本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種人YBX1蛋白穩(wěn)定表達(dá)的SMCC-7721細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

Y-box結(jié)合蛋白(Y-box binding protein)是一類特異性結(jié)合目的基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子內(nèi)部Y-box序列(CTGATTGGCCAA)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于從細(xì)菌到人類的許多物種中。YBX1是Y-box結(jié)合蛋白家族的成員之一，分子量為35kD，該基因定位于染色體上1p34。YBX1蛋白從結(jié)構(gòu)上分為三部分：N端結(jié)構(gòu)域、冷激結(jié)構(gòu)域(Cold Shock Domain，CSD)和C端結(jié)構(gòu)域。其中N端結(jié)構(gòu)域的序列在不同物種間變化較大，而CSD中氨基酸殘基序列表現(xiàn)出高度的進(jìn)化保守性，并直接參與識(shí)別和結(jié)合DNA Y-box序列的過程，C端結(jié)構(gòu)域的序列則具有酸性和堿性氨基酸殘基富集區(qū)交替出現(xiàn)的特點(diǎn)。近些年的研究表明，YBX1與腫瘤的發(fā)生和維持存在廣泛密切的聯(lián)系，發(fā)揮多種重要的生理功能。

研究發(fā)現(xiàn)，YBX1不僅可以與DNA結(jié)合，還可以與mRNA相互作用形成復(fù)合體，或抑制其編碼蛋白的翻譯，或維持mRNA穩(wěn)定性，或參與mRNA的選擇性剪切。YBX1與人類惡性腫瘤關(guān)系非常密切，在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)YBX1異常表達(dá)，并與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈高度相關(guān)性。研究表明，過度表達(dá)的YBX1可以通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclinA和cyclinB來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而抑制YBX1活性能有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。Lasham等研究證實(shí)，YBX1通過下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)量或提高抗凋亡蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路功能異常，致使癌細(xì)胞擁有更強(qiáng)的存活力。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，YBX1可以作為轉(zhuǎn)錄因子參與腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過程，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性等生物學(xué)功能，但其作用機(jī)制尚不清楚。2015年，El Naggar等在《Cancer Cell》報(bào)道，YBX1通過直接與HIF1A轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合來上調(diào)HIF1а蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肉瘤轉(zhuǎn)移。

肝癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率很高，嚴(yán)重危害國(guó)民的身體健康。對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的研究是腫瘤生物學(xué)研究的重要課題。目前關(guān)于YBX1功能研究主要發(fā)生在乳腺癌的增殖、遷移和表皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT)等方面，而對(duì)YBX1蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制報(bào)道很少，尤其是YBX1對(duì)肝癌能量代謝途徑的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明通過慢病毒轉(zhuǎn)染方法獲得YBX1穩(wěn)定表達(dá)的SMCC-7721肝癌細(xì)胞株，為研究YBX1在肝癌中的調(diào)控機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定表達(dá)人YBX1蛋白的SMCC-7721細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，該細(xì)胞株可用于研究YBX1在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制與腫瘤能量代謝提供有力工具。

本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定表達(dá)人YBX1蛋白的SMCC-7721穩(wěn)定細(xì)胞系，是以肝癌細(xì)胞系SMCC-7721細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，感染表達(dá)YBX1基因的慢病毒培養(yǎng)液，經(jīng)過Puromycin藥物篩選陽性細(xì)胞、細(xì)胞增殖后獲得高效表達(dá)YBX1蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。與對(duì)照細(xì)胞相比，該陽性細(xì)胞系YBX1基因和蛋白表達(dá)量顯著提高。通過tGFP融合基因表達(dá)的綠色熒光蛋白可以指示YBX1的細(xì)胞定位和表達(dá)水平。

本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定表達(dá)人YBX1蛋白的SMCC-7721細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其慢病毒表達(dá)載體pGIPZ-YBX1-tGFP構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，以人正常乳腺癌細(xì)胞(HMLE)cDNA為模板擴(kuò)增YBX1全長(zhǎng)基因序列。PCR引物序列為：

YBX1Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)將擴(kuò)增的人YBX1全長(zhǎng)基因序列克隆到T載體中，構(gòu)建成T-YBX1重組載體。

(3)利用多重PCR方法，分別以T-YBX1載體為模板擴(kuò)增YBX1基因，以pGIPZ載體為模板擴(kuò)增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下(括號(hào)中表示酶切位點(diǎn)或接頭序列，下劃線表示基因名稱)：

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'CMV：5'-GGTGGCAGATCCTCTAGTAGAG-3'

5'(CMV)-YBX1：5'-AGAGGATCTGCCACCATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

