本發(fā)明涉及用埃希氏菌(Escherichiasp.)來源的基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌(Corynebacteriumsp.)及使用該棒桿菌菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
：棒桿菌，具體來說，谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，是用于生產(chǎn)L-氨基酸的革蘭氏陽性的微生物。諸如L-賴氨酸的L-氨基酸被廣泛用于動物飼料生產(chǎn)、人類藥品生產(chǎn)、制藥工業(yè)等，并通過使用棒桿菌菌株的遺傳工程方法來大量生產(chǎn)。由于工業(yè)發(fā)展，對L-氨基酸的不斷增加的需求導(dǎo)致需要開發(fā)改良的棒桿菌菌株，以更有效和更經(jīng)濟地生產(chǎn)L-氨基酸。一般來說，通過將特定的DNA(如L-氨基酸生物合成相關(guān)的基因)引入棒桿菌菌株內(nèi)或者通過改良棒桿菌菌株的活力已經(jīng)可以增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)。例如，韓國專利公開第2001-51915號和第2001-62279號公開了通過來源于谷氨酸棒桿菌的sucC和sucD基因以及zwa2基因的低表達，增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)力的方法。韓國專利公開第2001-62272號公開了通過來源于谷氨酸棒桿菌的zwa1基因的過表達，增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)力的方法。日本專利第1995-121228號公開了引入來源于大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)的編碼檸檬酸合酶的基因的方法。同時，棒桿菌能利用蔗糖、葡萄糖和果糖作為碳源。其中，蔗糖被磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)磷酸化并被運送到細(xì)胞內(nèi)。隨后，磷酸化的蔗糖被轉(zhuǎn)化酶水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖。產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸進入糖酵解，而未磷酸化的果糖則被從細(xì)胞輸出。其被PTS磷酸化，隨后被運送到細(xì)胞內(nèi)，并在糖酵解中被利用。利用果糖作為碳源需要相對復(fù)雜的代謝途徑，因為棒桿菌沒有果糖激酶活性(ApplEnvironMicrobiol.(1996)62:3878-3880)。另一方面，在表達果糖激酶的細(xì)菌內(nèi)，蔗糖被轉(zhuǎn)化酶水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖，且果糖被果糖激酶磷酸化。隨后，葡萄糖-6-磷酸和磷酸化果糖可以進入糖酵解途徑。使用果糖作為培養(yǎng)棒桿菌的碳源有一個問題，由于復(fù)雜的代謝途徑，其需要不必要的能量損耗，因此已經(jīng)進行了許多研究來解決這一問題。例如，本發(fā)明發(fā)明人開發(fā)了使用轉(zhuǎn)化的菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述轉(zhuǎn)化的菌株通過將來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的果糖激酶基因引入棒桿菌內(nèi)來制備(韓國專利第564805號)。然而，隨后的研究表明，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌具有非常低的果糖激酶活性，且當(dāng)使用蔗糖作為培養(yǎng)棒桿菌的碳源時，來源于蔗糖的一部分果糖被轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，且余下的部分在細(xì)胞外被PTS磷酸化，隨后被運送到細(xì)胞內(nèi)，這如同野生型內(nèi)的情形，因此引入果糖激酶基因并不提供足夠的產(chǎn)出。因此，有必要探索其他顯示出足以在棒桿菌內(nèi)將果糖轉(zhuǎn)化成為果糖-6-磷酸的活性的果糖激酶基因。從對調(diào)節(jié)蔗糖吸收和水解作用以賦予蔗糖同化能力的基因的研究中，鑒定出了期望的果糖激酶基因，且通過以下例證：沙門氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)和解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)中發(fā)現(xiàn)的scr調(diào)節(jié)子(J.Bacteriol.,151:68-76,1982；Mol.Microbiol.,2:1-8,1988；J.Bacteriol.,173:7464-7470,1991；J.Gen.Microbiol.,134:1635-1644,1988；J.Bacteriol.,182:5351-5358,2000；USP7,179,623)；來源于埃希氏菌的csc調(diào)節(jié)子(Appl.Environ.Microbiol.,58:2081-2088,1992；USP6,960,455)以及來源于革蘭氏陽性的微生物——變異鏈球菌(Streptococcusmutans)的scr調(diào)節(jié)子和sac操縱子(J.Bacteriol.,171:263-271,1989)。