專利名稱：一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系的建立方法，尤其涉及一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞具有自我更新能力，在一定的誘導(dǎo)條件下，可分化為具有特殊功能的細(xì)胞。 在過去十幾年間，分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的成功為基礎(chǔ)研究和細(xì)胞移植治療提 供了新的機(jī)遇。然而社會(huì)及倫理問題制約了 ES細(xì)胞的研究及應(yīng)用。此外，體外培養(yǎng)ES細(xì)胞面臨 著極大的技術(shù)挑戰(zhàn)，ES細(xì)胞的培養(yǎng)需要飼養(yǎng)層及昂貴的細(xì)胞因子，且在體外培養(yǎng)過程中常 會(huì)發(fā)生基因組突變。更重要的是ES細(xì)胞體外移植后可能形成腫瘤，目前尚無(wú)解決辦法。而 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)等成體干細(xì)胞分離培養(yǎng)后數(shù)量有限，體外增殖分化能力有待進(jìn)一 步證明。因此，很多研究者都在嘗試尋找新的干細(xì)胞來源，試圖建立一種干細(xì)胞系，既具有 增殖速度快，體外分化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，又?jǐn)[脫倫理道德問題。人的羊水應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，已 經(jīng)有七十多年的歷史。2003年，Prusa等在羊水中發(fā)現(xiàn)Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞，提示羊水中可能存 在多能干細(xì)胞(Prusa AR,Marton E, Rosner M, et al. Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid -.a new source for stem cellresearch ？ Hum Reprod, 2003,18 (7) 1489-1493)。2006年11月舉行的美國(guó)心臟協(xié)會(huì)會(huì)議上，瑞士蘇黎世大學(xué)的Dr。Simon宣布， 他們首次用取自羊水的干細(xì)胞培育出人的心臟瓣膜。2007年，Paolo等報(bào)道，在人的孕中 期羊水中分離得到具有ES樣干細(xì)胞特性的多能細(xì)胞，將其命名為人羊水源干細(xì)胞(human AmnioticFluid Stem Cell, hAFS) [Paolo DC，2007。這種細(xì)胞可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)(超 過2年)并保持未分化狀態(tài)，表達(dá)ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞標(biāo)記基因，體外誘導(dǎo)可分化為包括 外胚層、中胚層和內(nèi)胚層等三個(gè)胚層的各種細(xì)胞，從而表明其具有多能性。像ES細(xì)胞一樣， AFS細(xì)胞可在體外存活幾年，而普通的體細(xì)胞在體外只會(huì)存活一段時(shí)間，隨后便會(huì)死亡。AFS 細(xì)胞表達(dá)Oct-4，且表達(dá)部分ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞標(biāo)記，因此，研究人員認(rèn)為，AFS細(xì)胞處于 ES細(xì)胞和成體干細(xì)胞的中間狀態(tài)。AFS細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為，與成體干細(xì)胞相比容易獲取，具 有較強(qiáng)的分化潛能；于胚胎干細(xì)胞相比AFS細(xì)胞的免疫原性較低，更適用于細(xì)胞移植等研 究。AFS細(xì)胞可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源，深入研究AFS細(xì)胞的分化機(jī)制，建 立和完善AFS細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，國(guó)外學(xué)者多采用免疫磁珠分選法篩選羊水干細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞活性有一定影響， 且費(fèi)用較高(Paolo DC, Georg BJ, Anthony A, et al. Isolation of amnioticstem cell lines with potential for therapy [J]. Nat Biotechnol，2007，25 (1) : 100 106.)。國(guó)內(nèi) 學(xué)者多采用簡(jiǎn)單的直接原代貼壁方法(劉慧，劉大慶，閆志風(fēng)，李寶偉，管利東，岳文，呂陽(yáng)， 裴雪濤，李亞里.孕足月羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009， 13(14) =2733-2737.)，或機(jī)械挑選克隆的方法分離羊水細(xì)胞(李現(xiàn)鐸，耿紅全，朱哲，等孕 中期羊水來源胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究。中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86 =4812483) 0但分選出的細(xì)胞群里含有羊水特異性細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞等其他類型的細(xì)胞， 其純度很低，且細(xì)胞的增殖能力有限，多次傳代后數(shù)量減少，體外僅能擴(kuò)增傳代10代左右。 