專利名稱：：含有番茄LeEXP2基因的重組載體及重組菌及LeEXP2基因在重組菌中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種含有番茄LeEXP2基因的重組載體、含番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌及番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。
背景技術(shù)：
：纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物質(zhì)。利用其進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇等化學(xué)品，對(duì)于當(dāng)前人類解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問(wèn)題具有極其重要的意義。纖維素特殊的晶體結(jié)構(gòu)使纖維素酶分子很難靠近纖維素分子內(nèi)部的糖苷鍵，酶解消耗大量的纖維素酶和時(shí)間已成為生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的瓶頸[1]。目前運(yùn)用化學(xué)試劑或高溫高壓等方式改變纖維結(jié)構(gòu)不僅成本高和費(fèi)時(shí)，而且也會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染。因此，尋找溫和、高效、環(huán)保的改變纖維結(jié)構(gòu)的方法尤為迫切。膨脹素(Expansins)是高等植物的細(xì)胞壁中普遍存在的一類蛋白質(zhì)，能增強(qiáng)細(xì)胞壁的延展能力，松弛植物細(xì)胞壁從而使細(xì)胞擴(kuò)增，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答脅迫中扮演重要角色[23]。目前發(fā)現(xiàn)Expansins主要有四個(gè)基因家族，S卩α-expansin(EXPA)，β-expansin(EXPB)，expansin-likeA(EXLA)禾口expansin-likeB(EXLB)[4]Expansin的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為N-端信號(hào)肽，Dl(Domainl)和D2(Domain2)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由Linker相連。最近在線蟲[5]紫貽貝[6]，少數(shù)真菌和細(xì)菌等生物中也發(fā)現(xiàn)了一些在結(jié)構(gòu)上類似于植物Expansin的同源蛋白[7_1(1]。細(xì)胞壁是棉、麻和紙等纖維素產(chǎn)品的原材料，若能利用膨脹素改善或降解纖維素，將會(huì)對(duì)清潔降解纖維素生產(chǎn)化工品有重要的意義。但從植物的總蛋白中純化出單一的Expansin蛋白不僅步驟繁瑣難度大而且純化的量也較為有限，而且植物膨脹素難于在細(xì)菌的中大量表達(dá)[11]。這限制了Expansin的應(yīng)用。番茄的Expansins家族有LeEXP1，LeEXP2，LeEXP3等蛋白，LeEXP2被報(bào)道在膨脹、成熟的組織中表達(dá)，參與細(xì)胞伸長(zhǎng)等方面的生理角色[12_13]，但目前尚未將其在番茄體外的其他宿主中表達(dá)，也未用其提高纖維素酶降解纖維素材料效率。參考文獻(xiàn)1MerinoST,CherryJ.Progressandchallengesinenzymedevelopmentforbiomassutilization.AdvBiochemEngin/Biotechnol,2007,108:95-120.2SampedroJ,CosgroveDJ.Theexpansinsuperfamily.GenomeBiology,2005,6(12):1-11.3CosgroveDJ.Looseningofplantcellwallsbyexpansins.NATURE,2000,407(21):321-326.4CosgroveDJ,BedingerP,DurachkoDM.GroupIallergensofgrasspollenascellwalllooseningagents.PNASUSA,1997,94:6559-6564.5QinL,KudlaU,RozeEH,etal.Plantdegradation:anematodeexpansinactingonplants.Nature,2004,427(6969):30.6XuBZ,HellmanU,ErssonB,etal.Purification,characterizationandamino-acidsequenceanalysisofathermostable,lowmolecularmassendo_b_(l，4)-glucanasefrombluemussel,Mytilusedulis.EurJBiochem,2000,267(16)4970-4977.7KerffaF,AmorosoaA,HermanaR,etal.CrystalstructureandactivityofBacillussubtilisYoaJ(EXLXl),abacterialexpansinthatpromotesrootcolonization.PNAS,2008，105(44)16876-16881.8YaoQ,SunTT,IiuWF,