其中，在埃希氏菌中發(fā)現(xiàn)了兩種果糖激酶基因(cscK和mak)。cscK是屬于csc調(diào)節(jié)子的果糖激酶基因，且已知與cscB(質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運型蔗糖通透酶)和cscA(蔗糖水解酶)一起參與蔗糖代謝(J.Bacteriol.,184:5307-5316,2002)。Mak是編碼甘露糖激酶的基因，且已知甘露糖激酶具有將諸如甘露糖、果糖和葡萄糖的己糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸-酯形式的活性(Mol.Microbiol.,5:2913-2922,1991)。發(fā)明概述技術(shù)問題因此，本發(fā)明發(fā)明人分離了埃希氏菌的果糖激酶基因(cscK和mak)，并用該基因轉(zhuǎn)化棒桿菌菌株以提供具有增加的氨基酸生產(chǎn)力的菌株，從而完成本發(fā)明。技術(shù)方案本發(fā)明的一個目的是提供用埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化以表達果糖激酶的棒桿菌，所述果糖激酶顯示出足以在細(xì)胞內(nèi)將果糖轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的活性，而不需要通過水解磷酸化的蔗糖產(chǎn)生的胞內(nèi)果糖在輸出后的再次進入，從而阻止不必要的能量損耗。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的棒桿菌和從其收集L-氨基酸的步驟。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的棒桿菌和從其收集L-氨基酸的步驟。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的棒桿菌能表達埃希氏菌來源的果糖激酶，從而避免果糖代謝期間不必要的能量損耗，產(chǎn)生更具成本效益的L-氨基酸生產(chǎn)。因此，其可以被廣泛用于有效生產(chǎn)L-氨基酸。附圖簡要說明圖1是顯示培養(yǎng)用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌后，存在于培養(yǎng)基中的蔗糖和果糖的定量結(jié)果的圖。實施發(fā)明的最佳方式一方面，為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌，其包含可操作地連接至基因表達單元的埃希氏菌來源的果糖激酶基因。就這一點而言，果糖激酶基因并不具體受限，且優(yōu)選為cscK或mak，且最優(yōu)選為cscK。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，cscK具有SEQIDNO.17的核苷酸序列，且mak具有SEQIDNO.18的核苷酸序列。此外，基因表達單元被可操作地連接至載體，且優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化插入到棒桿菌內(nèi)，或通過插入棒桿菌的染色體中而并入。該基因優(yōu)選通過基因表達調(diào)控區(qū)的修飾而被過表達。例如，除了基因上游的固有啟動子，還可以連接其他的異質(zhì)啟動子，且異質(zhì)啟動子的例子可以包括pcj7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA啟動子和aceB啟動子。優(yōu)選使用棒桿菌來源的啟動子——pcj7啟動子或lysCP1啟動子，且最優(yōu)選使用pcj7啟動子。如本文中所使用，術(shù)語“表達單元”指包含可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸的啟動子和所述多核苷酸的片段，且可以進一步包括3'-UTL、5'-UTL、聚A尾等。如本文中所使用，術(shù)語“表達單元”與“表達盒”可互換。如本文中所使用，術(shù)語“pcj7啟動子”指可以被表達的啟動子，其在產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)和埃希氏菌內(nèi)顯示優(yōu)良的啟動子活性，且還在谷氨酸棒桿菌內(nèi)顯示優(yōu)良的啟動子活性(韓國專利第0620092號)。如本文中所使用，術(shù)語“l(fā)ysCP1啟動子”指通過編碼天冬氨酸激酶和天門冬氨酸半醛脫氫酶的基因的啟動子區(qū)的核苷酸置換而改良的啟動子，以及可增加天冬氨酸激酶基因的表達水平從而使酶活增加超過野生型約5倍的強啟動子(WO2009/096689)。本發(fā)明中，可以將果糖激酶基因引入的棒桿菌，可以包括屬于棒桿菌且具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的所有菌株。其實例可以優(yōu)選包括，但不限于：谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)(FERMBP-1539)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)(ATCC14067)、發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumfermentum)(ATCC13869)，且更優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌KFCC10881(韓國專利第0159812號)、KFCC-11074和KFCC110011。