專利名稱：一種加壓素v1受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立及其在藥物篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及其在藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
充血性心カ衰竭(congestive heart failure, CHF)是指心肌收縮カ減弱而引起循環(huán)充血的疾病，表現(xiàn)為在心臟受到損害或超負(fù)荷工作的狀態(tài)下，心臟不能有效地輸出從體液循環(huán)回流的血液，導(dǎo)致心臟容量増加；同時(shí)腎臟功能發(fā)生障礙，水和納的排泄減弱，導(dǎo)致水腫和低鈉血癥，為CHF病人病情惡化的原因之一，嚴(yán)重影響病人的預(yù)后，使病人的死亡率增加60%。目前臨床上對(duì)CHF還沒有很好的治療藥物，現(xiàn)有藥物可通過增加心血收縮ヵ等來緩解重狀，延長(zhǎng)生命。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)加壓素的過量分泌是CHF病人并發(fā)低鈉血癥的病 理之一，從而降低加壓素的濃度或拮抗它對(duì)腎臟的作用成為治療充血性心力衰竭和低鈉血癥的研究方向。加壓素又稱為抗利尿激素(antidiuretic hormone, ADH),是腦垂體分泌的一種環(huán)肽類激素，在人體調(diào)節(jié)游離水的重吸收、體液的等滲濃度、血液容積、血壓、細(xì)胞收縮、細(xì)胞増殖和腎上腺皮質(zhì)激素的分泌等方面扮演重要角色，它的這些生理作都是通過與加壓素受體結(jié)合而產(chǎn)生的。加壓素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族(G-protein coupled protein,GPCR)，根據(jù)受體偶聯(lián)的第二信使的不同可分為3種亞型V1 (或Via)、V2和V3 (或Vlb)。其中Vl受體偶聯(lián)于磷酸肌醇信號(hào)傳導(dǎo)路徑，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+作為第二信使。Vl受體主要分布在血管平滑肌、肝細(xì)胞和血小板中，參與血管收縮、血小板聚集和肝糖元分解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法。本發(fā)明提供的加壓素V2受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟I)將加壓素Vl受體基因的編碼序列插入到真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體；2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)加壓素Vl受體的細(xì)胞系。上述真核表達(dá)載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對(duì)表達(dá)的加壓素Vl受體進(jìn)行細(xì)胞定位，可在真核表達(dá)載體上加入能于宿主中表達(dá)并產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主細(xì)胞可為Hela細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞等。利用上述方法制備的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種篩選預(yù)防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物的細(xì)胞模型。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株對(duì)加壓素Vl受體阻斷劑和加壓素Vl受體抗體敏感，作用顯著。本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為深入探索加壓素Vl受體在血栓形成的作用提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，可用于篩選預(yù)防和/或治療缺血性腦卒中、心肌梗死等藥物。


圖I為重組表達(dá)載體pTagLite-Snap-AVPRl的構(gòu)建流程2為各穩(wěn)定表達(dá)加壓素Vl受體細(xì)胞系的加壓素Vl受體表達(dá)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3為加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)加壓素Vl受體抑制劑的敏感性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說明，實(shí)施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的具體構(gòu)建流程如圖I所示。實(shí)施例I.重組真核表達(dá)載體pTagLite-Snap-AVPRl的構(gòu)建下述實(shí)驗(yàn)過程中所用的DNA引物由上海生エ生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物如下正向引物5’-ACTGATATCATGCGTCTCTCCGCCGGTCCCGACG-3> (下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn));反向引物5' -AACGAGCTCAGTTGAAACAGGAATGAATTTGATG-3 '(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn))。取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Xho I對(duì)純化回收后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列。同時(shí)，將真核表達(dá)載體pTagLite-Snap (購(gòu)自Cisbio公司)也用EcoRV和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴(kuò)增得到的加壓素Vl受體蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達(dá)載體pTagLite-Snap酶切后的產(chǎn)物,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli Top10)感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)陽性克隆中插入序列的正確。測(cè)序結(jié)果表明，插入的1254bp的加壓素Vl受:體蛋白編碼框的cDNA序列與GenBank AccessionNumber NM 000706. 3的自5'端第1975位-第3228位的序列一致。將得到的重組表達(dá)載體命名為pTagLite-Snap-AVPRl受體。實(shí)施例2.加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SV Minipreps (購(gòu)自Promega)提取質(zhì)粒,得到高純度的重組表達(dá)載體pTagLite-Snap-加壓素Vl受體,將重組表達(dá)載體 pTagLite-Snap-加壓素 Vl 受體利用 Lipofectamine 2000 (購(gòu)自 Invitrogen)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞24小時(shí)以上。用G418(濃度為I μ g/ml)對(duì)重組HeLa細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)多次篩選后，得到加壓素Vl受體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。將各株加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)的Hela細(xì)胞株保存于液氮中。選取四個(gè)加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，利用抗加壓素Vl受體的抗體(購(gòu)自AbCam公司)進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的加壓素Vl受體表達(dá)量，Blank為轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的空白對(duì)照細(xì)胞，anti-Tubulin表示參照。結(jié)果表明，各加壓素Vl受體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株均有不用程度的加壓素Vl受體表達(dá)。實(shí)施例3.加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對(duì)加壓素Vl受體抑制劑([d(CH2)5-Tyr2 (Me)] AVP)的敏感性分析·選用上述實(shí)施例2的加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞進(jìn)行加壓素Vl受體抑制劑敏感性試驗(yàn)。將加壓素Vl受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體PTagLite-Snap的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10 %胎牛血清的培養(yǎng)基里，將處于旺盛生長(zhǎng)期的細(xì)胞(一般在傳代后20小時(shí)左右)經(jīng)膜蛋白酶消化重懸后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔IO3到IO4個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔板中進(jìn)行擴(kuò)増，且每孔細(xì)胞數(shù)目均勻。24小時(shí)后，分別加入加壓素Vl受體抑制劑([d(CH2)5-Tyr2(Me)]AVP)。抑制劑([d(CH2)5-Tyr2 (Me)] AVP)的濃度分別為 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-basedAssay Kit(購(gòu)自Cisbio)說明書進(jìn)行HTRF (均相時(shí)間分辨熒光)實(shí)驗(yàn)，在加入抑制劑后的細(xì)胞孔板中加入標(biāo)記的ー抗和ニ抗，孵育30min后在sunrise酶標(biāo)儀(TECAN公司產(chǎn)品)上于665和620nm波長(zhǎng)處讀取吸光值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種加壓素Vi穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟 1)將加壓素Vi的編碼基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體； 2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)加壓素Vl的細(xì)胞系O
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為HeLa細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法制備的加壓素Vl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的加壓素Vl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，其特征在于，所述加壓素Vl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為SNAP-加壓素Vl穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)所述的加壓素Vl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系在篩選預(yù)防和/或治療針對(duì)此靶點(diǎn)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供的加壓素V1受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，從而提供一種篩選預(yù)防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細(xì)胞模型。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102827872SQ20111016143
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者譚初兵, 徐為人 申請(qǐng)人:天津藥物研究院