ChenGJ.Genecloningandheterologousexpressionofanovelendoglucanase,swollenin,fromTrichodermapseudokoningiiS38.BiosciBiotechnolBiochem，2008，72(11):2799-2805.9LeeHJ,LeeS,KoH,KimKH,ChoiI.AnExpansin-LikeProteinfromHahellachejuensisBindsCelluloseandEnhancesCellulaseActivity.Mol.Cells,2010.29379-385.10SaloheimoM,PaloheimoM,HakolaS,etal.Swollenin,aTrichodermareeseiproteinwithsequencesimilaritytotheplantexpansins,exhibitsdisruptionactivityoneellulosicmaterials.EurJBiochem,2002,269(17)4202-4211.11KimES,LeeHJ,BangWGetal.FunctionalCharacterizationofaBacterialExpansinFromBacillussubtilisforEnhancedEnzymaticHydrolysisofCellulose.BiotechnologyandBioengineering,2009.12VoglerH,CaderasD,MandelT,KuhlemeieC.Domainsofexpansingeneexpressiondefinegrowthregionsintheshootapexoftomato.PlantMolecularBiology.2003.53:267-272.13ReinhardtD,WittwerF,MandelT,andKuhlemeierC.LocalizedUpregulationofaNewExpansinGenePredictstheSiteofLeafFormationintheTomatoMeristem.ThePlantCell,1998:10,1427-1437.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種含有番茄LeEXP2基因的重組載體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌。本發(fā)明的第三個(gè)目的提供一種番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種含有番茄LeEXP2基因的重組載體，用下述方法構(gòu)建(1)提取番茄的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，用序列表中SEQIDNO.1和SEQIDN0.2所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列表中SEQIDN0.3所示的744bp的LeEXP2基因，連接至TA載體pGEM_T，獲得含有番茄LeEXP2基因的質(zhì)粒pGEM-LeEXP2；(2)LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體以所述質(zhì)粒pGEM_LeEXP2為模板，以序列表中SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQIDNO.6所示的703bp片段，將所述703bp片段經(jīng)TA克隆連至pGEM_T載體，命名為pTLeEXP2；提取質(zhì)粒pTLeEXP2和巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIChlphaA質(zhì)粒，用EcoRI和^CbaI同時(shí)酶切pTLeEXP2和pPIChlphaA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切pTLeEXP2得到SEQIDNO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalphaA得到的SEQIDNO.8所示的3530bp片段；回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10F'的感受態(tài)細(xì)胞中，涂含kocin25μg/mL的LB平板，培養(yǎng)12_1他，得到含pPIChlphaA_LeEXP2質(zhì)粒的大腸桿菌，提取大腸桿菌中pPIChlphaA-LeEXP2質(zhì)粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重組載體。