如本文中所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將果糖激酶基因引入宿主細(xì)胞——棒桿菌內(nèi)，以使其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達的全部行為。就這一點而言，果糖激酶基因是能編碼果糖激酶的多核苷酸，包括DNA和RNA。只要基因能被引入宿主細(xì)胞內(nèi)并在其中表達，該基因就可以以任何形式被引入。例如，可以以表達盒將基因引入宿主細(xì)胞中，所述表達盒是其自身包含用于表達該基因的完整元件的多核苷酸表達體(expressome)。表達盒包含可操作地連接至基因的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止信號、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止信號。表達盒可以為能自我復(fù)制的表達載體?；蜻€可以單獨或以可操作地連接至在宿主細(xì)胞內(nèi)表達所必需的序列的多核苷酸表達體的形式被引入宿主細(xì)胞內(nèi)。同時，另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)用埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌；和從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸的步驟。就這一點而言，L-氨基酸可以為所有類型的L-氨基酸，且優(yōu)選為L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。棒桿菌的培養(yǎng)可以通過本領(lǐng)域已知的不同培養(yǎng)方法(Chmiel,Bipprozesstechnik1.EinfuhrungindieBioverfahrenstechnik,GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991；Storhas,BioreaktorenundperiphereEinrichtungen,ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)，在合適的培養(yǎng)基中進行。培養(yǎng)方法的實例可以包括：分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)。補料分批培養(yǎng)包括補料分批法和重復(fù)補料分批法，但不限于此。此外，根據(jù)培養(yǎng)模式和菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇本文中用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基(“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(ManualofMethodsforGeneralBacteriology)”，美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會，美國華盛頓，1981)。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基包括不同的碳源、氮源和微量元素。用于培養(yǎng)棒桿菌的培養(yǎng)基可以包括所有的蔗糖、葡萄糖、果糖、脂質(zhì)、脂肪酸、醇、有機酸等。具體來說，本發(fā)明的棒桿菌具有果糖激酶活性，從而通過果糖激酶直接在細(xì)胞內(nèi)磷酸化果糖，而不需要通過水解磷酸化的蔗糖產(chǎn)生的胞內(nèi)果糖在輸出后的再次進入，因此可在糖酵解中利用磷酸化的果糖。因此，本發(fā)明的棒桿菌具有比已知棒桿菌改善的蔗糖同化能力。有用的碳源的具體實例包括：碳水化合物，如蔗糖——包括糖蜜、葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇；以及有機酸，如醋酸?？梢砸圆煌姆绞绞褂煤线m量的碳源。氮源包括諸如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿和大豆粉的有機氮源，以及諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨的無機氮源。這些氮源可以單獨或組合使用。用于培養(yǎng)基的磷源的實例可以包括：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和相應(yīng)的鈉鹽。另外，培養(yǎng)基可以包含諸如硫酸鎂或硫酸亞鐵的金屬鹽。此外，可以包含氨基酸、維生素和合適的前體物質(zhì)?？梢酝ㄟ^分批式或連續(xù)式方法將培養(yǎng)基或前體物質(zhì)加入到培養(yǎng)物中?？梢砸院线m的方法，通過在培養(yǎng)期間加入諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸的化合物來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。