背景技術(shù)：
臍帶成體干細(xì)胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多能干細(xì)胞，既不同于臍帶血干細(xì)胞(造血干細(xì)胞，應(yīng)用之前必需配型)也不同于胎盤來源干細(xì)胞(胎盤壁蛻膜干細(xì)胞，來源于胚胎發(fā)育中胚層的亞全能干細(xì)胞)。臍帶由胚胎羊膜包卷著卵黃囊的伸長部共同形成,包含了較為幼稚及趨于成熟的成體干細(xì)胞成分。臍帶作為胚胎發(fā)育過程中維系母體和胎兒氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)交換的暫時性通道，在胎兒出生后即完成使命,成為“廢棄”物,對其研究不會涉及倫理學(xué)爭議問題。臍帶成體干細(xì)胞能分化成許多種組織細(xì)胞，應(yīng)用無需配型，具備通用性潛能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。臍帶作為干細(xì)胞來源的優(yōu)點(diǎn)：1.采集過程簡單、取材使用方便，不影響母子健康，無痛苦；2.基因變異的可能性小，數(shù)量豐富，分化能力較強(qiáng)；3.具有較高的分化潛能，可向多個方向進(jìn)行分化，同時不產(chǎn)生腫瘤,在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面應(yīng)用廣闊；4.增殖能力優(yōu)于骨髓干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞，且免疫原性比骨髓干細(xì)胞低,比胎盤干細(xì)胞更具通用性。因此越來越受到研究工作者們的關(guān)注。

腫瘤特別是惡性腫瘤發(fā)病率日益增高,且傳統(tǒng)治療如手術(shù)、放療、化療難以徹底清除殘存的腫瘤細(xì)胞,特別是腫瘤干細(xì)胞，導(dǎo)致其治愈率低,復(fù)發(fā)率和病死率高，成為當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康的最大敵人。腫瘤的防治就顯得極為迫切。腫瘤由大量普通腫瘤細(xì)胞與少量的腫瘤干細(xì)胞構(gòu)成，腫瘤干細(xì)胞的運(yùn)動和遷徙能力又使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能；抗癌劑及放射治療容易殺滅普通腫瘤細(xì)胞，但是對于殺滅腫瘤干細(xì)胞效果欠佳。況且越來越多研究表明腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)才是腫瘤形成的起始細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移的先鋒細(xì)胞，同時也為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。腫瘤干細(xì)胞通過不斷的自我更新和適應(yīng)性進(jìn)化維持著腫瘤細(xì)胞群無限增殖的生命力。且容易誘導(dǎo)病人對腫瘤產(chǎn)生多重免疫麻痹，促使宿主自身免疫系統(tǒng)不能有效地清除腫瘤干細(xì)胞。當(dāng)今腫瘤防治技術(shù)方法并不少，且均有一定的作用，但遠(yuǎn)期效果都欠佳，究其根本原因就在于這些方法只能夠消滅普通腫瘤細(xì)胞，卻難以徹底清除腫瘤干細(xì)胞。因此，腫瘤往往在常 規(guī)抗腫瘤療法消滅大部分普通腫瘤細(xì)胞后一段時間復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。因而，很有必要設(shè)計一些定向清除腫瘤干細(xì)胞的新技術(shù)來防治發(fā)病率與日俱增的人類腫瘤，尤其是能刺激宿主打破對腫瘤干細(xì)胞多重免疫麻痹的新策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，打破在腫瘤形成過程中與腫瘤建立后宿主對腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生多重免疫麻痹以及腫瘤對放化療的耐受，從而阻止腫瘤的發(fā)展與演進(jìn)，設(shè)計出定向腫瘤干細(xì)胞的新策略：X射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑及制備與應(yīng)用。

臍帶成體干細(xì)胞介于較為幼稚的胚胎及趨于成熟的成體干細(xì)胞之間，是比骨髓干細(xì)胞更為原始的祖細(xì)胞。研究表明臍帶成體干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞在抗原表達(dá)、分化潛能等生物學(xué)特性具有極大的相似性：(1)高表達(dá)腫瘤胚胎發(fā)生抗原，包括免疫原性與反應(yīng)原性，二者之間可能具有交叉免疫性，(2)無限增殖潛能，(3)自我分化潛能(4)逃逸免疫系統(tǒng)的識別，(5)誘導(dǎo)血管生長因子的產(chǎn)生。特別是X射線輻照的臍帶成體干細(xì)胞3D微球制劑。

