專利名稱：一種加壓素v2受體穩(wěn)定表達細胞系的建立及其在藥物篩選中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系及其在藥物篩選中的應用。
背景技術(shù)：
充血性心力衰竭(congestive heart failure, CHF)是指心肌收縮力減弱而引起循環(huán)充血的疾病，表現(xiàn)為在心臟受到損害或超負荷工作的狀態(tài)下，心臟不能有效地輸出從體液循環(huán)回流的血液，導致心臟容量增加；同時腎臟功能發(fā)生障礙，水和納的排泄減弱，導致水腫和低鈉血癥，為CHF病人病情惡化的原因之一，嚴重影響病人的預后，使病人的死亡率增加60%。目前臨床上對CHF還沒有很好的治療藥物，現(xiàn)有藥物可通過增加心血收縮力等來緩解重狀，延長生命。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)加壓素的過量分泌是CHF病人并發(fā)低鈉血癥的病理之一，從而降低加壓素的濃度或拮抗它對腎臟的作用成為治療充血性心力衰竭和低鈉血癥的研究方向。加壓素又稱為抗利尿激素(antidiuretic hormone, ADH),是腦垂體分泌的一種環(huán)肽類激素，在人體調(diào)節(jié)游離水的重吸收、體液的等滲濃度、血液容積、血壓、細胞收縮、細胞增殖和腎上腺皮質(zhì)激素的分泌等方面扮演重要角色，它的這些生理作都是通過與加壓素受體結(jié)合而產(chǎn)生的。加壓素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族(G-protein coupled protein,GPCR)，根據(jù)受體偶聯(lián)的第二信使的不同可分為3種亞型V1 (或Via)、V2和V3 (或Vlb)。其中V2受體偶聯(lián)于腺苷酸環(huán)化酶信號傳導路徑，以細跑內(nèi)的cAMP作為第二信使。V2受體主要分布在腎臟的腎集合小管，調(diào)節(jié)游離水的重吸收。在人體內(nèi)，加壓素通過與V2受體結(jié)合，經(jīng)過Gs蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶，提高細胞內(nèi)作為第二信使的cAMP水平，激活蛋白激酶A,再激活水通道AQP-2，導致游離水通透性增高，水的重吸收增加而產(chǎn)生抗利尿作用。V2受體拮抗劑能特異性拮抗AVP與V2受體的結(jié)合，拮抗AVP的抗利尿作用，從而起到利水作用，治療CHF的低鈉血癥及相關(guān)疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法。本發(fā)明提供的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟I)將加壓素V2受體基因的編碼序列插入到真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩(wěn)定表達加壓素V2受體的細胞系。上述真核表達載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對表達的加壓素V2受體進行細胞定位，可在真核表達載體上加入能于宿主中表達并產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。
上述宿主細胞可為Hela細胞、MDA-MB-231細胞、MCF-7細胞等。利用上述方法制備的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物的細胞模型。實驗證明，本發(fā)明的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞株對加壓素V2受體阻斷劑和加壓素V2受體抗體敏感，作用顯著。本發(fā)明的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系為深入探索加壓素V2受體在血栓形成的作用提供實驗技術(shù)平臺，可用于篩選預防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物。


圖I為重組表達載體pTagLite-Snap_AVPR2的構(gòu)建流程2為各穩(wěn)定表達加壓素V2受體細胞系的加壓素V2受體表達量實驗結(jié)果圖3為加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系對加壓素V2受體抑制劑的敏感性分析實驗結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，實施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的具體構(gòu)建流程如圖I所示。實施例I.重組真核表達載體pTagLite-Snap_AVPR2的構(gòu)建下述實驗過程中所用的DNA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)加壓素V2受體蛋白編碼框的cDNA序列，設計PCR引物如下正向引物5’ACTGATATCATGCTCATGGCGTCCACCACTTCCG-3’(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識別位點);反向引物5' -AACGAGCTCCGATGAAGTGTCCTTGGCCAGGGAG-3 '(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識別位點)。取人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Xho I對純化回收后的產(chǎn)物進行酶切，酶切產(chǎn)物再次進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到加壓素V2受體蛋白編碼框的cDNA序列。