3'YBX1-(GFP)：5'-TCCATACCTCCAGCTCCCTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

5'tGFP：5'-GGAGCTGGAGGTATGGAGAGCGACGAGAGCG-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(4)將上述PCR產(chǎn)物純化后、混合在一起作為模板，利用下列引物擴(kuò)增CMV-YBX1-tGFP融合基因。PCR引物序列如下，其中5'端引物帶有Xba I位點(diǎn)，3'端引物帶有Not I位點(diǎn)：

5'(Xba I)-CMV：GTTCTAGACGTATTACCGCCA

3'tGFP-(Not I)：TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC

(5)將上述PCR產(chǎn)物克隆到pCR4-Blunt載體上，包括如下步驟：將PCR產(chǎn)物純化后，進(jìn)行Xba I和Not I雙酶切，然后切膠回收；將pCR4-Blunt載體同樣進(jìn)行Xba I和Not I雙酶切，切膠回收；將CMV-YBX1-tGFP基因連接到pCR4-Blunt載體上，構(gòu)建pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP重組載體，送測(cè)序鑒定。

(6)將上述CMV-YBX1-tGFP基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pGIPZ上，包括如下步驟：利用Xba I和Not I雙酶切pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP載體，切膠回收CMV-YBX1-tGFP基因；利用Xba I和Not I雙酶切pGIPZ載體，切膠回收線性載體；將上述獲得的CMV-YBX1-tGFP基因連接到pGIPZ線性載體中，最終獲得表達(dá)YBX1基因的慢病毒表達(dá)載體pGIPZ-YBX1-tGFP。

本發(fā)明提供的一種穩(wěn)定表達(dá)人YBX1蛋白的SMCC-7721細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其中YBX1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)將pGIPZ-YBX1-tGFP重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG按照質(zhì)量比例10：9：1共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，獲得含有表達(dá)YBX1病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液。

(2)收集上述步驟獲得的含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用0.45μm低吸附無菌濾膜過濾并收集濾液，將病毒濾液添加到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SMCC-7721細(xì) 胞培養(yǎng)皿中；共培養(yǎng)24小時(shí)后，除去病毒培養(yǎng)液、更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液；培養(yǎng)48～72小時(shí)后，添加終濃度為2μg/ml的Puromycin篩選陽性細(xì)胞系，連續(xù)篩選4周以上，可以獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；如果需要篩選陽性單克隆細(xì)胞系，則將陽性細(xì)胞簇按照1cell/孔梯度稀釋，然后接種到96孔板中進(jìn)一步篩選。

(3)將上述步驟獲得的陽性細(xì)胞系采用細(xì)胞倒置熒光顯微鏡觀察、RT-qPCR和Western Blot方法鑒定YBX1基因以及蛋白的表達(dá)，證明YBX1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

所述的穩(wěn)定表達(dá)YBX1蛋白的SMCC-7721細(xì)胞系，可用于研究YBX1蛋白在腫瘤尤其是肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及YBX1蛋白與能量代謝調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)功能研究。

附圖說明

圖1：pGIPZ-YBX1-tGFP重組質(zhì)粒的酶切圖。其中M表示λ-Hind Ⅲdigest，泳道1表示重組質(zhì)粒，泳道2表示重組質(zhì)粒酶切圖。

圖2：pGIPZ-YBX1-tGFP重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定圖

圖3：表達(dá)人YBX1基因的SMCC-7721穩(wěn)定細(xì)胞系在細(xì)胞倒置熒光顯微鏡(顯微鏡倍數(shù)100倍)下的細(xì)胞熒光鑒定圖

圖4：表達(dá)人YBX1基因的SMCC-7721穩(wěn)定細(xì)胞系RT-qPCR鑒定圖

圖5：表達(dá)人YBX1基因的SMCC-7721穩(wěn)定細(xì)胞系Western Blot鑒定圖。泳道1為對(duì)照：只轉(zhuǎn)入tGFP熒光蛋白；泳道2為YBX1-tGFP融合表達(dá)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，二者抗體均為Mouse tGFP Antibody。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、pGIPZ-YBX1-tGFP重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)根據(jù)YBX1基因的編碼序列(GenBank：BC070084.1)設(shè)計(jì)兩端特異性引物，以人正常乳腺癌細(xì)胞(HMLE)cDNA為模板擴(kuò)增YBX1全長(zhǎng)基因序列。PCR引物序列為：