目前國(guó)內(nèi)尚沒有人建立穩(wěn)定的羊水干細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種快速、有效、安全、 可實(shí)現(xiàn)人羊水干細(xì)胞體外長(zhǎng)期擴(kuò)增、可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源以及有望作 為種子細(xì)胞進(jìn)行臨床應(yīng)用的人羊水干細(xì)胞系的建立方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明提供了一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特 殊之處在于該方法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化；3)將分離純化后的羊水干細(xì)胞建立羊水干細(xì)胞單克隆，后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立羊 水干細(xì)胞系，其具體實(shí)現(xiàn)方式是3. 1)取初步純化的細(xì)胞制成懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)測(cè)定活細(xì)胞濃度；3. 2)用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋成不同濃度，并于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培 養(yǎng)基成份為α -MEM+15% FBS+2%谷胺酰胺+1%青鏈霉素；3. 3)待細(xì)胞貼壁后，顯微鏡下觀察挑選并標(biāo)記只含一個(gè)細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)；3.4)培養(yǎng)期間，根據(jù)培養(yǎng)液中pH值的變化情況判斷是否有明顯單克隆出現(xiàn)。若 有，則用0. 05%胰蛋白酶+0. 02% EDTA消化單克隆細(xì)胞，分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；若否，則放棄 培養(yǎng)，不再繼續(xù)換液；3. 5)待細(xì)胞達(dá)到70% -90%融合時(shí)，傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，此時(shí)得到的細(xì) 胞經(jīng)連續(xù)傳代40代以上，即建成羊水干細(xì)胞系。上述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是1. 1)從醫(yī)院婦產(chǎn)科收集孕中期及孕晚期羊水，4°C保存帶回備用；1. 2)用200目濾紗過濾，以除去較大的組織碎片，然后lOOOr/min，離心6min，棄上 清，收集細(xì)胞；1.3)將步驟2)中所收集的細(xì)胞加入含有雙抗的PBS (_)溶液，混勻，置37°C處 理lOmin，然后離心，收集細(xì)胞，重復(fù)用雙抗PBS(-)溶液處理3次。上述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是2. 1)將分離出的羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱 中，并記錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)量；2.2)培養(yǎng)4 12d后，在倒置顯微鏡下觀察并繪制所需細(xì)胞生長(zhǎng)情況；2. 3)用細(xì)胞刮刀在生長(zhǎng)有上皮樣細(xì)胞類型的區(qū)域進(jìn)行反復(fù)推刮，使細(xì)胞脫落，并 小心不要刮到標(biāo)記的區(qū)域；2. 4)用雙抗PBS (-)溶液沖洗2 3遍，補(bǔ)加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2. 5)當(dāng)再次觀察到培養(yǎng)皿中有不需要的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，仍用上述方法處理，如此反 復(fù)2 3次，細(xì)胞可得到初步純化；2. 6)連續(xù)培養(yǎng)5 8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90%以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞。上述步驟2. 2)中，是培養(yǎng)4 5d后，在倒置顯微鏡下觀察并繪制所需細(xì)胞生長(zhǎng)情 況。上述原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液是含有a -MEM+10% FBS+20% ChangMedium+1 %谷胺酰 胺+1%青鏈霉素的培養(yǎng)液。上述步驟2. 6)中AFS細(xì)胞培養(yǎng)液的成份為a -MEM+10% FBS+1 %谷胺酰胺+1 %青
