感染CVA6毒株WF057R后腸道的HE染色和IHC結(jié)果。A:5dpi的HE染色；B:HE陰性對(duì)照；C:5dpi的IHC染色；D：IHC陰性對(duì)照。A～D放大200X。

圖9為CVA6抗血清在體內(nèi)通過被動(dòng)免疫對(duì)乳鼠的保護(hù)作用。

圖10為CVA6滅活全病毒免疫雌鼠母?jìng)骺贵w對(duì)乳鼠的保護(hù)作用。

圖11為CVA6抗血清體內(nèi)對(duì)不同發(fā)病程度乳鼠的治療效果。其中，CVA6表示CVA6對(duì)照組乳鼠。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的RD細(xì)胞(陳國(guó)清，王瑤，許曉慶，邵榮標(biāo).腸道病毒EV71和CVA6分離效果的影響因素分析[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，26(4):4-5.)為人橫紋肌瘤RD細(xì)胞(Rhabdomyoma cell)，由山東省疾病預(yù)防與控制中心病毒性傳染病防制所惠贈(zèng)，經(jīng)山東省疾病預(yù)防與控制中心病毒性傳染病防制所同意后公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的MEM維持液為Gibco產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的乳鼠、雌鼠與成年鼠均為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的SPF級(jí)ICR小鼠。其中，5日齡乳鼠的體重為4±0.5g。

下述實(shí)施例中的柯薩奇病毒的不同地方臨床分離株

WH15066/Shandong/China/2015、DY003R/Shandong/China/2015、DY005R/Shandong/China/2015和LW03R/Shandong/China/2015均為柯薩奇病毒A6型(CVA6)毒株，其中WH15066/Shandong/China/2015的基因組序列為將NCBI中的GenBank號(hào)為KY126092.1的序列中的T替換為U得到的序列，

DY003R/Shandong/China/2015的基因組序列為將NCBI中的GenBank號(hào)為KY126089.1的序列中的T替換為U得到的序列，DY005R/Shandong/China/2015的基因組序列為將NCBI中的GenBank號(hào)為KY126090.1的序列中的T替換為U得到的序列，

LW03R/Shandong/China/2015的基因組序列為將NCBI中的GenBank號(hào)為KY126091.1的序列中的T替換為U得到的序列，公眾可從申請(qǐng)人處獲得這些生物材料，這些生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

實(shí)施例1、柯薩奇病毒A6型(CVA6)毒株WF057R的分離與鑒定

發(fā)明人于2015年從山東省一名手足口患兒糞便中分離得到一柯薩奇病毒A6型(Coxsackievirus)毒株，將該毒株命名為WF057R?？滤_奇病毒A6型(Coxsackievirus)毒株WF057R已于2016年12月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC No.13393。

實(shí)施例2、利用柯薩奇A6病毒毒株WF057R制備CVA6感染動(dòng)物模型

一、WF057R的培養(yǎng)

將RD細(xì)胞接種于培養(yǎng)基1(培養(yǎng)基1為向MEM維持液中添加胎牛血清、青霉素和鏈霉素得到的液體，其中胎牛血清的質(zhì)量百分濃度為10％，青霉素的質(zhì)量百分濃度為1％，鏈霉素的質(zhì)量百分濃度為1％)中，于溫度為37℃、5％濃度CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到RD細(xì)胞培養(yǎng)液。將實(shí)施例1的柯薩奇A6病毒毒株WF057R接種于RD細(xì)胞培養(yǎng)液中的RD細(xì)胞上，至細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)面積超過80％時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，得到CVA6毒株WF057R病毒液，于96孔板通過有限稀釋法進(jìn)行病毒定量，測(cè)定病毒TCID₅₀后分裝于離心管中，保存于-80℃冰箱。

二、CVA6感染動(dòng)物模型的制備

通過肌肉注射(Intramuscular injection，IM)、腹腔注射(Intraperitoneal injection，IP)和顱腔注射(Intracerebral injection，IC)三種不同的感染途徑分別與10⁴、10^5.5、10⁷TCID₅₀/只三種不同的感染劑量相組合，探索建立3日齡乳鼠CVA6感染模型最佳的接種途徑和感染劑量。確定最佳接種途徑后，再經(jīng)此途徑分別與10^5.5和10⁷TCID₅₀/只兩種感染劑量組合探索CVA6對(duì)大日齡(5、7、9日齡)乳鼠的致病情況，最終確定建立CVA6模型的最佳日齡、接種途徑和感染劑量，感染條件組合見表1。利用文獻(xiàn)(Mao Q,Wang Y,Gao R,Shao J,Yao X,Lang S,Wang C,Mao P,Liang Z,Wang J.A neonatal mouse model of coxsackievirus A16for vaccine evaluation.J Virol.2012；86(22):11967-76.)中的方法，依據(jù)Reed&Muench公式計(jì)算5日齡乳鼠的半數(shù)致死量LD₅₀(Reed LJ,Muench H.A simple method of estimating 50percent end-points.Am.J.Hyg.1938,27:493-497.)。乳鼠感染CVA6毒株WF057R后1天(1day post infection，1dpi)～12dpi連續(xù)觀察感染乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化。每組均設(shè)置陰性對(duì)照組(NS)，即以相同的接種途徑注射等體積的生理鹽水。