可以通過在培養(yǎng)期間使用諸如聚乙二醇脂肪酸酯的消泡劑來抑制氣泡的產(chǎn)生。為了維持培養(yǎng)物的需氧條件，可以將氧氣或含氧氣體(例如，空氣)注入到培養(yǎng)物中。培養(yǎng)溫度為20至45℃，且優(yōu)選為25至40℃?？梢猿掷m(xù)培養(yǎng)直到達到L-氨基酸生產(chǎn)的期望水平，且優(yōu)選持續(xù)10至160小時?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的典型方法從培養(yǎng)基中分離L-氨基酸。分離方法的實例可以包括：離心、過濾、離子交換層析、結(jié)晶等。例如，可以通過低速離心從培養(yǎng)物中移除生物質(zhì)，并可以通過離子交換層析純化產(chǎn)生的上清液。另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述棒桿菌，和從培養(yǎng)物分離L-氨基酸的步驟。就這一點而言，由生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌產(chǎn)生的L-氨基酸可以為，但不具體限于，L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，生產(chǎn)L-賴氨酸的方法包括在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述棒桿菌，和從培養(yǎng)物收集L-氨基酸的步驟。在本發(fā)明的另一個實施方案中，生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括以下步驟：將包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達載體和包含蘇氨酸生物合成相關(guān)基因及輸出相關(guān)基因的質(zhì)粒載體引入谷氨酸棒桿菌KFCC10881內(nèi)，以獲得轉(zhuǎn)化菌株，隨后培養(yǎng)該菌株并從培養(yǎng)物收集L-蘇氨酸。就這一點而言，包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達載體優(yōu)選為pDZTn-pcj7_cscK或pDZTn-lysCP1_cscK，但不具體限于此。包含蘇氨酸生物合成相關(guān)基因及輸出相關(guān)基因的質(zhì)粒載體優(yōu)選為pECCG117-homthrBCE，但不具體限于此。在本發(fā)明的另一個實施方案中，生產(chǎn)L-谷氨酸的方法包括以下步驟：將包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KTCC10774內(nèi)，以獲得轉(zhuǎn)化菌株，隨后培養(yǎng)該菌株并從培養(yǎng)物收集L-谷氨酸。就這一點而言，包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達載體優(yōu)選為pDZTn-pcj7_cscK或pDZTn-lysCP1_cscK，但不具體限于此。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，相比引入已知的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyricum)來源的果糖激酶基因——CFK(韓國專利第0564805號)，引入埃希氏菌來源的果糖激酶基因cscK或mak極大地增加了L-賴氨酸的生產(chǎn)力。具體來說，當(dāng)引入與異質(zhì)的啟動子pcj7或lysCP1而非其固有啟動子連接的果糖激酶基因cscK時，效果提高更多(表1)。此外，當(dāng)將通過引入與pcj7啟動子連接的果糖激酶基因cscK而轉(zhuǎn)化的菌株培養(yǎng)在含有蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中時，由蔗糖水解產(chǎn)生的果糖并沒有被分泌到培養(yǎng)基中，因此通過存在于培養(yǎng)基中的蔗糖的胞內(nèi)水解產(chǎn)生的果糖被完全磷酸化，并在糖酵解中被利用(圖1)。此外，相比沒有引入果糖激酶基因的情形，當(dāng)引入果糖激酶基因時，果糖激酶活性增加了1.95至4.24倍。相比引入已知的果糖激酶基因的情形，當(dāng)引入果糖激酶基因中的cscK時，果糖激酶活性增加了1.80至2.16倍(表3)。通過引入埃希氏菌來源的果糖激酶基因而轉(zhuǎn)化的菌株不僅增加了L-賴氨酸的生產(chǎn)力，還增加了其他L-氨基酸——L-蘇氨酸(表4)和L-谷氨酸(表5)的生產(chǎn)力。因此，通過引入本發(fā)明的埃希氏菌來源的果糖激酶基因而轉(zhuǎn)化的菌株可以用于生產(chǎn)所有的L-氨基酸。因此，本發(fā)明發(fā)明人將顯示最優(yōu)效果的用pDZTn-pcj7_cscK轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株(KFCC-10881-Pcj7_cscK)命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)CA01-2012，并于2011年3月28日將其保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms,下文縮寫為“KCCM”，361-221,YurimB/D,Hongje-1-dong,Seodaemun-gu,SEOUL120-091,RepublicofKorea)，其登錄號為KCCM11183P。