YBX1Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)條件：

(2)將上述擴(kuò)增的人YBX1全長(zhǎng)基因序列克隆到T-vector載體(Takara)中，構(gòu)建成T-YBX1重組載體。具體操作如下：將YBX1擴(kuò)增片斷進(jìn)行切膠回收，采用寶生物公司DNA Ligation Kit，將切膠回收的YBX1片斷與T-vector載體(摩爾質(zhì)量比3：1)于16℃連接30min，具體操作方法參照產(chǎn)品說明書。然后將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)。次日，收集細(xì)菌培養(yǎng)液，采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit提取T-YBX1質(zhì)粒。

(3)利用多重PCR方法，分別以T-YBX1載體為模板擴(kuò)增YBX1基因，以pGIPZ載體為模板擴(kuò)增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下，試劑采購(gòu)自寶生物公司。

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'CMV：5'-GGTGGCAGATCCTCTAGTAGAG-3'

5'(CMV)-YBX1：5'-AGAGGATCTGCCACCATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

3'YBX1-(GFP)：5'-TCCATACCTCCAGCTCCCTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

5'tGFP：5'-GGAGCTGGAGGTATGGAGAGCGACGAGAGCG-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

PCR反應(yīng)條件如下：

PCR反應(yīng)條件：

(4)將上述CMV、YBX1和tGFP基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，然后按照1：1：1質(zhì)量比例混合在一起作為模板，利用下列引物擴(kuò)增CMV-YBX1-tGFP融合基因。PCR引物序列如下，其中5'端引物帶有Xba I位點(diǎn)，3'端引物帶有Not I位點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考步驟(3)。

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(5)切膠回收上述獲得的PCR產(chǎn)物，將CMV-YBX1-tGFP基因克隆到pCR4-Blunt載體上，具體步驟如下：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Xba I和Not I雙酶切，切膠回收CMV-YBX1-tGFP基因；將pCR4-Blunt載體同樣進(jìn)行Xba I和Not I雙酶切，切膠回收線性載體；利用TaKaRa DNA Ligation Kit，將CMV-YBX1-tGFP基因連接到pCR4Blunt載體上，于16℃反應(yīng)30min，具體方法參考產(chǎn)品說明書。將上述連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞，于37℃過夜培養(yǎng)。次日收集細(xì)菌培養(yǎng)液，采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit提取pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP重組載體，送測(cè)序鑒定。

酶切反應(yīng)體系如下：50μl酶切體系，含有1μg的質(zhì)粒、10U Xba I、10U Not I、2.5μl(K+BSA)buffer，其余用dH2O補(bǔ)足，混勻后，放入37℃水浴孵育1小時(shí)；然后在1％(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(6)將CMV-YBX1-tGFP基因從pCR4-Blunt載體酶切下來克隆到慢病毒表達(dá)載體pGIPZ上，具體步驟如下：利用Xba I和Not I雙酶切pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP載體，切膠回收CMV-YBX1-tGFP基因片斷；利用Xba I和Not I雙酶切pGIPZ載體，切膠回收線性載體，Xba I和Not I雙酶切反應(yīng)體系同步驟(5)。采用TaKaRa DNA Ligation Kit，將上述獲得的 CMV-YBX1-tGFP基因連接到pGIPZ線性載體中，于16℃反應(yīng)30min；然后將連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到E.coli.DH5a感受態(tài)細(xì)胞，于37℃過夜培養(yǎng)；次日收集細(xì)菌培養(yǎng)液，提取pGIPZ-CMV-YBX1-tGFP重組質(zhì)粒。

2、SMCC-7721細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

SMCC-7721細(xì)胞采購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。將SMCC-7721細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿，在含體積濃度10％的胎牛血清和1×P/S的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)；HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)條件同上。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80％以上傳代，用PBS清洗1次，加入1ml的0.25％胰酶消化1～3min，加入9ml液體培養(yǎng)基終止消化，然后按1/5～1/10比例傳代。

3、HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染、慢病毒包裝和收獲

(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在100mm培養(yǎng)皿中接種1×106個(gè)HEK293T細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，次日細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70％。

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將pGIPZ-YBX1-tGFP重組質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pVSVG和按照10：9：1質(zhì)量比例(總質(zhì)量6mg)混合在580ml的Opti-MEM基本培養(yǎng)基中，然后添加12ml Transfect reagent(Thermofisher)試劑，震蕩混勻，室溫放置20min。例如，將0.3μg pVSVG、2.7μg psPAX2和3.0μg pGIPZ-YBX1-tGFP混合在580μl的Opti-MEM基本培養(yǎng)基中，添加12μl Transfect reagent(ThermoFisher)到上述培養(yǎng)基中，混合均勻、室溫放置20min。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑用量可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)體系按照比例進(jìn)行調(diào)整。