本發(fā)明的任務(wù)是這樣實(shí)現(xiàn)的：射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑，是在2ml的凍存管中保存有培養(yǎng)5代后的160Gy X射線輻照修飾的臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑，干細(xì)胞3D微球?yàn)?×10³個，球直徑為100-120μm，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于－196℃液氮中保存待用。

上述射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑的制備方法：其操作是在無菌條件下分為以下六個步驟制備：1.處理臍帶組織，2.分離臍帶成體干細(xì)胞，3.臍帶成體干細(xì)胞的貼壁擴(kuò)大培養(yǎng)，4.臍帶成體干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)體系中轉(zhuǎn)化成3D微球，球直徑為100-120μm，5.3D微球接受160Gy X射線輻照修飾，6.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑的制備。

本發(fā)明的射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑在制備藥物中的應(yīng)用，制備對腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生直接作用而達(dá)到抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與演進(jìn)，作為一種廣譜抗腫瘤制劑藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球制劑的使用選擇在腫瘤發(fā)生之后，選擇最常見的腫瘤：肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌為治療模型，注射部位選擇腫瘤對側(cè)方皮下，為打破腫瘤免疫逃逸機(jī)制，首次免疫治療10天后再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫治療。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.該抗腫瘤制劑采用射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球制作，一方面提 高了干細(xì)胞的免疫原性使宿主對腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生有效的致敏淋巴細(xì)胞與免疫抗體，誘導(dǎo)機(jī)體對腫瘤產(chǎn)生特異性殺傷作用,產(chǎn)生特異性抗腫瘤的體液與細(xì)胞免疫；另一方面還激活了NK和CD8⁺T細(xì)胞，分泌TNF-α、IFN-γ等多種細(xì)胞因子,以非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮非特異性的抗腫瘤作用，兩條抗腫瘤途徑相輔相成，從根源上抑制腫瘤干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖成瘤、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。治療上采用10天間斷性方案，首次治療10天后進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫治療，最大限度打破機(jī)體對腫瘤的免疫耐受，起到促使腫瘤消退的作用；

2.具有廣譜的抗腫瘤效果，抑制多種腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移，延長荷瘤宿主的生存期；

3.X射線輻照對臍帶成體干細(xì)胞3D微球的免疫原性起到持久的保護(hù)作用，長效刺激機(jī)體，防止宿主產(chǎn)生免疫麻痹，激發(fā)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)；

4.臍帶成體干細(xì)胞3D微球來自正常細(xì)胞，作為細(xì)胞治療制劑，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證不存在體內(nèi)成瘤的安全問題；

5.臍帶取材方便，無痛苦，少污染，不涉及倫理道德問題。

6.該生物制劑來自臍帶，資源豐富，制備簡便，成本低廉，具有大規(guī)模工程化培養(yǎng)的可能，為腫瘤干細(xì)胞精準(zhǔn)生物治療提供潛在的理想資源。

附圖說明 以下是本發(fā)明說明書附圖的圖面說明：

圖1是本發(fā)明(A)腫瘤干細(xì)胞(CSCs,CD133⁺)，(B)骨髓干細(xì)胞(BSCs)，(C)單純臍帶成體干細(xì)胞(USCs)，(D)臍帶成體干細(xì)胞3D微球,(E)臍帶成體干細(xì)胞3D微球接受射線輻照與(F)射線輻照修飾后臍帶成體干細(xì)胞3D微球(R-USC-Sph)顯微相差比較。

圖2是本發(fā)明對肺癌的臍帶成體干細(xì)胞3D微球治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用臍帶成體干細(xì)胞治療后部分腫瘤發(fā)展受抑制，尤其是射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑(R-USC-Sph,即本發(fā)明制劑)治療組大部分宿主的腫瘤明顯趨向消退，最終無瘤生存率顯著高于對照組。

圖3是本發(fā)明對乳腺癌的臍帶成體干細(xì)胞3D微球治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用臍帶成體干細(xì)胞治療后腫瘤發(fā)展明顯慢于對照組，尤其是本發(fā)明制劑治療組(R-USC-Sph)大部分宿主的腫瘤明顯縮小至完全消退。