一種含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌，用下述方法獲得將10-15μg的pPICZalphaA_LeEXP2質(zhì)粒，用PmeI酶切成SEQIDN0.9所示的4219bp片段，乙醇沉淀SEQIDN0.9所示的線性DNA片段，干燥所述線形DNA片段后溶于無(wú)菌水，制成濃度為0.5-1μg/μL的線形DNA溶液；將80μL巴斯德畢赤酵母宿主菌Χ33的感受態(tài)細(xì)胞與10μL的0.5-1Ug/μL的線形DNA溶液混合勻后轉(zhuǎn)移到0_4°C預(yù)冷的電極杯中，冰浴5min，1500V電擊5ms，電擊后加入ImL冰冷的IM山梨醇水溶液到電轉(zhuǎn)杯中，混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，28-30°C靜置培養(yǎng)1-濁，在含100μg/mLkocin的YPD平板上涂50μL-200μL培養(yǎng)后的混合液，30°C倒置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，PCR鑒定菌落，PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌落為含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)，將其中的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCN0.4123進(jìn)行保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2010年8月27日，(見(jiàn)保藏存活證明)。番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的誘導(dǎo)表達(dá)，包括下述步驟①將含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌和巴斯德畢赤酵母宿主菌X33分別接種在2-;3mlpH=4.8的BMGY中預(yù)培養(yǎng)，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)至OD6tltl=2-6；②按1100的體積比分別將步驟①的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至25mlBMGY培養(yǎng)基中，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，28-30°C培養(yǎng)至OD600=2-6；③將步驟②培養(yǎng)的菌液分別轉(zhuǎn)接加入至50mlpH=4.8的含體積濃度為0.5%-1%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，使菌液的濃度OD6tltl=0.8-1.5；在200-250轉(zhuǎn)/分鐘，搖床中培養(yǎng)，每24h補(bǔ)甲醇至0.5%-1%，誘導(dǎo)LeEXP2因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的表達(dá)。本發(fā)明的重組菌能有效地表達(dá)目的蛋白LeEXP2?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)從植物中純化出膨脹素的量有限，無(wú)法大量應(yīng)用到纖維素降解中的不足，蛋白LeEXP2能協(xié)同纖維素酶提高纖維素降解產(chǎn)生還原糖的效率。自然界中有諸多的廢棄的木質(zhì)纖維素，通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的LeEXP2蛋白能提高纖維素酶降解纖維素的效率，避免了現(xiàn)有技術(shù)用高溫高壓和酸堿水解預(yù)處理纖維素等方法對(duì)環(huán)境造成的污染，這對(duì)清潔有效的利用廢棄的纖維素生產(chǎn)能源，解決當(dāng)前能源危機(jī)具有極其重要的意義。圖1為L(zhǎng)eEXP2基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳。泳道1所示的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker；泳道2所示的為L(zhǎng)eEXP2的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。圖2為含有番茄LeEXP2基因的質(zhì)粒pGEM_LeEXP2的構(gòu)建策略圖。圖3為pTLeEXP2質(zhì)粒酶切凝膠電泳。圖中泳道1為限制性內(nèi)切酶EcoRI和)(baI雙切pTLeEXP2質(zhì)粒；泳道2為pTLeEXP2質(zhì)粒對(duì)照；M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。圖4為pPIChlphaA質(zhì)粒酶切凝膠電泳。圖中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，泳道1為pPICZalphaA的EcoRI和XbaI雙切產(chǎn)物泳道2為pPICZalphaA質(zhì)粒對(duì)照。圖5是將LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體時(shí)，轉(zhuǎn)化后得到的重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖中泳道1是質(zhì)粒對(duì)照；泳道2是限制性內(nèi)切酶EcoRI單切質(zhì)粒產(chǎn)生的4219bp片段；泳道3是XbaI單切質(zhì)粒產(chǎn)生的4219bp；泳道4是EcoRI和XbaI雙切質(zhì)粒產(chǎn)生的!3530bp和689bp兩個(gè)DNA片段；泳道M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker。圖6為L(zhǎng)eEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建策略圖。