注:肌肉接種，IM；腹腔接種，IP；顱腔接種，IC；生理鹽水，NS。

臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：為評(píng)價(jià)病毒株對(duì)乳鼠致病的嚴(yán)重程度，對(duì)不同的臨床表現(xiàn)賦予不同的分值，本研究采用常用的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表2)。

表2、臨床標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分

結(jié)果顯示，對(duì)照組相同日齡各小鼠的體重、生存率及臨床得分均無顯著差異。5日齡乳鼠經(jīng)IM、IP和IC感染劑量為10⁴TCID₅₀CVA6毒株WF057R的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對(duì)陰性對(duì)照組未表現(xiàn)出體重下降(圖1中A)，平均臨床評(píng)分均呈現(xiàn)出一過性癥狀(圖1中B，三種接種方式在10-12dpi的臨床得分均為0)，最終生存率分別為30％、50％和100％(圖1中C)，這表明不適合用10⁴TCID₅₀劑量感染5日齡乳鼠來建立CVA6動(dòng)物模型。5日齡乳鼠經(jīng)IM、IP感染劑量為10^5.5TCID₅₀的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對(duì)陰性對(duì)照組表現(xiàn)出顯著下降，9dpi 10^5.5TCID₅₀-IM組和10^5.5TCID₅₀-IP組體重相對(duì)于陰性對(duì)照組體重分別下降了51.47％和22.42％(圖1中A)；10^5.5TCID₅₀-IM組和10^5.5TCID₅₀-IP組約4dpi表現(xiàn)出后肌無力，隨著感染天數(shù)增加依次出現(xiàn)單后肢癱瘓、雙后肢肌癱瘓、瀕死及極小部分乳鼠逐漸恢復(fù)健康等癥狀，而10^5.5TCID₅₀-IC組平均臨床評(píng)分僅表現(xiàn)出一過性后肌無力癥狀(圖1中B)；10^5.5TCID₅₀-IM組、10^5.5TCID₅₀-IP組和10^5.5TCID₅₀-IC組最終生存率分別為0、10％和40％(圖1中C)，這表明經(jīng)IM感染10^5.5TCID₅₀劑量CVA6毒株WF057R較為適合建立5日齡CVA6感染模型。5日齡乳鼠經(jīng)IM、IP和IC感染劑量為10⁷TCID₅₀的實(shí)驗(yàn)組平均體重相對(duì)陰性對(duì)照組出現(xiàn)體重顯著下降，于感染后6dpi～7dpi全部死亡，存活時(shí)間較短，不利于感染模型的建立(圖1中C)。10^5.5TCID₅₀(相當(dāng)于310LD₅₀)經(jīng)IM途徑接種不同日齡(3、7、9)乳鼠后，3日齡乳鼠接種后癥狀明顯，平均臨床評(píng)分5(圖1中E)，存活時(shí)間短，感染后7天全部死亡(圖1中F)；7和9日齡乳鼠由于日齡大的緣故，相比對(duì)照組體重變化小(圖1中D)，死亡率低(圖1中F)，均不適合模型的建立。因此，選擇經(jīng)IM途徑接種5日齡乳鼠、劑量為10^5.5TCID₅₀/只(310LD₅₀)作為建立乳鼠感染模型的條件。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明在該劑量、該途徑條件下接種5日齡乳鼠后臨床癥狀典型，平均臨床得分為5，乳鼠感染后9天全部死亡，個(gè)體的發(fā)病時(shí)間和死亡率穩(wěn)定，有非常高的可重復(fù)性。

三、核酸提取、病毒載量檢測(cè)及病毒變異檢測(cè)

對(duì)于5日齡乳鼠分別接種10^5.5TCID₅₀和10⁷TCID₅₀劑量的乳鼠，感染后1dpi、3dpi、5dpi各組分別處死3只，取腦、心臟、肺臟、脾臟、后肢肌、腸道和血液，充分研磨后取0.01g上述各組織研磨物分別置于1.5mL無菌離心管中，加0.01M PBS至1mL，9000rpm 4℃離心10min，取離心后上清液用TRIzol法提取病毒核酸，檢測(cè)各組織中病毒載量隨時(shí)間的變化，初步判斷CVA6毒株WF057R在體內(nèi)的組織嗜性和載量變化。