同時，將真核表達載體pTagLite-Snap (購自Cisbio公司)也用EcoRV和Xho I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴增得到的加壓素V2受體蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達載體pTagLite-Snap酶切后的產(chǎn)物,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coliTop 10)感受態(tài)細胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進行PCR檢測。對PCR產(chǎn)物進行測序，以檢測陽性克隆中插入序列的正確。測序結(jié)果表明，插入的1113bp的加壓素V2受:體蛋白編碼框的cDNA序列與GenBankAccession Number NM 000054. 4的自5'端第72位-第1184位的序列一致。將得到的重組表達載體命名為pTagLite-Snap-AVPR2受體。
實施例2·加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SVMinipreps (購自Promega)提取質(zhì)粒,得到高純度的重組表達載體pTagLite-Snap-加壓素V2受體,將重組表達載體 pTagLite-Snap-加壓素 V2 受體利用 Lipofectamine 2000 (購自 Invitrogen)轉(zhuǎn)染HeLa細胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞24小時以上。用G418(濃度為I μ g/ml)對重組HeLa細胞進行篩選，經(jīng)多次篩選后，得到加壓素V2受體的穩(wěn)定表達細胞系。將各株加壓素V2受體穩(wěn)定表達的Hela細胞株保存于液氮中。選取四個加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞株，利用抗加壓素V2受體的抗體(購自AbCam公司)進行蛋白免疫印跡實驗，結(jié)果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩(wěn)定表達細胞株的加壓素V2受體表達量，Blank為轉(zhuǎn)入真核表達載體pTagLite-Snap的空白對照細胞，anti-Tubulin表示參照。結(jié)果表明，各加壓素V2受體的穩(wěn)定表達細胞株均有不用程度的加壓素V2受體表達。 實施例3.加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系對加壓素V2受體抑制劑(Conivaptan)的敏感性分析選用上述實施例2的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞、轉(zhuǎn)入真核表達載體pTagLite-Snap的細胞進行加壓素V2受體抑制劑敏感性試驗。將加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞、轉(zhuǎn)入真核表達載體pTagLite-Snap的細胞培養(yǎng)于DMEM+10%胎牛血清的培養(yǎng)基里，將處于旺盛生長期的細胞(一般在傳代后20小時左右)經(jīng)膜蛋白酶消化重懸后，進行細胞計數(shù)，以每孔IO3到IO4個細胞的量接種于96孔板中進行擴增，且每孔細胞數(shù)目均勻。24小時后，分別加入加壓素V2受體抑制劑(Conivaptan)。抑制劑(Conivaptan)的濃度分別為 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-based Assay Kit(購自 Cisbio)說明書進行HTRF(均相時間分辨熒光)實驗，在加入抑制劑后的細胞孔板中加入標記的一抗和二抗，孵育30min后在sunrise酶標儀(TECAN公司產(chǎn)品)上于665和620nm波長處讀取吸光值，進行數(shù)據(jù)分析，具體結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種加壓素V2穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟 1)將加壓素V2的編碼基因插入真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體； 2)將步驟I得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩(wěn)定表達加壓素V2的細胞系O
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為HeLa細胞、MDA-MB-231細胞或MCF-7細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法制備的加壓素V2穩(wěn)定表達細胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的加壓素V2穩(wěn)定表達細胞系，其特征在于，所述加壓素V2穩(wěn)定表達細胞系為SNAP-加壓素V2穩(wěn)定表達的HeLa細胞系。
6.權(quán)利要求4-5中任一項所述的加壓素V2穩(wěn)定表達細胞系在篩選預防和/或治療針對此靶點藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，從而提供一種篩選預防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細胞模型。本發(fā)明提供的加壓素V2受體穩(wěn)定表達細胞系的制備方法，包括以下步驟1)將加壓素V2受體基因的編碼序列插入到真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；2)將步驟1得到的重組表達載體導入宿主細胞中，篩選得到穩(wěn)定表達加壓素V2受體的細胞系。
文檔編號C12Q1/02GK102827868SQ20111016085
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者譚初兵, 徐為人, 付剛 申請人:天津藥物研究院