圖7為質(zhì)粒LeEXP2_pPICZalphaA酶切凝膠電泳。圖中泳道1為pPICZalphaA-LeEXP2質(zhì)粒對(duì)照；泳道2是質(zhì)粒pPICZalphaA_LeEXP2的經(jīng)PmeI單切產(chǎn)生的4219bp的DNA片段；泳道M為Marker。圖8為PCR鑒定重組巴斯德畢赤酵母菌株。圖中M為Marker；泳道1到9分別對(duì)應(yīng)L7,L9,L10,Lll,L12,L13,L14,L15,L16等菌株的PCR結(jié)果；泳道10是用X-33的DNA作為PCR陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)生的2.2kb的片段，泳道11是用水為模板作為PCR陰性對(duì)照的結(jié)果。圖9為不同誘導(dǎo)時(shí)間重組菌株L15分泌的總蛋白電泳圖。泳道1為蛋白Marker，泳道2-9為重組菌1-8天分泌表達(dá)的LeEXP2，泳道10為對(duì)照菌株巴斯德畢赤酵母宿主菌X33在第8天分泌的蛋白。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1番茄LeEXP2基因的克隆用Trizol試劑按照試劑盒說(shuō)明提取番茄的總RNA取2ug總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA(Promega公司)，以該cDNA為模板，用序列表中SEQIDNO.1和SEQIDN0.2所示核苷酸序列為上游引物和下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列表中SEQIDNO.3所示的744bp的LeEXP2基因(見(jiàn)圖1)。回收PCR產(chǎn)物，連接至TA載體pGEM_T(Promega公司)得到新的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序證實(shí)該質(zhì)粒含有番茄LeEXP2基因，質(zhì)粒命名為pGEM-LeEXP2，即獲得含有番茄LeEXP2基因的質(zhì)粒pGEM-LeEXP2。構(gòu)建策略見(jiàn)圖2。實(shí)施例2LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體以質(zhì)粒pGEM_LeEXP2為模板，以序列表中SEQIDNO.4所示核苷酸序列為上游引物，以序列表中SEQIDNO.5所示核苷酸序列為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQIDN0.6所示的703bp片段，將所述703bp片段與TA克隆載體pGEM_T連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlOF'得到的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒是由LeEXP2基因與pGEM-T連接而成，將轉(zhuǎn)化子獲得的新質(zhì)粒命名為pTLeEXP2，并從上述轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒pTLeEXP2，并從含有酵母表達(dá)載體pPICZalphaA質(zhì)粒的大腸桿菌中提取pPICZalphaA質(zhì)粒，用EcoRI和XbaI同時(shí)酶切質(zhì)粒pTLeEXP2和pPIChlphaA；瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物(圖3和圖4)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切pTLeEXP2質(zhì)粒得到SEQIDNO.7所示的689bp片段(圖3)和酶切pPICZalphaA質(zhì)粒得到的SEQIDNO.8所示的3530bp片段(圖4)?；厥债a(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPlOF'的感受態(tài)細(xì)胞中，涂含&0(^11(購(gòu)自hvitrogen公司)25μg/mL的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)12-1!，菌落長(zhǎng)至直徑為l-2mm；挑選平板上的單克隆，通過(guò)菌裂解PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后用EcoRI和^ChaI酶切驗(yàn)證載體上外源基因的插入單切質(zhì)粒皆產(chǎn)生片段4219bp，雙切質(zhì)粒皆產(chǎn)生3530bp和689bp片段(圖幻，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)期一致，經(jīng)測(cè)序證實(shí)后，命名為pPICZalphaA_LeEXP2，即得到含pPICZalphaA_LeEXP2質(zhì)粒的大腸桿菌。提取大腸桿菌中pPIChlphaA-LeEXP2質(zhì)粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重組載體。構(gòu)建策略見(jiàn)圖6。