圖4是本發(fā)明對肝癌的臍帶成體干細(xì)胞3D微球治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用臍帶成體干細(xì)胞治療后腫瘤發(fā)展明顯延緩，尤其是本發(fā)明制劑治療組(R-USC-Sph)大部分荷瘤宿主的腫瘤基本完全消退。

圖5是本發(fā)明對結(jié)腸癌的臍帶成體干細(xì)胞3D微球治療模型療效比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用臍帶成體干細(xì)胞治療后腫瘤體積明顯小于對照組，尤其是本發(fā)明制劑治療組(R-USC-Sph)大部分荷瘤宿主的腫瘤完全消退。

圖6是本發(fā)明對腫瘤轉(zhuǎn)移指數(shù)的作用比較，實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用臍帶成體干細(xì)胞治療后腫瘤轉(zhuǎn)移明顯少于對照組，尤其是本發(fā)明制劑治療組(R-USC-Sph)大部分荷瘤宿主的腫瘤轉(zhuǎn)移指數(shù)趨向0％。

圖7是本發(fā)明制劑注射后抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖:與對照組(Control)、骨髓干細(xì)胞組(BSCs)及單純臍帶成體干細(xì)胞組(USCs)相比，免疫熒光顯示射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球(R-USC-Sph，本發(fā)明制劑)治療組的腫瘤組織中活化NK細(xì)胞(NK-1⁺)明顯增多，同時腫瘤干細(xì)胞(MUC-1⁺)明顯凋亡(A)，本發(fā)明制劑治療組(R-USC-Sph)活化NK細(xì)胞明顯多于其它各組(B)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。同時腫瘤組織內(nèi)腫瘤干細(xì)胞明顯少于其它各組(C)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

圖8是本發(fā)明制劑注射后增加細(xì)胞和體液免疫活性：與對照組(Control)、骨髓干細(xì)胞組(BSCs)，及單純臍帶成體干細(xì)胞組(USCs)相比，本發(fā)明制劑(R-USC-Sph)注射后增加淋巴細(xì)胞分泌干擾素與白介素-4。Elispot分析顯示本發(fā)明制劑治療組體內(nèi)淋巴細(xì)胞分泌的干擾素-γ(IFN-γ，介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫)及白介素-4(IL-4,介導(dǎo)抗腫瘤體液免疫)高于對照組,尤其是IFN-γ顯著增高，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

具體實(shí)施方式 本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例和說明書附圖作進(jìn)一步詳述：

實(shí)施例1.一種射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑是在2ml的凍存管中保存有培養(yǎng)5代后的160Gy X射線輻照修飾的臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑(參見說明書附圖1)，干細(xì)胞3D微球?yàn)?×10³個，球直徑為100-120μm，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于－196℃液氮中保存待用。

實(shí)施例2.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑的制備：于無菌條件下制備上述干細(xì)胞活制劑，共分為以下六個步驟：(1)處理臍帶組織，(2)分離臍帶成體干細(xì)胞，(3)臍帶成體干細(xì)胞的貼壁擴(kuò)大培養(yǎng)，(4)臍帶成體干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)體系中轉(zhuǎn)化成3D微球，球直徑為100-120μm，(5)3D微球接受160Gy X射線輻照修飾，(6)射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑的制備，詳述如下：

(1)處理臍帶組織：足月生產(chǎn)的臍帶組織，捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書,并 經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會同意,將臍帶組織剪碎成1cm×1cm×1cm大小,5倍于臍帶組織體積的D-Hank’s平衡鹽液沖洗3次后收集臍帶組織小塊；

(2)分離臍帶成體干細(xì)胞：將臍帶組織小塊以比例每1ml臍帶組織小塊加入5ml 0.2％膠原酶液,37℃消化50min,消化終止后用200目濾網(wǎng)過濾,收集單細(xì)胞,在收集到的單細(xì)胞中以比例1ml細(xì)胞體積加入3～5ml紅細(xì)胞裂解液，4℃水浴5min以去除紅細(xì)胞，再以5倍于臍帶細(xì)胞體積的D-Hank’s平衡鹽液洗一遍,以50倍于臍帶細(xì)胞的體積加入配好的低糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含10％FBS、5ng/ml bFGF、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和25mmol/L谷氨酰胺，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞密度為1×10⁵個/ml,接種于75cm²的培養(yǎng)瓶,置于37℃,5％CO₂,飽和濕度95％的培養(yǎng)箱培養(yǎng),每3～4天進(jìn)行換液；單純臍帶成體干細(xì)胞連續(xù)傳代5次；