TRIzol法提取病毒RNA后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，反轉(zhuǎn)錄在ABI SimpliAmp^TM Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行，使用TAKARA PrimeScript^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，總體積為10μL，其中：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Random 6mers 1μL以及待測(cè)樣本RNA 6.5μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，45min(×1)；85℃，5s(×1)；4℃，∞。通過熒光定量PCR進(jìn)行病毒載量的定量，于ABI 7500FAST熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系總體積為25μL，其中：GoldStarTaqMan Mixture(CW2625M，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)12.5μL；CVA6熒光定量特異性上游引物CVA6-F(25μM)0.625μL；特異性下游引物CVA6-R(25μM)0.625μL；CVA6特異性探針(25μM)0.625μL；RNase-Free water 8.625μL；待測(cè)cDNA模板量2μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃，10min(×1)；95℃，15s(×40)；60℃，1min(×40)，于每個(gè)循環(huán)60℃，1min結(jié)束后檢測(cè)熒光。其中上游引物CVA6-F序列：CCTGAATGCGGCTAATCC；下游引物CVA6-R序列：TTGTCACCATWAGCAGYCA；探針序列：5’FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-3’BHQ1。將利用CVA6-F與CVA6-R對(duì)CVA6毒株WF057R核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物(dsDNA)與T載體構(gòu)建質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍倍比稀釋后備用。每次進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)載體標(biāo)準(zhǔn)品每個(gè)稀釋度均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，取三個(gè)重復(fù)孔Ct值的平均值作為對(duì)應(yīng)稀釋度的最終Ct值。

為研究病毒在感染后不同感染階段和在乳鼠體內(nèi)不同器官內(nèi)的載量分布，采用310LD₅₀劑量(10^5.5TCID₅₀/只)、經(jīng)IM途徑感染5日齡乳鼠，1、3和5dpi檢測(cè)病毒載量，發(fā)現(xiàn)感染后病毒載量在各組織中變化幅度較大?？傮w上呈現(xiàn)1～3dpi時(shí)間段內(nèi)各組織病毒含量迅速升高而5dpi后病毒含量上升速度下降的趨勢(shì)。1dpi血液中病毒核酸含量非常低，但3dpi很快達(dá)到峰值6log(拷貝數(shù)/mL血液)，這一病毒血癥的出現(xiàn)時(shí)間，與乳鼠的臨床表現(xiàn)(包括行為、體重下降等)出現(xiàn)的時(shí)間是相對(duì)應(yīng)的。5dpi心臟和肺臟中病毒含量高達(dá)7～8log(拷貝數(shù)/mg組織)，病毒的高含量導(dǎo)致肺臟出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒性肺炎。骨骼肌(后肢肌)中病毒含量最高達(dá)到10log(拷貝數(shù)/mg組織)，是各時(shí)間點(diǎn)其它組織器官中病毒含量的10²～10⁴倍，表明骨骼肌是乳鼠體內(nèi)病毒復(fù)制最為活躍的部位，也表明病毒經(jīng)肌肉途徑進(jìn)入血液系統(tǒng)，通過血液流動(dòng)迅速遍布全身。不同接種途徑后肢肌中病毒含量最高，說明WF057R株有強(qiáng)烈的肌肉組織嗜性，也說明肌肉是病毒主要復(fù)制的場(chǎng)所(圖2中A～C)。在均經(jīng)IM途徑感染10⁴LD₅₀劑量(10⁷TCID₅₀/只)后，1～5dpi病毒在各組織中含量變化趨勢(shì)與感染劑量310LD₅₀劑量(10^5.5TCID₅₀/只)變化趨勢(shì)相似，但高劑量病毒接種后腦、血液、肺臟、脾臟中病毒載量顯著升高(P<0.05)，而IP和IC感染途徑病毒載量與低劑量接種變化不顯著(圖2)。圖2中，log的底數(shù)均為10；當(dāng)樣本為血液時(shí)，log(拷貝數(shù)/mL)表示log(拷貝數(shù)/mL血液)；當(dāng)樣本為其他組織時(shí)，log(拷貝數(shù)/mL)表示log(拷貝數(shù)/mg組織)。

另外，為檢測(cè)病毒感染5日齡乳鼠后在其體內(nèi)是否會(huì)發(fā)生基因突變，PCR擴(kuò)增CVA6毒株WF057R感染乳鼠1、3和5dpi各組織中CVA6病毒完整VP1片段，產(chǎn)物回收后測(cè)序，通過Mega 5.05軟件進(jìn)行序列比對(duì)，檢測(cè)核苷酸及氨基酸序列是否發(fā)生突變。擴(kuò)增VP1基因上游引物VP1-F為：5’-GGAGATAGGGTGGCAGATGT-3’；下游引物VP1-R為：5’-AAGGGTGGTGATCGATGTGC-3’。結(jié)果顯示，各組織中病毒的序列均未發(fā)生變化。

四、感染模型血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平變化情況

5日齡乳鼠經(jīng)IM感染310LD₅₀(10^5.5TCID₅₀/只)CVA6毒株WF057R后采集1～5dpi外周血漿，通過細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)檢測(cè)不同感染階段乳鼠模型血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和IL-18表達(dá)量的變化，以了解上述炎性細(xì)胞因子在重癥CVA6感染階段發(fā)揮免疫病理?yè)p傷的作用。各細(xì)胞因子的檢測(cè)下限分別為：IFN-γ(1.74pg/ml)、TNF-α(1.63pg/ml)、IL-1β(1.03pg/ml)、IL-4(0.22pg/ml)、IL-6(1.17pg/ml),IL-10(1.17pg/ml),IL-13(1.17pg/ml),IL-18(0.21pg/ml)。