實(shí)施例3LeEXP2基因整合至巴斯德畢赤酵母染色體取10-15μgpPICZalphaA_LeEXP2質(zhì)粒，用PmeI酶切成線性的SEQIDNO.9所示的4219bp片段，電泳檢測(cè)如圖7所示產(chǎn)生4219bp片段，經(jīng)酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀線性SEQIDNO.9所示的線性DNA片段，干燥后溶于無(wú)菌水，制成DNA濃度為0.5-1μg/μL線形DNA溶液；參照精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)(Ρ512-5;3)中的電穿孔轉(zhuǎn)化制備酵母感受態(tài)細(xì)胞方法制備巴斯德畢赤酵母宿主菌Χ-33的感受態(tài)細(xì)胞，將80μL巴斯德畢赤酵母宿主菌Χ33的感受態(tài)細(xì)胞與10μL的0.5-1μg/μL線形DNA溶液混勻后，轉(zhuǎn)移到4°C預(yù)冷的電極杯中，冰浴5min，電壓1500V，用印pendorf公司的電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊，電擊5ms，電擊后立即加入ImL冰冷的IM山梨醇水溶液到電轉(zhuǎn)杯中，混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，28-30°C靜置培養(yǎng)lh，在含100μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板上涂100μL培養(yǎng)后的混合液，30°C倒置培養(yǎng)直至重組菌出現(xiàn)。YPD培養(yǎng)基為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂18g/L。預(yù)冷的電極杯的溫度也可以是0-4°C中的任意一值；28-30°C靜置培養(yǎng)的時(shí)間也可以是1-中的任意一值；在平板上涂培養(yǎng)后的混合液的體積也可以是50μL-200yL中的任意一值。以上實(shí)驗(yàn)均可獲得含有LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌。實(shí)施例4LeEXP2巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定提取實(shí)施例3中所獲得的重組菌的基因組DNA，以重組菌的基因組DNA為模板，用SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR，以檢測(cè)外源DNA的插入，巴斯德畢赤酵母宿主菌X33的染色體基因組DNA為模板的PCR作為陽(yáng)性對(duì)照，以水為模板的PCR作為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件為95°C變性30s，M°C退火30s，72°C延伸3min。PCR產(chǎn)物電泳，如圖8所示L7，L9，L10,Lll，L12，L13，L14，L15，L16等菌株皆能擴(kuò)增出插入到巴斯德畢赤酵母宿主菌X33染色體上的包括LeEXP2基因的1.215kb的片段，以及巴斯德畢赤酵母宿主菌X33的AOXl基因的2.2kb基因片段，說(shuō)明上述重組菌皆整合有LeEXP2基因。實(shí)施例5甲醇誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的LeEXP2基因表達(dá)①接種經(jīng)實(shí)施例4鑒定的含有LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌L7，L9，L10，Ll1，L12，L13，L14，L15，L16和巴斯德畢赤酵母宿主菌X33分別轉(zhuǎn)接至2ml,pH=4.8的BMGY培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)，220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)至0D_=4；7②按1100的體積比分別將步驟①的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至25mlBMGY培養(yǎng)基中，220轉(zhuǎn)/分鐘，29°C培養(yǎng)至OD600=4；③將步驟②培養(yǎng)的菌液分別轉(zhuǎn)接加入至50mlpH=4.8的含體積濃度為0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，使菌液的濃度OD6tltl=1，在220轉(zhuǎn)/分鐘，29°C搖床中培養(yǎng)，每24h補(bǔ)甲醇至0.5%，誘導(dǎo)重組菌分泌表達(dá)LeEXP2。為檢測(cè)LeEXP2能有效地表達(dá)且將目的蛋白分泌到重組巴斯德畢赤酵母菌的細(xì)胞外，從誘導(dǎo)后第1天至8天取重組菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白電泳。取樣及電泳方式如下取100μ1培養(yǎng)基，離心后，取上清16μ1與4μ1的上樣緩沖液混合，沸水煮5分鐘后，取12ul電泳。如圖9所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的蛋白LeEXP2分泌的越多，而對(duì)照菌株巴斯德畢赤酵母宿主菌X33則沒(méi)有目的蛋白LeEXP2的分泌(圖9為不同誘導(dǎo)時(shí)間重組菌株L15分泌的總蛋白電泳圖)，各個(gè)菌株分泌表達(dá)的LeEXP2也有所差異，其中重組菌L15分泌的重組蛋白LeEXP2的量較大，因此，將重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCNO.4123進(jìn)行保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2010年8月27日，(見(jiàn)保藏存活證明)。