(3)臍帶成體干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)5代后，該細(xì)胞具有很好的貼壁穩(wěn)定性(參見說明書附圖1C)；之后，使用滾瓶貼壁培養(yǎng)模式進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)；

(4)臍帶成體干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)體系中轉(zhuǎn)化成3D微球：擴(kuò)大化培養(yǎng)后干細(xì)胞轉(zhuǎn)至搖瓶懸浮培養(yǎng)體系以每分30轉(zhuǎn)速度懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化臍帶成體干細(xì)胞成為3D微球(參見說明書附圖1D)；

(5)臍帶成體干細(xì)胞3D微球的射線輻照修飾：通過160Gy X射線輻照臍帶成體干細(xì)胞3D微球，建立高穩(wěn)定型的射線輻照修飾化臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑，穩(wěn)定生存率高于95％(參見說明書附圖1E)；

(6)臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑的制備：收集上述輻照后臍帶成體干細(xì)胞3D微球，球直徑100-120μm(參見說明書附圖1F)，裝入2ml凍存小管，每支8×10³個射線輻照修飾的臍帶成體干細(xì)胞3D微球，凍存液為人的AB血漿，總體積為1ml，于－196℃液氮中貯存，解凍后直接使用。

實(shí)施例3.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑治療腫瘤的動物模型構(gòu)建：采用6-8周齡、18－24g的C57BL/6小鼠建立肺癌模型。采用6－8周齡、18－24g的Balb/C小鼠建立乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌模型。每只右側(cè)脅部皮下接種活腫瘤細(xì)胞8×10⁵個(0.1ml)，種瘤后第9天腫瘤可摸及約3mm³大小，開始采用實(shí)施例1的制劑進(jìn)行治療。

實(shí)施例4.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射誘發(fā)腫瘤消退：實(shí)施例1制劑的使用,選擇在腫瘤發(fā)生之后，首先選擇最常見的腫瘤：男性肺癌、女性乳腺癌作為治療模型，注射部位選擇腫瘤對側(cè)方皮下，劑量為8×10³個干細(xì)胞3D微球活制劑，10天后進(jìn)行一次同劑量加強(qiáng)免疫治療。多種腫瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌與結(jié)腸癌模型治療結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用實(shí)施例1的制劑治療后腫瘤體積明顯小于對照組，尤其是射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球治療組大部分腫瘤明顯至完全消退(參見說明書附圖2－5)。

實(shí)施例5.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射抑制腫瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移:腫瘤轉(zhuǎn)移指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1制劑治療組(R-USC-Sph)的腫瘤腫瘤轉(zhuǎn)移明顯下降，大部分宿主的腫瘤轉(zhuǎn)移指數(shù)趨向0％，(參見說明書附圖6)。與對照組相比，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

實(shí)施例6.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖:與對照組相比，腫瘤組織的CD133/MUC-1免疫組化染色顯示，實(shí)施例1制劑治療組(R-USC-Sph)的腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞明顯減少。(參見說明書附圖7A)，同對照組相比結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

實(shí)施例7.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射增加NK細(xì)胞活性：與對照組相比，腫瘤組織的NK細(xì)胞免疫組化染色顯示，實(shí)施例1制劑治療組(R-USC-Sph)的腫瘤組織中活化NK細(xì)胞明顯多于對照組(參見說明書附圖7B)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

實(shí)施例8.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射腫瘤干細(xì)胞凋亡：與對照比較，腫瘤組織免疫熒光染色顯示實(shí)施例1制劑治療組(R-USC-Sph)腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞明顯凋亡(參見說明書附圖7C)，與對照組比較，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。

實(shí)施例9.射線輻照修飾臍帶成體干細(xì)胞3D微球活制劑體內(nèi)注射增加淋巴細(xì)胞分泌干擾素和白介素-4：與對照比較，Elispot分析顯示實(shí)施例1制劑治療組(R-USC-Sph)淋巴細(xì)胞分泌的干擾素-γ(介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞免疫)和白介素-4(介導(dǎo)抗腫瘤體液免疫)明顯高于對照組(參見說明書附圖8)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。