研究表明，CVA6毒株WF057R感染初期外周血中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-13和IL-18(2dpi和3dpi除外)表達(dá)量相對(duì)于陰性對(duì)照組均有不同程度的高表達(dá)(圖3)。其中，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6表現(xiàn)出與人類相似的表達(dá)趨勢(shì)(Han J,Wang Y,Gan X,Song J,Sun P,Dong XP.Serum cytokine profiles of children with human enterovirus 71-associated hand,foot,and mouth disease.J Med Virol.2014.；Lin TY,Chang LY,Huang YC,et al.Different proinflammatory reactions in fatal and non-fatal enterovirus 71infections:implications for early recognition and therapy.Acta Paediatr.2002；91:632-5.)，呈現(xiàn)爆發(fā)性增高，峰值超過2000pg/ml，且均呈現(xiàn)隨感染天數(shù)的增加先升高后降低的現(xiàn)象。IL-10表達(dá)量在感染初期(2dpi)即上升到最高40.13pg/ml，繼而呈現(xiàn)平穩(wěn)降低的趨勢(shì)；同樣，IL-13表達(dá)量在感染初期高水平表達(dá)，但隨著感染天數(shù)增加表達(dá)量快速降低。感染后期(5dpi)，TNF-α表達(dá)量逐漸增高，達(dá)到102pg/ml；IL-18在整個(gè)感染階段表達(dá)量相對(duì)于陰性對(duì)照無顯著差異(p>0.05)；IL-1β和IL-4自始至終均無可檢測(cè)的含量表達(dá)。以上數(shù)據(jù)說明，CVA6毒株WF057R感染乳鼠后誘導(dǎo)了細(xì)胞因子——IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-10和IL-13的表達(dá)，誘發(fā)乳鼠的免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)，IFN-γ和IL-6可能是CVA6乳鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要誘發(fā)因素，并且細(xì)胞因子TNF-α、IL-10和IL-13可能也在CVA6毒株WF057R感染的免疫病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用。

五、病理學(xué)檢查(HE)及免疫組織化學(xué)檢查(IHC)

在最終確定建立CVA6感染模型最佳組合條件后，以此條件(IM途徑接種5日齡乳鼠、劑量為10^5.5TCID₅₀/只(310LD₅₀))建立乳鼠CVA6感染模型，1～5dpi內(nèi)每天處死3只WF057R感染乳鼠，取其腦、心臟、肺臟、脾臟、后肢肌、腸道和血液；血液常溫10,000rpm離心10min后，取上層血漿保存于-20℃；其余臟器10％中性福爾馬林固定48h后經(jīng)石蠟包埋制作石蠟切片用以進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)。對(duì)于免疫組化檢測(cè)，石蠟切片經(jīng)過60℃烤片1h、酒精梯度脫蠟、EDTA抗原修復(fù)、脫水，一抗CVA6多克隆抗體(1：200稀釋)4℃孵育過夜，加二抗(1：1000稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育30min后滴加DAB顯色，蘇木素反藍(lán)。陰性對(duì)照組切片一抗采用陰性血清。顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果。其中，一抗CVA6多克隆抗體為利用CVA6的VP1蛋白兩次免疫8周齡ICR成年鼠得到的多克隆抗體。

通過HE染色對(duì)經(jīng)肌肉注射感染CVA6毒株WF057R的5日齡乳鼠的腦、心、肺臟、后肢肌和腸道進(jìn)行病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)感染晚期，出現(xiàn)了全身多臟器的損傷和炎癥反應(yīng)。

1)腦：病理學(xué)檢查顯示腦局部發(fā)生明顯的病理變化，腦在3dpi開始出現(xiàn)局部腦膜及腦實(shí)質(zhì)水腫(圖1中A箭頭所示)。腦免疫組化發(fā)現(xiàn)自3dpi開始腦皮質(zhì)出現(xiàn)大量病毒抗原，隨著感染天數(shù)的增長(zhǎng)病毒抗原彌漫分布于腦皮質(zhì)(圖4中C)，陰性對(duì)照組腦組織切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖4中B)和抗原染色(圖4中D)。

2)心臟：HE染色發(fā)現(xiàn)乳鼠感染CVA6 5dpi心臟局部便出現(xiàn)血管擴(kuò)張充血，局部淋巴浸潤(rùn)，心臟局部出現(xiàn)間質(zhì)水腫，心肌纖維溶解，局部伴脂肪變性及毛細(xì)血管滲漏，并可見紅細(xì)胞缺氧表現(xiàn)(圖5中A箭頭所示)。而免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)CVA6抗原于心臟呈彌漫性分布(圖5中C)，陰性對(duì)照組心臟切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖5中B)和特異性抗原染色(圖5中D)。

3)肺臟：HE染色發(fā)現(xiàn)CVA6感染會(huì)導(dǎo)致乳鼠發(fā)生病毒性肺炎，表現(xiàn)為彌漫性肺實(shí)質(zhì)、肺泡和間質(zhì)纖維化及大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡萎縮、塌陷(圖6中A箭頭所示)。免疫組化發(fā)現(xiàn)CVA6抗原彌漫性分布與整個(gè)肺臟(圖6中C)，陰性對(duì)照組肺臟切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖6中B)和特異性抗原染色(圖6中D)。