本發(fā)明的實施例下文中，將參考實施例對本發(fā)明進行更詳細(xì)地描述。然而，這些實施例僅用于說明目的，并且本發(fā)明并不意圖受限于此。實施例1：大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因的獲得和載體的構(gòu)建大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因的堿基序列已經(jīng)被清晰揭示和公開。來源于大腸埃希氏菌EC3231(登錄號X81461)的cscK基因(SEQIDNO.17)和來源于W3110(登錄號AC000091)的mak基因(SEQIDNO.18)的序列信息從NIHGenBank獲得?；趫髮?dǎo)的堿基序列，合成了具有5'端EcoRI限制位點和3'端SpeI限制位點的引物，并使用購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的大腸埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色體作為模板，以PCR擴增包含啟動子區(qū)的約1200bp的cscK基因(使用以下的SEQIDNO.1和2引物)，以及mak基因(使用以下的SEQIDNO.3和4引物)。此時，在以下條件下進行PCR，包括94℃變性5分鐘，30個循環(huán)的94℃變性30秒、56℃退火30秒和72℃聚合1分鐘，隨后72℃聚合7分鐘。SEQIDNO.1：5'-gcgaattcgaaaatggggataga-3'SEQIDNO.2：5'-gcactagtattacctgcctgtcg-3'SEQIDNO.3：5'-cagaattcacgtgcgttaacgcatcg-3'SEQIDNO.4：5'-ctactagtcaccttttgtaggcctga-3'用EcoRI和SpeI限制酶處理兩條擴增的果糖激酶基因的多核苷酸。得到每種DNA片段，隨后將其連接入pECCG117的EcoRI和SpeI位點內(nèi)，其中pECCG117為大腸埃希氏菌和棒桿菌的穿梭載體。其后，用該載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5α，并涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。挑選用含有PCR擴增基因的載體轉(zhuǎn)化的克隆，隨后通過已知的質(zhì)粒抽提方法獲取質(zhì)粒，將其分別命名為“pECCG117-cscK”和“pECCG117-mak”。實施例2：果糖激酶基因至賴氨酸生產(chǎn)菌株的引入和賴氨酸生產(chǎn)力的比較使用電脈沖法，用pECCG117-cscK或pECCG117-mak載體轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KFCC10881，并挑選卡那霉素抗性克隆。培養(yǎng)了用兩種來源于大腸埃希氏菌的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株和用上述丙酮丁醇梭菌來源的果糖激酶CFK(韓國專利第0564805號)轉(zhuǎn)化的菌株，并比較了它們的賴氨酸生產(chǎn)力。將每種菌株接種到含有25ml種子培養(yǎng)基(加入了25μl/ml的卡那霉素)的250ml角擋板瓶(corner-baffleflask)中，并在200rpm和30℃下震蕩培養(yǎng)20小時。此時，種子培養(yǎng)基(pH7.0)具有以下組份：蔗糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物10g、尿素5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O0.5g、生物素100μg、鹽酸硫胺1000μg(基于1L的生產(chǎn)用水)。接著，將1ml種子培養(yǎng)液接種到含有24ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(加入了25μl/ml的卡那霉素)的250ml角擋板瓶中，并在200rpm和30℃下振蕩培養(yǎng)72小時。此時，生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0)具有以下組分：蔗糖80g、糖蜜或預(yù)處理過的糖蜜(作為還原糖)20g、玉米漿5g、(NH4)2SO440g、尿素4g、KH2PO41g、NaCl2.5g、MgSO4·7H2O1g、FeSO4·7H2O10mg、MnSO4·5H2O10mg、生物素100μg、鹽酸硫胺200μg、CaCO340g、L-亮氨酸0.4g(如有必要)、L-蘇氨酸0.1g(如有必要)、L-甲硫氨酸0.1g(如有必要)(基于1L的生產(chǎn)用水)。最后，結(jié)束培養(yǎng)，并通過HPLC測定L-賴氨酸的平均濃度(見表1)。表1依據(jù)引入的果糖激酶基因的L-賴氨酸濃度的比較(單位：g/L)實驗組菌株L-賴氨酸的平均濃度1KFCC10881/pECCG11732.92KFCC10881/pECCG117-cscK40.53KFCC10881/pECCG117-mak35.44KFCC10881/pECCG-CFK34.1如表1中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組2-4)比沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組1)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。