鏈毒素。上述步驟3. 1)中，是取第一至十代初步純化的細(xì)胞制成懸液。上述步驟3. 1)中，是取第六代初步純化的細(xì)胞制成懸液。上述步驟3. 1)中，是取第六代初步純化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、快速、有效、安全。本發(fā)明采用采用原代貼壁法和機(jī)械分離法，分離純化了人羊 水干細(xì)胞，并建立一種快速、有效、安全的人羊水干細(xì)胞分離方法。2、可實(shí)現(xiàn)了人羊水干細(xì)胞體外長(zhǎng)期擴(kuò)增。依照本發(fā)明所提供的人羊水干細(xì)胞系的 建立方法，可利用不同濃度FBS和KSR的培養(yǎng)體系，不需滋養(yǎng)層細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了人羊水干細(xì)胞 體外長(zhǎng)期擴(kuò)增，傳45代凍存，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表明，分離的hAFS細(xì)胞傳至35代后核型 正常，已凍存1 1. 5xl08個(gè)種子細(xì)胞，其性能穩(wěn)定，遺傳性狀良好。并且經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、 RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)鑒定表明，所分離的人羊水干細(xì)胞表達(dá)HLA-ABC，弱表達(dá)HLA-DR ；表達(dá) ES 細(xì)胞標(biāo)志基因 0ct-4、hTERT、Nanog、SSEA-l、SSEA-4 和 CD117，不表達(dá) SSEA-3 ；表達(dá)間質(zhì) 細(xì)胞標(biāo)志基因CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等；不表達(dá)CD34、CD45和CD133等造血細(xì)胞 系標(biāo)志基因。經(jīng)堿性磷酸酶活性檢測(cè)，形成的類胚體呈陽(yáng)性，RT-PCR分析表明具有分化為 三胚層來源的各種細(xì)胞的潛能。3、可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源。本發(fā)明根據(jù)建立細(xì)胞系的要求按細(xì) 胞系的定義成功的建立了人羊水干細(xì)胞系，可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源，不 僅避免了胚胎干細(xì)胞的倫理爭(zhēng)論，而且為今后干細(xì)胞研究開辟了新方向，有望作為種子細(xì) 胞進(jìn)行臨床應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法，該方法包括以下步驟1、羊水干細(xì)胞分離步驟從醫(yī)院婦產(chǎn)科收集孕中期及孕晚期羊水，詳細(xì)記錄懷孕 時(shí)間、羊水外觀、羊水體積及離心后細(xì)胞團(tuán)塊的大小等相關(guān)資料，4°C保存帶回實(shí)驗(yàn)室。先 用200目濾紗過濾，以除去較大的組織碎片，然后lOOOr/min，離心6min，棄上清，收集細(xì)胞。 再加入含有雙抗的PBS(-)溶液，混勻，置37°C處理lOmin，然后離心，收集細(xì)胞，重復(fù)用 1 %雙抗PBS (-)溶液處理3次。2、羊水干細(xì)胞培養(yǎng)步驟1)將前一步分離出的羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng) 液，培養(yǎng)基配方為a -MEM+10% FBS+20% Chang Medium+1 %谷胺酰胺+1%青鏈霉素；于 37°C,5% C02培培養(yǎng)箱中進(jìn)行，并記錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)量。倒置顯微鏡下 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況培養(yǎng)4 12d后細(xì)胞貼壁，可觀察到培養(yǎng)皿中出現(xiàn)上皮樣、成纖維樣細(xì) 胞的生長(zhǎng)區(qū)域，在鏡下觀察并畫出所需細(xì)胞的區(qū)域。用細(xì)胞刮刀在生長(zhǎng)有上皮樣細(xì)胞類型的區(qū)域進(jìn)行反復(fù)推刮，使細(xì)胞脫落，并小心不要刮到標(biāo)記的區(qū)域，以達(dá)到純化細(xì)胞的目的。 用雙抗PBS(-)溶液沖洗2 3遍，補(bǔ)加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)再次觀察到培養(yǎng)皿中有不需要 的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，仍用上述方法處理，如此反復(fù)2 3次，細(xì)胞可得到初步純化。連續(xù)培養(yǎng)5 8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90%以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞。3、羊水干細(xì)胞單克隆的建立3. 1)取第六代初步純化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)測(cè)定活 細(xì)胞濃度。十代以內(nèi)的代數(shù)均可行，如果高于十代次，則分離效果降低。一般代數(shù)越低越 好，比如第一代至第十代初步純化的細(xì)胞制成懸液都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的人羊水干細(xì) 胞系的建立方法。3. 2)將細(xì)胞懸液在試管中稀釋，用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至50個(gè)細(xì)胞/mL、20個(gè)細(xì)胞 /mL、10個(gè)細(xì)胞/mL，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0. lmL,分別補(bǔ)加 0. lmL培養(yǎng)液，于37°C、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。這里的培養(yǎng)基成份為a -MEM+15% FBS+2% 谷胺酰胺+1%青鏈霉素，即在AFS細(xì)胞培養(yǎng)液(ACM)的基礎(chǔ)上，將FBS (胎牛血清)的濃度 增加到15%，并將谷氨酰胺的濃度提高到2%。