4)骨骼肌：HE染色顯示乳鼠感染CVA6 3dpi骨骼肌出現(xiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、局部間質(zhì)水腫和少量纖維組織增生，隨著感染天數(shù)增加后肢肌出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫及纖維組織增生范圍擴(kuò)大，并且開始出現(xiàn)局部壞死和肌束斷裂(圖7中A箭頭所示)。免疫組化顯示相對(duì)于陰性對(duì)照組(圖7中D)CVA6感染后3dpi后肢肌病毒開始增多且以點(diǎn)狀分布為主，隨感染天數(shù)的增加CVA6在后肢肌程彌漫性分布(圖7中C)，陰性對(duì)照組后肢肌切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖7中B)。

5)腸道：HE染色發(fā)現(xiàn)乳鼠經(jīng)肌肉注射感染CVA6 3dpi腸道開始出現(xiàn)間質(zhì)水腫，隨著感染天數(shù)的增加出現(xiàn)充血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖8中A箭頭所示)，但未發(fā)現(xiàn)腸道壞死。免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肌肉注射CVA6在感染后期彌漫性分布于腸粘膜及腸絨毛(圖8中C)，陰性對(duì)照組腸道切片并未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化(圖8中B)和特異性抗原染色(圖8中D)。

六、其他毒株的致病性

按照步驟一的方法，將柯薩奇A6病毒毒株WF057R與原始毒株KM114057病毒、KP144344病毒和KJ541157病毒分別接種RD細(xì)胞，接種量均為500TCID₅₀，制備CVA6不同毒株的病毒液。

其中，KM114057病毒為含有序列A所示RNA的柯薩奇病毒A6型，序列A為將NCBI中KM114057.1(Genebank號(hào))中的T替換為U得到的序列；KP144344病毒為含有序列B所示RNA的柯薩奇病毒A6型，序列B為將NCBI中KP144344.1(Genebank號(hào))中的T替換為U得到的序列；KJ541157病毒為含有序列C所示RNA的柯薩奇病毒A6型，序列C為將NCBI中KJ541157.1(Genebank號(hào))中的T替換為U得到的序列。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分別感染這KM114057、KP144344和KJ541157病毒(500TCID₅₀)后產(chǎn)生CPE的時(shí)間要長(zhǎng)于毒株WF057R，感染后48小時(shí)細(xì)胞上清中病毒滴度分別為8.2×10⁷、2.7×10⁸和3.6×10⁸TCID₅₀/ml，低于同時(shí)期毒株WF057R病毒滴度1.8×10⁹TCID₅₀/ml，所以該三毒株對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性低于毒株WF057R。

按照步驟二中CVA6感染動(dòng)物模型的制備方法，將柯薩奇A6病毒毒株WF057R分別替換為原始毒株KM114057病毒、KP144344病毒和KJ541157病毒，通過IM途徑注射10^5.5TCID₅₀劑量的毒株制備CVA6感染動(dòng)物模型。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過IM途徑分別將10^5.5TCID₅₀劑量的三株病毒感染5日齡乳鼠，感染后9天乳鼠的死亡率分別為80％、80％和100％。綜合比較病毒的致病性，毒株WF057R在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中要優(yōu)于KM114057、KP144344和KJ541157病毒。

實(shí)施例3、以滅活WF057R作為活性的CVA6疫苗所產(chǎn)生抗血清可以保護(hù)小鼠和治療CVA6所致疾病

1、滅活CVA6疫苗的制備

將實(shí)施例2的稀釋后的CVA6毒株WF057R病毒液(10⁵TCID₅₀/ml)按1:4000(V/V)的比例利用福爾馬林稀釋后得到病毒稀釋液，將病毒稀釋液于37℃孵育滅活病毒72小時(shí)，得到滅活病毒液；將滅活病毒液與完全弗氏佐劑等體積混合，制成完全乳化液，即為CVA6疫苗，CVA6疫苗中滅活病毒的含量為5×10⁴TCID₅₀/ml。采用微量滴定法檢測(cè)CVA6疫苗感染性滴度以觀察其滅活效果。

病毒微量滴定法：每孔按1×10⁴細(xì)胞/100μl培養(yǎng)液(該培養(yǎng)液中的細(xì)胞為RD細(xì)胞，培養(yǎng)基為實(shí)施例2的培養(yǎng)基1)將RD細(xì)胞接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞長(zhǎng)至每孔的90％以上，將上述CVA6疫苗用含2％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基按10倍體積梯度稀釋后(稀釋倍數(shù)分別為10倍、10²倍、10³倍和10⁴倍)，以100μl/孔接種于RD細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，每天觀察記錄細(xì)胞病變。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種不同稀釋度CVA6疫苗的RD細(xì)胞均未發(fā)生細(xì)胞病變，表明，上述CVA6疫苗中的WF057R均已滅活。

2、CVA6疫苗菌檢

將步驟1的CVA6疫苗在無菌條件下分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃溫箱培養(yǎng)2天后觀察，發(fā)現(xiàn)均無細(xì)菌生長(zhǎng)，菌檢均為陰性。