在用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株中，用cscK或mak轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組2和3)比用已知的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組4)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。因此，為了更有效地生產(chǎn)L-賴氨酸，使用來源于大腸埃希氏菌的果糖激酶基因比使用已知的果糖激酶基因更優(yōu)選。實施例3：用于替代cscK基因啟動子的重組載體的構(gòu)建及染色體引入為了將大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因引入棒桿菌的染色體內(nèi)，使用引入了棒桿菌的轉(zhuǎn)座子基因的載體pDZTn(韓國專利公開第2009-0107665號)作為基礎(chǔ)載體。從兩種大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因中挑選出了cscK基因，因為其顯示高得多的賴氨酸生產(chǎn)力。將來源于棒桿菌的強啟動子連接到cscK基因起始密碼子的上游以增加其表達水平?；赟EQIDNO.17，僅擴增了ORF區(qū)，并合成了具有5'端NdeI限制位點和3'端SpeI限制位點的引物(以下的SEQIDNO5和6)，且使用大腸埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色體DNA作為模板來PCR擴增cscK基因的ORF(約900bp)。此時，使用與實施例1相同的方式進行PCR。SEQIDNO.5：5'-atgccatatgtcagccaaagtatg-3'SEQIDNO.6：5'-atgcactagtattacctgcctgtcg-3'合成了能擴增產(chǎn)氨棒桿菌來源的pcj7啟動子并具有5'端SpeI限制位點和3'端NdeI限制位點的引物(以下的SEQIDNO.7和8)，并使用產(chǎn)氨棒桿菌菌株的染色體DNA作為模板來PCR擴增約300bp的啟動子區(qū)。此時，在以下條件下進行PCR：包括94℃變性5分鐘，30個循環(huán)的94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃聚合30秒，隨后72℃聚合7分鐘。SEQIDNO.7：5'-atgcactagtatagggagcgttgac-3'SEQIDNO.8：5'-atgccatatgtgtttcctttcg-3'此外，合成了能擴增谷氨酸棒桿菌來源的lysCP1啟動子并具有5'端SpeI限制位點和3'端NdeI限制位點的引物(以下的SEQIDNO.9和10)，并使用谷氨酸棒桿菌菌株的染色體DNA作為模板來PCR擴增約300bp的啟動子區(qū)。此時，使用與上述的實施例3相同的方式進行PCR。SEQIDNO.9：5'-ttcatatgtgtgcacctttcgatcta-3'SEQIDNO.10：5'-ttactagtgattgttaatgccgatgcta-3'用SpeI和NdeI限制酶處理擴增的果糖激酶基因的多核苷酸和啟動子區(qū)的多核苷酸來獲得每種DNA片段。使用DNA連接酶，將啟動子和cscK基因的DNA片段連接到通過用限制酶SpeI處理pDZTn得到的DNA片段上，以構(gòu)建pDZTn-pcj7_cscK載體和pDZTn-lysCP1_cscK載體。實施例4：cscK基因表達改良的菌株的賴氨酸生產(chǎn)力的比較使用電脈沖法，用實施例3中制備的兩種表達載體——pDZTn-pcj7_cscK和pDZTn-lysCP1_cscK中的每種載體轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KFCC10881。挑選在染色體的轉(zhuǎn)座子區(qū)具有果糖激酶基因啟動子替換的菌株，并以與實施例2中相同的方法進行培養(yǎng)。測定從中收集的L-賴氨酸的平均濃度(表2)。表2依據(jù)引入的啟動子的L-賴氨酸濃度的比較(單位：g/L)實驗組菌株L-賴氨酸的平均濃度5KFCC1088133.26KFCC10881::pcj7_cscK42.17KFCC10881::lysCP1_cscK38.7在表2中，實驗組5表示從沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株收集的L-賴氨酸的平均濃度，實驗組6表示從用啟動子pcj7連接的果糖激酶基因cscK轉(zhuǎn)化的菌株收集的L-賴氨酸的平均濃度，且實驗組7表示從用啟動子lysCP1連接的果糖激酶基因cscK轉(zhuǎn)化的菌株收集的L-賴氨酸的平均濃度。如表2中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組6和7)比沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組5)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。