HEK293T細(xì)胞預(yù)處理方法：取出HEK293T細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，添加PBS溶液清洗一次；除去PBS溶液，添加3ml不含血清的DMEM基本培養(yǎng)液，室溫放置20min。20min之后，將含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑混合液逐滴添加到預(yù)先處理好的HEK293T細(xì)胞中，邊添加邊搖勻，然后放置到37℃、含5％CO2空氣的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)。6小時(shí)之后，補(bǔ)充7ml含有血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

(3)48小時(shí)以后，在熒光顯微鏡下觀察HEK293T細(xì)胞是否發(fā)出綠色熒光(見圖3)。如果可見綠色熒光，說明質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)入細(xì)胞。收集含有病毒的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)液。將該病毒培養(yǎng)液使用0.45μm無菌濾膜過濾后直接使用或者濃縮后使用，也可以放置在-80℃長(zhǎng)期保存。

4、SMCC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞系篩選

(1)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前一天，在6孔板中接種2×105個(gè)SMCC-7721細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，次日細(xì)胞匯合度達(dá)到50～70％。

(2)病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，從培養(yǎng)箱中取出SMCC-7721細(xì)胞，除去培養(yǎng)液，添加PBS溶液清洗一次，除去PBS溶液。添加預(yù)先準(zhǔn)備好的病毒培養(yǎng)液，按照2.5ml/孔添加，輕輕搖勻后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

(3)24小時(shí)后，除去病毒培養(yǎng)液，每孔添加2.5ml新鮮的含有10％胎牛血清和1×P/S的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48～72小時(shí)。

(4)培養(yǎng)48～72小時(shí)后，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)出綠色熒光(見圖3)。更換含有10％胎牛血清和1×P/S的DMEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)添加終濃度為2μg/ml puromycin進(jìn)行陽性細(xì)胞篩選。每3天更換一次含有2μg/ml puromycin的完全培養(yǎng)基，連續(xù)篩選4周以上，直到熒光顯微鏡下可見幾乎所有細(xì)胞都發(fā)出綠色熒光。

(5)陽性單克隆細(xì)胞系篩選。篩選2周后在熒光顯微鏡下挑取陽性細(xì)胞簇，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到1cell/孔，接種到96孔板中，同時(shí)添加100μl含有2μg/ml puromycin的DMEM完全培養(yǎng)基。兩周以后，對(duì)熒光強(qiáng)度較高的單克隆細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取細(xì)胞RNA和蛋白，鑒定YBX1基因和蛋白的表達(dá)。對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)的陽性細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存于液氮中長(zhǎng)期保存。

5、表達(dá)人YBX1蛋白的SMCC7721穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定

(1)根據(jù)人YBX1基因的外顯子序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(如下)。提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。核酸提取試劑和PCR檢測(cè)試劑分別采用寶生物公司RNAiso Plus和One Step SYBR PrimeScrip RT-PCR Kit，操作步驟參照產(chǎn)品說明書。檢測(cè)結(jié)果如圖4。

YBX1Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)提取穩(wěn)定細(xì)胞系總蛋白，采用BCA方法定量蛋白，然后采用Western Blot方法檢測(cè)YBX1表達(dá)(見圖4)。具體操作如下：將表達(dá)YBX1-tGFP蛋白的SMCC-7721細(xì)胞接種到100mm培養(yǎng)皿中，添加8ml預(yù)冷的PBS清洗1 次，棄上清，加入350μl預(yù)冷的RIPA試劑(ThermoFisher)到上述培養(yǎng)皿中，并將其置于冰上裂解細(xì)胞30min，期間輕輕混勻幾次；然后使用預(yù)冷的細(xì)胞刮鏟將細(xì)胞快速刮下，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中；然后于12000rpm，4℃離心30min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。采用BCA方法(ThermoFisher)測(cè)定蛋白濃度，吸取質(zhì)量為20μg的蛋白液，加入1/5體積的4×SDS PAGE Loading Buffer，于100℃變性5min，然后進(jìn)行10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒定電壓80V；將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，恒定電流250Ma；將PVDF膜用質(zhì)量體積比為5％的脫脂奶粉(溶于TBST溶液)封閉1小時(shí)，然后加入TBST溶液洗膜3次，每次10min，加入Mouse tGFP Antibody一抗，于4℃過夜孵育。次日早上，回收一抗，添加TBST洗膜3次，每次10min，再加入二抗，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜3次,每次10min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后進(jìn)行成像分析。如圖4所示，對(duì)照細(xì)胞只表達(dá)tGFP蛋白，而YBX1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系特異性表達(dá)YBX1-tGFP融合蛋白，表明YBX1穩(wěn)定表達(dá)的SMCC-7721細(xì)胞系構(gòu)建成功。