3、CVA6疫苗安全性試驗(yàn)

3.1成年鼠安全性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)試驗(yàn)的具體步驟如下：

取8周齡健康成年鼠(雌雄隨機(jī))20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組乳鼠經(jīng)皮下注射步驟1的CVA6疫苗，共注射三次，每?jī)纱巫⑸溟g隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為200μl/只；對(duì)照組注射完全弗氏佐劑與PBS等體積混合得到的混合液，共注射三次，每?jī)纱巫⑸溟g隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為200μl/只。連續(xù)觀察14天，觀察成年鼠有無發(fā)病、死亡和體重變化。

經(jīng)8周齡成年鼠安全性試驗(yàn)結(jié)果可見，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組成年鼠分別經(jīng)皮下1、2和3次不同免疫次數(shù)注射CVA6疫苗，與對(duì)照組成年鼠體重?zé)o差異，均無發(fā)病、死亡，處死后均無肉眼可見病變。

3.2乳鼠安全性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)試驗(yàn)的具體步驟如下：

取5日齡齡健康乳鼠(雌雄隨機(jī))20只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組乳鼠經(jīng)皮下注射步驟1的CVA6疫苗，共注射三次，每?jī)纱巫⑸溟g隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為50μl/只；對(duì)照組注射完全弗氏佐劑與PBS等體積混合得到的混合液(請(qǐng)核實(shí)對(duì)照組注射的液體)，共注射三次，每?jī)纱巫⑸溟g隔時(shí)間均為1周，三次接種量均為50μl/只。連續(xù)觀察14天，觀察乳鼠有無發(fā)病、死亡和體重變化。

經(jīng)5日齡乳鼠安全性試驗(yàn)結(jié)果可見，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)組新生乳鼠分別經(jīng)皮下1、2和3次不同免疫次數(shù)注射CVA6疫苗，與對(duì)照組乳鼠體重?zé)o差異，均無發(fā)病、死亡，處死后均無肉眼可見病變。

4、抗病毒血清的制備及效價(jià)測(cè)定

4.1CVA6抗血清的制備

取8周齡健康成年鼠(雌雄隨機(jī))，經(jīng)皮下注射步驟1的CVA6疫苗，注射量為200μl/只；CVA6疫苗注射35天后采集血液，10,000rpm/min離心后取上清，即為CVA6抗血清，無菌條件下分裝，凍存于-80℃?zhèn)溆?。采用微量中和?shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清的抗體滴度。

4.2微量細(xì)胞中和試驗(yàn)

將步驟4.1的CVA6抗血清利用含2％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基從1:100起開始進(jìn)行2倍梯度體積稀釋，共10個(gè)稀釋度，稀釋比例分別為1:10²、1:2×10²、1:2²×10²、1:2³×10²、1:2⁴×10²、1:2⁵×10²、1:2⁶×10²、1:2⁷×10²、1:2⁸×10²和1:2⁹×10²，得到不同稀釋度的CVA6抗血清稀釋液。

將實(shí)施例2的CVA6毒株WF057R病毒液(500TCID₅₀/ml)加至96孔板，50μl/孔，再分別加入上述不同稀釋度的CVA6抗血清稀釋液，50μl/孔，每孔一個(gè)稀釋度的稀釋液，每種稀釋度的稀釋液三個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1h；向每孔中接種RD細(xì)胞培養(yǎng)液(濃度為2×10⁵個(gè)/ml)，100μl/孔，37℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變情況(CPE)，采用Reed-Muench法計(jì)算中和抗體效價(jià)。

按照上述微量細(xì)胞中和試驗(yàn)方法對(duì)CVA6抗血清的中和效價(jià)連續(xù)檢測(cè)6次，計(jì)算平均提取方差值A(chǔ)VE及變異系數(shù)CV，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

在體外培養(yǎng)的RD細(xì)胞上對(duì)CVA6抗血清進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，加入CVA6毒株WF057R，通過RD細(xì)胞的病變計(jì)算得到CVA6抗血清的抗體效價(jià)為1,024(AVE>0.5，CV≤8％)。

5、CVA6抗血清通過被動(dòng)免疫對(duì)乳鼠的保護(hù)

為研究CVA6抗血清在乳鼠的被動(dòng)免疫保護(hù)作用，將步驟4.1的CVA6抗血清利用生理鹽水進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋(1:10,1:100,1:1,000和1:10,000)，將得到的不同CVA6抗血清稀釋液通過靜脈注射的方式接種到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組5日齡乳鼠(每組10只)體內(nèi)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組注射一種稀釋梯度的CVA6抗血清稀釋液，1個(gè)陰性對(duì)照組乳鼠(CVA6，10只)注射等體積的分離自未接種CVA6健康成年鼠的陰性對(duì)照血清，注射體積均為50μl，1h后將致死劑量310LD₅₀(10^5.5TCID₅₀)的CVA6病毒毒株WF057R通過肌肉途徑感染各組乳鼠，感染后1天(1days post infection，1dpi)至12dpi連續(xù)觀察感染乳鼠的臨床表現(xiàn)、體重變化及生存率變化情況，采用表2的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，將正常健康的5日齡乳鼠作為對(duì)照(NC)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)組乳鼠的生存率，計(jì)算CVA6抗血清在乳鼠體內(nèi)的50％有效稀釋度ED₅₀I。