步驟①和②中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速也可以是200-250轉(zhuǎn)/分鐘中的任意一值；培養(yǎng)溫度也可以是-30°c中的任意一值；培養(yǎng)菌的濃度0D_也可以是2-6中的任意一值。步驟③中BMMY培養(yǎng)基中含甲醇的濃度也可以是0.5%-1%中的任意一值；菌體的濃度0D_也可以是0.8-1.5范圍中任意一值；轉(zhuǎn)速也可以是200-250轉(zhuǎn)/分鐘中的任意一值；培養(yǎng)溫度也可以是-30°C中的任意一值，每24h補(bǔ)甲醇的濃度也可以是0.5%-1%中的任意一值。通過(guò)電泳證明這些條件下也可以完成誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的LeEXP2基因表達(dá)。BMGY培養(yǎng)基為酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%酵母氮基，IOOmM磷酸鉀，乜10-5%生物素，甘油，余量為水。BMMY培養(yǎng)基為酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%酵母氮基，IOOmM磷酸鉀，4xl0_5%生物素，0.5%-1%甲醇，余量為水。上樣緩沖液為15.lg/L的Tris，94g/L甘氨酸；5.Og/L十二烷基硫酸鈉(SDS)，余量為水。實(shí)施例6LeEXP2提高纖維素酶降解濾紙的效率用實(shí)施例5的方法誘導(dǎo)巴斯德畢赤酵母宿主菌X33和重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCNO.4123(簡(jiǎn)稱重組菌L15)，當(dāng)誘導(dǎo)第六天時(shí)，分別取巴斯德畢赤酵母宿主菌X33和重組菌L15分泌表達(dá)的培養(yǎng)基2毫升，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘后，取1.5ml上清與50mg的新華濾紙條在25ml具塞試管中室溫下溫浴48h，再加入0.5ml的7U/L纖維素酶(SigmaAldrich公司)液進(jìn)行反應(yīng)，50°C水浴Ihr后，每管加入!BmlDNS溶液，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫后定容至25ml，測(cè)定OD540的值，依據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定釋放的葡萄糖的量(葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法如下分別將2毫升濃度為0，0.5，1，1.5,2.0,2.5,3.0.3.5,4.Omg/ml的葡萄糖溶液與3毫升DNS混勻，沸水浴加熱5min，冷卻至室溫后定容至25ml，測(cè)定OD54tl的值，以濃度為橫坐標(biāo)，以各OD54tl的值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線)。重組菌L15的培養(yǎng)基中含有LeEXP2蛋白，其與纖維素酶作用濾紙產(chǎn)生的還原糖是1.34mg；而對(duì)照巴斯德畢赤酵母宿主菌X33的培養(yǎng)基中未有LeEXP2分泌，與纖維素酶作用濾紙產(chǎn)生的還原糖是0.88mg。重組菌L15誘導(dǎo)表達(dá)的LeEXP2與纖維素酶協(xié)同作用濾紙產(chǎn)糖是纖維素酶單獨(dú)作用的1.52倍。所述的DNS試劑成份如下在1升DNS溶液中含IOg的3,5-二硝基水楊酸，IOgNa0H，200g的酒石酸鉀鈉，2g的苯酚，5g的NaHSO3，余量為水。將重組菌L7，L9，L10,Lll,L12，L13，L14或L16采用本實(shí)施例的方法進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，并證明LeEXP2協(xié)同纖維素酶降解濾紙纖維素比纖維素酶單獨(dú)作用強(qiáng)。該試驗(yàn)說(shuō)明了LeEXP2能提高纖維素酶降解纖維素材料-濾紙的效率。權(quán)利要求1.一種含有番茄LeEXP2基因的重組載體，其特征是用下述方法構(gòu)建(1)提取番茄的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，用序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出序列表中SEQIDNO.3所示的744bp的LeEXP2基因，連接至TA載體pGEM_T，獲得含有番茄LeEXP2基因的質(zhì)粒pGEM-LeEXP2；(2)LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體以所述質(zhì)粒pGEM_LeEXP2為模板，以序列表中SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示核苷酸序列為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得序列表中SEQIDNO.6所示的703bp片段，將所述703bp片段經(jīng)TA克隆連至pGEM_T載體，命名為pTLeEXP2；提取質(zhì)粒pTLeEXP2和巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIChlphaA質(zhì)粒，用EcoRI和^CbaI同時(shí)酶切pTLeEXP2和pPIChlphaA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切pTLeEXP2得到SEQIDNO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalphaA得到的SEQIDNO.8所示的3530bp片段；回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10F'的感受態(tài)細(xì)胞中，涂含kocin25μg/mL的LB平板，培養(yǎng)12_1他，得到含pPIChlphaA_LeEXP2質(zhì)粒的大腸桿菌，提取大腸桿菌中pPIChlphaA-LeEXP2質(zhì)粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重組載體。2.一種含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌，其特征是用下述方法獲得將10-15μg的權(quán)利要求1所述pPICZalphaA_LeEXP2質(zhì)粒，用PmeI酶切成SEQIDN0.9所示的4219bp片段，乙醇沉淀SEQIDN0.9所示的線性DNA片段，干燥所述線形DNA片段后溶于無(wú)菌水，制成濃度為0.5-1μg/μL的線形DNA溶液；將80μL巴斯德畢赤酵母宿主菌Χ33的感受態(tài)細(xì)胞與10μL的0.5-1Ug/μL的線形DNA溶液混合勻后轉(zhuǎn)移到0_4°C預(yù)冷的電極杯中，冰浴5min，1500V電擊5ms，電擊后加入ImL冰冷的IM山梨醇水溶液到電轉(zhuǎn)杯中，混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，28-30°C靜置培養(yǎng)l_2h，在含100μg/mLkocin的YPD平板上涂50μL-200μL培養(yǎng)后的混合液，30°C倒置培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)，PCR鑒定菌落，PCR結(jié)果為陽(yáng)性的菌落為含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)，其中的重組巴斯德畢赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCNO.4123為保藏菌種。3.番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的誘導(dǎo)表達(dá)，其特征是包括下述步驟①將權(quán)利要求2所述含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌和巴斯德畢赤酵母宿主菌X33分別接種在2-;3mlpH=4.8的BMGY中預(yù)培養(yǎng)，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)至OD6tltl=2-6；②按1100的體積比分別將步驟①的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至25mlBMGY培養(yǎng)基中，200-250轉(zhuǎn)/分鐘，28-30°C培養(yǎng)至OD600=2-6；③將步驟②培養(yǎng)的菌液分別轉(zhuǎn)接加入至50mlpH=4.8的含體積濃度為0.5%-1%甲醇的BMMY培養(yǎng)基中，使菌液的濃度OD6tltl=0.8-1.5；在200-250轉(zhuǎn)/分鐘，搖床中培養(yǎng)，每24h補(bǔ)甲醇至0.5%-1%，誘導(dǎo)LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的表達(dá)。全文摘要本發(fā)明公開了含有番茄LeEXP2基因的重組載體及重組菌及LeEXP2基因在重組菌中的表達(dá)，本發(fā)明首先從番茄中克隆了LeEXP2基因；進(jìn)一步將LeEXP2基因構(gòu)建至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體；通過(guò)電轉(zhuǎn)化獲得一種含有番茄LeEXP2基因的重組巴斯德畢赤酵母菌；誘導(dǎo)番茄LeEXP2基因在重組巴斯德畢赤酵母菌中的表達(dá)；本發(fā)明的重組菌能有效地表達(dá)目的蛋白LeEXP2。克服了現(xiàn)有技術(shù)從植物中純化出膨脹素的量有限，無(wú)法大量應(yīng)用到纖維素降解中，自然界中有諸多的廢棄的木質(zhì)纖維素，本發(fā)明獲得的LeEXP2蛋白能提高纖維素酶降解纖維素的效率，對(duì)清潔有效的利用廢棄的纖維素生產(chǎn)能源，解決當(dāng)前能源危機(jī)具有極其重要意義。文檔編號(hào)C12N1/19GK102286520SQ20111016131公開日2011年12月21日申請(qǐng)日期2011年6月16日優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日發(fā)明者井欣,張敏華,張?chǎng)H,洪解放,鄒少蘭,馬媛媛申請(qǐng)人:天津大學(xué)