3. 3)三日后，待細(xì)胞貼壁，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù)，挑選只含 一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記繼續(xù)培養(yǎng)。3. 4)培養(yǎng)期間，根據(jù)培養(yǎng)液中PH值的變化情況判斷是否有明顯單克隆出現(xiàn)。若 有，則用0. 05%胰蛋白酶+0. 02% EDTA消化單克隆細(xì)胞，分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；若否，則放棄 培養(yǎng)，不再繼續(xù)換液；當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)4-7天左右，孔中有明顯克隆出現(xiàn)，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面的 1/3 1/2，用胰酶消化法將96孔中的單克隆的細(xì)胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；若 有單克隆出現(xiàn)就用0. 05%胰蛋白酶+0. 02% EDTA消化單克隆細(xì)胞，分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；出 現(xiàn)一個(gè)以上的克隆以及沒有出現(xiàn)克隆的孔，則放棄培養(yǎng)，不再繼續(xù)換液；根據(jù)PH值的變化 (即觀察培養(yǎng)液的顏色變化)決定換液，當(dāng)PH值變化時(shí)，必須換液，因?yàn)榧?xì)胞只能在一定的 PH值下生長(zhǎng)，否則細(xì)胞會(huì)死亡或衰老。同時(shí)，經(jīng)常換液也會(huì)使細(xì)胞健康生長(zhǎng)。3. 5)待細(xì)胞達(dá)到70% —90%融合時(shí)，傳至35mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。此時(shí)得 到的細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代后，即羊水干細(xì)胞系。采用上述方法培養(yǎng)后，有58/192孔中見細(xì)胞生長(zhǎng)，其中呈單克隆生長(zhǎng)者有8孔。 大部分孔中的單個(gè)細(xì)胞不分裂或分裂成2個(gè)細(xì)胞后，其形態(tài)逐漸變大，類似神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)， 并漸漸伸出許多突起。其中呈單克隆生長(zhǎng)的細(xì)胞待其覆蓋至96孔底時(shí)，轉(zhuǎn)移至24孔板或 35mm培養(yǎng)皿中擴(kuò)增培養(yǎng)，建立各個(gè)單克隆亞細(xì)胞系。在亞克隆及擴(kuò)增培養(yǎng)的過程中，有一株細(xì)胞成功傳代命名為WHcs-07，該細(xì)胞系目 前已傳至45代。根據(jù)本發(fā)明所述原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)基成為a -MEM+10 % FBS+20 % ChangMedium+1%谷胺酰胺+1%青鏈霉素。根據(jù)本發(fā)明所述AFS細(xì)胞培養(yǎng)液(ACM)培養(yǎng)基成份為a -MEM+10 % FBS+1 %谷胺 酰胺+1%青鏈霉素。對(duì)上述細(xì)胞分別采用有血清及無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 90%融 合時(shí)，則進(jìn)行傳代，加入AFS細(xì)胞培養(yǎng)液(ACM)繼續(xù)培養(yǎng)。將一株細(xì)胞傳至45代，形態(tài) 仍為成纖維樣，呈漩渦狀、放射狀排列，并凍存大量種子細(xì)胞；該類細(xì)胞第5、10、15代群體倍增時(shí)間分別為33、34、39h測(cè)定了其生長(zhǎng)曲線；AFS細(xì)胞培養(yǎng)液(ACM)培養(yǎng)基成份為 a -MEM+10% FBS+1%谷胺酰胺+1%青鏈霉素。 經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)鑒定表明，所分離的人羊水干細(xì)胞表達(dá) HLA-ABC,弱表達(dá) HLA-DR ；表達(dá) ES 細(xì)胞標(biāo)志基因 0ct_4、hTERT、Nanog、SSEA-1、SSEA-4 和 ⑶117，不表達(dá)SSEA-3，證明其具有與ES細(xì)胞類似的分化潛能；表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因 CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等；不表達(dá)CD34、CD45和CD133等造血細(xì)胞系標(biāo)志基因， 具有成體干細(xì)胞的許多特性。
權(quán)利要求