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組先接種不同稀釋度的抗體后再感染致死劑量的WF057R，發(fā)現(xiàn)1:10稀釋的CVA6抗血清能提供完全的保護(hù)能力，部分乳鼠出現(xiàn)輕微臨床癥狀，評(píng)分為1(圖9，四舍五入)，很快恢復(fù)健康；注射1:100稀釋的CVA6抗血清的實(shí)驗(yàn)組乳鼠臨床評(píng)分最高為3，最終生存率為60％；注射1:1000稀釋的CVA6抗血清的實(shí)驗(yàn)組乳鼠在接種病毒后3天開始出現(xiàn)臨床癥狀，感染后10天評(píng)分為5，第11天全部死亡；與陰性對(duì)照組(圖9中CVA6曲線)相比，1:10,000稀釋的CVA6抗血清幾乎無保護(hù)作用，乳鼠接種病毒后第10天全部死亡(圖9)。1:10稀釋的CVA6抗血清能提供乳鼠100％的保護(hù)力，根據(jù)Reed&Muench公式(Reed and Muench,1938)計(jì)算得到163倍稀釋的CVA6抗血清能提供50％的保護(hù)率，所以CVA6抗血清在乳鼠體內(nèi)預(yù)防作用的ED₅₀I為1.63。

6、母源抗體對(duì)乳鼠的保護(hù)作用

為研究母?jìng)骺贵w對(duì)新生乳鼠的免疫保護(hù)作用，對(duì)8周齡雌鼠皮下多點(diǎn)、多次注射步驟1的CVA6疫苗200μl進(jìn)行第一次免疫，間隔2周后同樣的方式注射步驟1的滅活病毒液與不完全弗氏佐劑等體積混合得到的完全乳化液200μl以加強(qiáng)免疫。第一次免疫后將雌乳鼠和雄乳鼠交配，第二次免疫后5～10天幼鼠出生。選取5日齡乳鼠分5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(10只/組)。

另選取8周齡雌鼠，按照上述方法，將CVA6疫苗與完全乳化液均替換為生理鹽水，對(duì)雌鼠注射生理鹽水，將其孕育的5日齡乳鼠分5個(gè)對(duì)照組(10只/組)。

將各組乳鼠分別經(jīng)IM途徑注射致死劑量的310LD₅₀(10^5.5TCID₅₀)的CVA6病毒毒株WF057R和不同地方臨床CVA6分離株WH15066/Shandong/China/2015(300LD₅₀)、DY003R/Shandong/China/2015(300LD₅₀)、DY005R/Shandong/China/2015(300LD₅₀)和LW03R/Shandong/China/2015(300LD₅₀)，每個(gè)毒株的注射劑量均為310LD₅₀，連續(xù)觀察12d并記錄其體重變化、臨床評(píng)分(采用表2的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分)、生存率，以評(píng)價(jià)CVA6母?jìng)骺贵w對(duì)新生乳鼠感染CVA6的保護(hù)作用。采用Mantel-Cox log-rank法比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠的生存率。

未免疫母鼠組孕育的乳鼠在接種病毒后體重幾乎沒有增加，臨床癥狀明顯，第6天開始死亡，第9～10天全部死亡。免疫WF057R滅活疫苗的實(shí)驗(yàn)組母鼠孕育的乳鼠接種不同的臨床分離株CVA6(WF057R、WH15066、DY003R、DY005R和LW03R)后均無臨床癥狀出現(xiàn)(圖10中左圖)，其體重變化與未接毒組乳鼠無差異(P>0.05)，最終生存率均為100％(圖10中右圖)。數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明利用WF057R毒株制備的CVA6疫苗的母?jìng)骺贵w能提供乳鼠對(duì)致死劑量不同地方分離毒株CVA6的完全保護(hù)能力。

