本發(fā)明涉及植物細(xì)胞培養(yǎng)方法及生產(chǎn)植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
天山雪蓮為菊科植物雪蓮(Saussureainvolucrata(Kar.etKir)Sch.-Bip.Linnaea)的干燥地上部分，是中國(guó)特有的藥用植物，其有效成分主要包括生物堿類化合物、黃酮類化合物、苯丙素類化合物、倍半萜內(nèi)酯及其苷類化合物、多糖類化合物及揮發(fā)油類化合物，一般以總黃酮及總蛋白含量作為評(píng)價(jià)天山雪蓮質(zhì)量的指標(biāo)。因?yàn)橐吧Y源日益匱乏，天山雪蓮已被國(guó)家列為二級(jí)瀕危植物，采集得到的天山雪蓮已經(jīng)無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的醫(yī)療保健用途需求。通過(guò)植物細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)雪蓮進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，找到了解決雪蓮短缺的良好途徑，但當(dāng)前大規(guī)模培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞時(shí)，一方面由于天山雪蓮細(xì)胞耐受剪切力較低造成難于攪拌均勻，并隨之帶來(lái)了需氧量不均勻等問(wèn)題，另一方面大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)得到的天山雪蓮細(xì)胞與天然的天山雪蓮在有效成分含量，尤其是“總黃酮和總蛋白含量”上還有差距。
中國(guó)專利ZL201210021722.6公開(kāi)了一種帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應(yīng)器，通過(guò)改進(jìn)的生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)可以解決天山雪蓮細(xì)胞耐受剪切力較低造成難于攪拌均勻的問(wèn)題，但如何優(yōu)化繼代培養(yǎng)條件，提高天山雪蓮細(xì)胞的有效成分含量，并提供一種穩(wěn)定的能夠大規(guī)模培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞并能夠使其有效成分含量保持在較高水平的的繼代工藝成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決前述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，通過(guò)優(yōu)化工藝條件，不但能夠在大規(guī)模培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞時(shí)提高細(xì)胞產(chǎn)量，而且能夠提高培養(yǎng)得到的天山雪蓮細(xì)胞中有效成分。
本發(fā)明提供了一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于所述工藝包括以下步驟：
1)天山雪蓮細(xì)胞系篩選：采用天然雪蓮試管苗進(jìn)行外植體誘導(dǎo)，獲得愈傷組織，對(duì)固體細(xì)胞進(jìn)行Ser-137、uv-B誘變，低溫4℃處理，將MS培養(yǎng)基的含糖量提高至50-100g/L后作為篩選培養(yǎng)基，以篩選培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行篩選獲得細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞系篩選時(shí)的培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，每?jī)芍芾^代一次；
2)搖瓶規(guī)模繼代培養(yǎng)：挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顏色鮮亮，質(zhì)地緊實(shí)的固體細(xì)胞放入含有培養(yǎng)液的搖瓶中，培養(yǎng)液為含有0.4～0.6mg/L 6-BA、0.8～1.2mg/L NAA的MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基的含糖量為20～40g/L，細(xì)胞接種量為30～50g/L，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，搖床轉(zhuǎn)速為100-120rpm，每7-10天繼代一次；
3)搖瓶轉(zhuǎn)反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：將搖瓶中細(xì)胞轉(zhuǎn)接到反應(yīng)器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每次繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為7-10天，反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液為含有0.4～0.6mg/L6-BA、0.8～1.2mg/LNAA的MS培養(yǎng)基，所述MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基的含糖量為20～40g/L，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，通氣保持反應(yīng)器中培養(yǎng)液的溶氧濃度在2-6mg/L。
所述的的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)中，每次繼代培養(yǎng)細(xì)胞鮮重翻倍量為3-5倍，培養(yǎng)完成時(shí)細(xì)胞鮮重不低于150g/L。
所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)中，反應(yīng)液中培養(yǎng)液的溶氧濃度保持在2～4mg/L。
所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于所述反應(yīng)器為帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應(yīng)器。所述的帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應(yīng)器如中國(guó)專利ZL201210021722.6中所述。
所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，其特征在于步驟3)搖瓶轉(zhuǎn)反應(yīng)器培養(yǎng)包括以下步驟
3.1)搖瓶轉(zhuǎn)20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，將搖瓶細(xì)胞無(wú)菌接入20L反應(yīng)器中，接種量為30～50g/L，保持反應(yīng)器振頻為5-15rpm，通氣量為0.1-0.3m3/h，完成繼代的細(xì)胞鮮重達(dá)到150g/L
3.2)20L轉(zhuǎn)200L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，在20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)無(wú)菌連接的方式將20L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接入200L反應(yīng)器中，保持反應(yīng)器振頻為10-20rpm，，并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為0.4-1.0m3/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過(guò)程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高5-10個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L，