一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離純化；3)將分離純化后的羊水干細(xì)胞建立羊水干細(xì)胞單克隆，后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立羊水干細(xì)胞系，其具體實(shí)現(xiàn)方式是3.1)取初步純化的細(xì)胞制成懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)測(cè)定活細(xì)胞濃度；3.2)用培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋成不同濃度，并于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)基成份為α MEM+15％FBS+2％谷胺酰胺+1％青鏈霉素；3.3)待細(xì)胞貼壁后，顯微鏡下觀察挑選并標(biāo)記只含一個(gè)細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)；3.4)培養(yǎng)期間，根據(jù)培養(yǎng)液中pH值的變化情況判斷是否有明顯單克隆出現(xiàn)。若有，則用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化單克隆細(xì)胞，分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；若否，則放棄培養(yǎng)，不再繼續(xù)換液；3.5)待細(xì)胞達(dá)到70％ 90％融合時(shí)，傳至培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，此時(shí)得到的細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代40代以上，即建成羊水干細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟1)的具 體實(shí)現(xiàn)方式是1. 1)從醫(yī)院婦產(chǎn)科收集孕中期及孕晚期羊水，4°c保存帶回備用；1.2)用200目濾紗過濾，以除去較大的組織碎片，然后lOOOr/min，離心6min，棄上清， 收集細(xì)胞；1.3)將步驟2)中所收集的細(xì)胞加入含有雙抗的PBS(-)溶液，混勻，置37°C處理 lOmin，然后離心，收集細(xì)胞，重復(fù)用雙抗PBS(-)溶液處理3次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟2)的具 體實(shí)現(xiàn)方式是2.1)將分離出的羊水細(xì)胞加入原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中，并 記錄原代細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁細(xì)胞數(shù)量；2. 2)培養(yǎng)4 12d后，在倒置顯微鏡下觀察并繪制所需細(xì)胞生長(zhǎng)情況；2. 3)用細(xì)胞刮刀在生長(zhǎng)有上皮樣細(xì)胞類型的區(qū)域進(jìn)行反復(fù)推刮，使細(xì)胞脫落，并小心 不要刮到標(biāo)記的區(qū)域；2. 4)用雙抗PBS (-)溶液沖洗2 3遍，補(bǔ)加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；2.5)當(dāng)再次觀察到培養(yǎng)皿中有不需要的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，仍用上述方法處理，如此反復(fù) 2 3次，細(xì)胞可得到初步純化；2. 6)連續(xù)培養(yǎng)5 8代后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少消失，90%以上表現(xiàn)為成纖維樣細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟2.2) 中，是培養(yǎng)4 5d后，在倒置顯微鏡下觀察并繪制所需細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述原代羊水細(xì) 胞培養(yǎng)液是含有a-MEM+10% FBS+20% Chang Medium+1 %谷胺酰胺+1 %青鏈霉素的培養(yǎng) 液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟2.6)中 AFS細(xì)胞培養(yǎng)液的成份為α -MEM+10% FBS+1%谷胺酰胺+1%青鏈霉素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征 在于所述步驟3. 1)中，是取第一至十代初步純化的細(xì)胞制成懸液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟3.1) 中，是取第六代初步純化的細(xì)胞制成懸液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的人羊水干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于所述步驟3.1) 中，是取第六代初步純化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人羊水干細(xì)胞系的建立方法，該方法包括以下步驟1)羊水干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)；2)將分離培養(yǎng)的原代羊水干細(xì)胞進(jìn)行分離純化；3)將分離得到的羊水干細(xì)胞經(jīng)過單克隆篩選和擴(kuò)增培養(yǎng)，建立羊水干細(xì)胞系。本發(fā)明提供了一種快速、有效、安全、可實(shí)現(xiàn)人羊水干細(xì)胞體外長(zhǎng)期擴(kuò)增、可為組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來源以及有望作為種子細(xì)胞進(jìn)行臨床應(yīng)用的人羊水干細(xì)胞系的建立方法。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101928694SQ20091002304
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者王華巖, 王晗, 竇忠英, 陳帥 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)