7、抗血清對(duì)發(fā)病乳鼠的臨床治療效果

為研究CVA6抗血清對(duì)不同發(fā)病程度乳鼠的臨床治療效果，首先采用IM途徑對(duì)5日齡乳鼠接種致死劑量310LD₅₀(10^5.5TCID₅₀)的CVA6病毒毒株WF057R，隔離飼養(yǎng)，具體操作同實(shí)施例2中CVA6感染動(dòng)物模型的制備。于感染后4天開始對(duì)感染乳鼠進(jìn)行篩選，選擇臨床得分別為1～2和≥3的乳鼠分別作為發(fā)病早期和晚期2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n＝10只/組)。采用靜脈注射的方式將利用生理鹽水按照1:1、1:10和1:50的體積比稀釋的步驟4.1的CVA6抗血清分別注射到3個(gè)不同發(fā)病程度的實(shí)驗(yàn)組乳鼠體內(nèi)，注射體積均為50μl，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均注射不同稀釋度的CVA6抗血清，每組中一種稀釋度的CVA6抗血清注射10只乳鼠，1個(gè)CVA6對(duì)照組乳鼠(僅接種CVA6，未注射抗血清，10只)注射等體積的陰性對(duì)照血清(分離自未接種CVA6健康成年鼠)作為對(duì)照，連續(xù)觀察12d并記錄其體重變化、臨床癥狀和生存率，以評(píng)價(jià)CVA6抗血清對(duì)發(fā)病乳鼠的臨床治療效果。將正常健康的5日齡乳鼠注射等體積的生理鹽水(NS)作為對(duì)照。依據(jù)實(shí)驗(yàn)組乳鼠的生存率，計(jì)算步驟4.1的CVA6抗血清在乳鼠體內(nèi)治療作用的50％有效稀釋度ED₅₀II。采用Mantel-Cox log-rank法比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠的生存率。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臨床得分1～2的乳鼠(發(fā)病早期)緊急注射抗體后臨床癥狀逐漸消失，評(píng)分降為0(圖11)，體重增加，1:1、1:10和1:50稀釋度的實(shí)驗(yàn)組最終生存率為分別為100％、100％和40％(圖11)。但臨床得分超過3(發(fā)病晚期，即出現(xiàn)單后肢或雙后肢癱瘓甚至瀕死)的乳鼠各稀釋度的CVA6抗血清對(duì)其都沒有任何保護(hù)作用，和發(fā)病后注射陰性血清組(CVA6組)差異不顯著(P>0.05)，死亡率均為100％(圖11)。根據(jù)Reed&Muench公式計(jì)算得到43倍稀釋的CVA6抗血清能提供50％的治愈率，所以CVA6抗血清在乳鼠體內(nèi)治療作用的半數(shù)有效量ED₅₀II為23.81。數(shù)據(jù)表明，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀即后肢(單、雙后肢)癱瘓的乳鼠各稀釋度的CVA6抗血清對(duì)其均沒有任何保護(hù)作用。結(jié)合上面建立的乳鼠感染模型，評(píng)分超過3的乳鼠呈現(xiàn)全身多臟器的嚴(yán)重?fù)p傷和炎癥反應(yīng)，神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)被破壞，大量神經(jīng)元壞死，被吞噬細(xì)胞吞噬；后肢肌中病毒的含量高達(dá)10log，開始出現(xiàn)骨骼肌纖維壞死和肌束斷裂。所以，此時(shí)CVA6抗血清中的CVA6抗體很難逆轉(zhuǎn)乳鼠的重癥發(fā)展，而對(duì)于發(fā)病初期的乳鼠，相比注射陰性血清組抗體的治療效果非常顯著(P<0.005)，治療后逐漸恢復(fù)健康。

8、其他CVA6病毒疫苗的效果

按照步驟1滅活CVA6疫苗的制備方法，將柯薩奇A6病毒毒株WF057R分別替換為實(shí)施例1的KM114057病毒、KP144344病毒和KJ541157病毒，其他步驟均不變，制備CVA6疫苗，即KM114057病毒疫苗、KP144344病毒疫苗和KJ541157病毒疫苗。

將KM114057病毒疫苗、KP144344病毒疫苗和KJ541157病毒疫苗三種疫苗分別按照步驟4的方法經(jīng)皮下接種8周齡成年鼠后35天采集血清，通過微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其抗體滴度分別為256、512和512(連續(xù)檢測(cè)6次)，低于毒株WF057R抗體滴度(1024)。

按扎偶步驟6的方法，分別利用KM114057病毒疫苗、KP144344病毒疫苗和KJ541157病毒疫苗三種疫苗免疫8周齡雌鼠，將其生產(chǎn)的5日齡乳鼠經(jīng)IM途徑注射致死劑量的310LD₅₀(10^5.5TCID₅₀)的CVA6病毒毒株WF057R，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種疫苗誘導(dǎo)母?jìng)骺贵w對(duì)乳鼠致死劑量(310LD₅₀)WF057R的保護(hù)率為70～80％(死亡率為20％～30％)，不能提供完全的保護(hù)。

基于前面工作基礎(chǔ)，發(fā)明人在本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)疫苗免疫組的乳鼠做了全面的病理學(xué)檢查，尤其注意是否存在疫苗免疫動(dòng)物在病毒攻擊后所出現(xiàn)的免疫病理?yè)p傷。觀察結(jié)果表明，疫苗免疫成年鼠和乳鼠在病毒感染后的不同時(shí)間點(diǎn)處，均未發(fā)現(xiàn)主要臟器病理組織學(xué)的明顯改變，僅在后肢肌見到極個(gè)別的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)點(diǎn)。這些極少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)點(diǎn)的病理學(xué)現(xiàn)象經(jīng)多重分析后，可以認(rèn)為其是非特異的病理現(xiàn)象。同時(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)和主要組織中均未見到特征性的病理改變，各組織中也幾乎檢測(cè)不到病毒核酸的存在?？梢源_認(rèn)，在疫苗免疫母鼠后所形成的免疫保護(hù)效應(yīng)，是可以完全抑制病毒在動(dòng)物體內(nèi)的增殖，并最終可以完全保護(hù)機(jī)體免受病毒感染所引起的病理?yè)p害。