3.3)200L轉(zhuǎn)1000L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：在200L的反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)無(wú)菌連接的方式將200L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接到1000L反應(yīng)器中，培養(yǎng)第1-5天的反應(yīng)器振頻為10-15rpm，培養(yǎng)第6天以上的反應(yīng)器振頻為15-25rpm；并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為1.5-4.0m3/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過(guò)程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高10-20個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L。
本發(fā)明提供的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細(xì)胞的工藝，一方面在利用現(xiàn)有的波浪回頭式生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，找到合適的反應(yīng)器振頻，使植物細(xì)胞能夠在培養(yǎng)時(shí)既能均勻分散，又不會(huì)因剪切力對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，同時(shí)在進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，為使天山雪蓮細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)，需要將培養(yǎng)液中的溶氧量控制在2-6mg，一旦溶氧量低于2mg/L將會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞褐變死亡的情況，但在進(jìn)一步研究中我們意外的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的溶氧量可以促進(jìn)細(xì)胞中總蛋白和總黃酮含量的提高，當(dāng)溶氧量為較低的2-4mg/L時(shí)，有效成分含量提高較為明顯，且不同類的有效成分含量均有明顯提高。說(shuō)明優(yōu)化的工藝更有利于天山雪蓮細(xì)胞中有效成分的均衡產(chǎn)生。
具體實(shí)施方式
1)天山雪蓮細(xì)胞系篩選：采用天然雪蓮試管苗進(jìn)行外植體誘導(dǎo)，獲得愈傷組織，對(duì)固體細(xì)胞進(jìn)行Ser-137、uv-B誘變，低溫4℃處理，采用含糖量為50-100g/L的高糖MS培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行篩選獲得細(xì)胞系并命名為SE-5，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，每?jī)芍芾^代一次；
2)搖瓶規(guī)模繼代培養(yǎng)：挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顏色鮮亮，質(zhì)地緊實(shí)的固體細(xì)胞放入含有培養(yǎng)液的搖瓶中，所述培養(yǎng)液為含有0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含糖量30g/L)，接種量為30～50g/L，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，搖床轉(zhuǎn)速為100-120rpm，每7-10天繼代一次；繼代完成后細(xì)胞鮮重不小于150g/L；
3)搖瓶轉(zhuǎn)反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：將搖瓶中細(xì)胞轉(zhuǎn)接到反應(yīng)器中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每次繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為7-10天，反應(yīng)器中加入含有0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為1000-3000Lux，通氣保持反應(yīng)器中培養(yǎng)液的溶氧濃度在2-6mg/L；
3.1)搖瓶轉(zhuǎn)20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，將搖瓶細(xì)胞無(wú)菌接入20L反應(yīng)器中，接種量為30～50g/L，保持反應(yīng)器振頻為5-15rpm，通氣量為0.1-0.3m3/h，完成繼代的細(xì)胞鮮重達(dá)到150g/L；
3.2)20L轉(zhuǎn)200L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)，在20L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)無(wú)菌連接的方式將20L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接入200L反應(yīng)器中，保持反應(yīng)器振頻為10-20rpm，，并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為0.4-1.0m3/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過(guò)程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高5-10個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L；
3.3)200L轉(zhuǎn)1000L反應(yīng)器繼代培養(yǎng)：在200L的反應(yīng)器繼代培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)無(wú)菌連接的方式將200L反應(yīng)器中完成繼代的細(xì)胞種源轉(zhuǎn)接到1000L反應(yīng)器中，培養(yǎng)第1-5天的反應(yīng)器振頻為10-15rpm，培養(yǎng)第6天以上的反應(yīng)器振頻為15-25rpm；并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應(yīng)器中，通氣量為1.5-4.0m3/h，混合氣體的初始氧氣比例為零，隨著培養(yǎng)過(guò)程梯度增加氧氣比例，每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高10-20個(gè)百分點(diǎn)，將溶氧濃度控制在2mg～6mg/L。
步驟3)中的反應(yīng)器為如中國(guó)專利ZL 201210021722.6中所述的帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應(yīng)器。
最終培養(yǎng)完成后取天山雪蓮細(xì)胞，提取并檢測(cè)總黃酮和總蛋白含量(占細(xì)胞干重的重量百分比)
氧氣占混合氣體的體積百分比含量＝氧氣通氣量/(氧氣通氣量+空氣通氣量)×100％
實(shí)施例1～4溶氧濃度與反應(yīng)器繼代培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)量及有效成分含量見(jiàn)下表，高溶氧培養(yǎng)時(shí)間占比是溶氧濃度＞4mg/L的培養(yǎng)時(shí)間在每次繼代培養(yǎng)的總培養(yǎng)時(shí)間中的占比。
結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液的溶氧量為2-6mg/L時(shí)，在繼代培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液中的細(xì)胞鮮重均大于150g/L，說(shuō)明采用本發(fā)明提供的工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)天山雪蓮細(xì)胞的大規(guī)模繼代培養(yǎng)。而有效成分含量檢測(cè)表明，溶氧濃度控制在2-4mg/L的實(shí)施例1，作為有效成分產(chǎn)量標(biāo)志的總黃酮和總蛋白的含量均顯著高于其他實(shí)施例。說(shuō)明優(yōu)選的溶氧濃度含量可以提高天山雪蓮細(xì)胞的有效成分含。