在與果糖激酶基因連接的啟動子中，pcj7啟動子(實驗組6)比lysCP1啟動子(實驗組7)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。因此，為了更有效地生產(chǎn)L-賴氨酸，使用與大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因連接的pcj7啟動子更優(yōu)選。實施例5：cscK基因表達改良的菌株內(nèi)果糖同化的分析在本實施例中，為了檢測用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的L-賴氨酸生產(chǎn)菌株是否顯示更高的果糖激酶活性和更強的果糖同化能力，以與實施例2中相同的方法培養(yǎng)菌株，并測量了562nm處的時間依賴性吸光度及培養(yǎng)基中蔗糖和果糖的殘留量(圖1)。圖1為顯示培養(yǎng)用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌后，存在于培養(yǎng)基中的蔗糖和果糖的定量結(jié)果的圖，其中A表示培養(yǎng)沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株的結(jié)果，B表示培養(yǎng)用pcj7啟動子連接的果糖激酶基因CFK轉(zhuǎn)化的菌株的結(jié)果，C表示培養(yǎng)用pcj7啟動子連接的果糖激酶基因cscK轉(zhuǎn)化的菌株的結(jié)果，且D表示培養(yǎng)用lysCP1啟動子連接的果糖激酶基因cscK轉(zhuǎn)化的菌株的結(jié)果，且(●)表示測得的OD562值，(■)表示培養(yǎng)基中的殘留蔗糖的總量，且(▲)表示A-D中的培養(yǎng)基中的殘留果糖的總量。如圖1中所顯示，雖然在菌株間存在著相對偏差，在用KFCC10881(A)和KFCC10881::pcj7_CFK(B)轉(zhuǎn)化的菌株的整個培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基中果糖的累積量增加了預(yù)定時間，隨后減少。相反，在用KFCC10881::pcj7_cscK(C)和KFCC10881::lysCP1_cscK(D)轉(zhuǎn)化的菌株的整個培養(yǎng)期間，培養(yǎng)基中都沒有檢測到果糖。因此，通過水解存在于培養(yǎng)基中的蔗糖所產(chǎn)生的果糖可以被本發(fā)明的果糖激酶基因表達的果糖激酶完全磷酸化，并因此進一步在糖酵解被利用，從而阻止谷氨酸棒桿菌的果糖代謝中不必要的能量損耗。實施例6：cscK基因表達改良的菌株內(nèi)果糖激酶活性的分析在本實施例中，使用了已知的方法(Microbiology(2002)148:843-852)來檢測細(xì)胞內(nèi)果糖激酶基因的過表達是否被在染色體上具有強表達誘導(dǎo)活性的棒桿菌來源的啟動子和存在于L-賴氨酸生產(chǎn)菌株內(nèi)的果糖激酶酶活性所誘導(dǎo)。將菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，隨后通過離心得到細(xì)胞團。將細(xì)胞團懸浮在緩沖液中，并通過超聲處理裂解，隨后通過高速離心得到上清液。將得到的上清液與含有果糖、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ATP和NADP+的反應(yīng)液反應(yīng)，并通過測量340nm處的吸光度測定NADPH的生產(chǎn)量，以直接計算果糖至果糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化(表3)。表3依據(jù)引入的啟動子或基因的果糖激酶活性的改變實驗組菌株活性a8KFCC1088111.909KFCC10881::pcj7_cscK50.5510KFCC10881::lysCP1_cscK42.0611KFCC10881::pcj7_CFK23.32a)：nmol(產(chǎn)生的果糖-6-磷酸)/min/mg(蛋白質(zhì))如表3中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組9-11)比沒有用果糖激酶基因的菌株(實驗組8)顯示1.95至4.24倍的果糖激酶活性的增加。在果糖激酶基因中，相比已知的果糖激酶基因(實驗組11)，cscK基因(實驗組9和10)顯示1.80至2.16倍的果糖激酶活性的增加。因此，可以看出大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因優(yōu)于已知的果糖激酶基因。如實施例4至6的結(jié)果中所顯示，用啟動子pcj7連接的果糖激酶基因cscK轉(zhuǎn)化的菌株在所有方面顯示出最優(yōu)良的活性。因此，將用pDZTn-pcj7_cscK轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株(KFCC-10881-Pcj7_cscK)命名為谷氨酸棒桿菌CA01-2012，并于2011年3月28日將其保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心(以下縮寫為“KCCM”)，其登錄號為KCCM11183P。實施例7：使用cscK基因表達改良的菌株的蘇氨酸的生產(chǎn)將含有蘇氨酸生物合成相關(guān)基因及輸出相關(guān)基因的質(zhì)粒載體pECCG117-homthrBCE引入KFCC10881菌株和實施例6中保藏的KFCC10881::pcj7_cscK菌株，來制備每種轉(zhuǎn)化株。將它們的蘇氨酸生產(chǎn)力彼此比較。質(zhì)粒載體pECCG117-homthrBCE按以下方法構(gòu)建：基于從日本KEGG網(wǎng)站(//www.genome.jp/kegg/)獲得的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的蘇氨酸生物合成基因——hom-thrB(NCgl1136、1137，SEQIDNO.19)、thrC(NCgl2139，SEQIDNO.20)和蘇氨酸輸出基因——thrE(NCgl2533，SEQIDNO.21)的堿基序列，制備了每個操縱子或基因的PCR擴增引物。PCR擴增的模板為從具有對3g/l的蘇氨酸類似物AHV(2-氨基-3-羥基-戊酸酯)的抗性的菌株中提取的染色體DNA，該菌株通過用NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍)突變親本菌株——谷氨酸棒桿菌ATCC13032產(chǎn)生。為了擴增hom-thrB操縱子，使用了具有5'端XhoI限制位點的引物(以下的SEQIDNO.11和12)。PCR擴增后，最終得到3kb的DNA片段。此時，在以下條件下進行PCR：包括94℃變性5分鐘，30個循環(huán)的94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃聚合3分鐘，隨后72℃聚合7分鐘。用XhoI切割DNA片段，隨后將其連接到質(zhì)粒載體pECCG117(其被用相同的酶限制酶切后去磷酸化)中，以構(gòu)建pECCG117-homthrB載體。SEQIDNO.11：5'-ttcctcgaggaggggaacttgatcagagga-3'SEQIDNO.12：5'-ttcctcgagctacacagctgcccatttgtg-3'為了擴增thrC基因，使用了具有5'端SalI限制位點的引物(以下的SEQIDNO.13和14)。PCR擴增后，最終得到2.1kb的DNA片段。此時，在以下條件下進行PCR：包括94℃變性5分鐘，30個循環(huán)的94℃變性30秒、56℃退火30秒、72℃聚合2分鐘，隨后72℃聚合7分鐘。用SalI切割DNA片段，隨后將其連接到質(zhì)粒載體pECCG117-homthrB(其被用相同的酶限制酶切后去磷酸化)中，以構(gòu)建pECCG117-homthrBC載體。SEQIDNO.13：5'-ttcgtcgacgattaaggatttcaactgcgg-3'SEQIDNO.14：5'-ttcgtcgacgcaacgagcaattccgagagc-3'為了擴增thrE基因，使用了具有5'端BamHI限制位點的引物(SEQIDNO.15和16)。PCR擴增后，最終得到2.5kb的DNA片段。此時，以與實施例1中相同的方法進行PCR。用BamHI切割DNA片段，隨后將其連接到質(zhì)粒載體pECCG117-homthrBC(其被用相同的酶限制酶切后去磷酸化)中，以構(gòu)建pECCG117-homthrBCE載體。SEQIDNO.15：5'-atcggatccaagatctagtcatcaatc-3'SEQIDNO.16：5'-cggcaaggatcctcctgagtg-3'使用電脈沖法，用pECCG117-homthrBCE轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KFCC10881或KFCC10881::pcj7_cscK菌株。以與實施例2中相同方法培養(yǎng)菌株。分析了存在和不存在cscK基因情況下的L-蘇氨酸的生產(chǎn)量(表4)。表4根據(jù)引入的果糖激酶基因的L-蘇氨酸平均濃度的比較(單位：g/L)如表4中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組13)比沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組12)顯示更高的L-蘇氨酸濃度。因此，可以看出用大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株還可以優(yōu)選用于生產(chǎn)L-蘇氨酸。實施例8：cscK基因表達改良的菌株的谷氨酸生產(chǎn)力的比較通過將cscK基因插入谷氨酸生產(chǎn)菌株的染色體內(nèi)制備了轉(zhuǎn)化菌株，并比較了其谷氨酸生產(chǎn)力。使用電脈沖法，用pDZTn-pcj7_cscK載體轉(zhuǎn)化谷氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KTCC10774(韓國專利第0824457號)，以制備轉(zhuǎn)化株。挑選了在染色體上的轉(zhuǎn)座子區(qū)具有果糖激酶基因插入的菌株。將菌株經(jīng)接種環(huán)接種到含有25ml種子培養(yǎng)基(pH7.0，實施例2)的250ml角擋板瓶中，并在220rpm和30℃下振蕩培養(yǎng)20小時。接著，將1ml的種子培養(yǎng)液接種到含有25ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml角擋板瓶中，并在220rpm和30℃下振蕩培養(yǎng)40小時。此時，生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.1)具有以下組分：蔗糖30g、糖蜜或預(yù)處理過的糖蜜(作為還原糖)10g、MgSO4·7H2O0.4g、KH2PO41g、(NH4)2SO43g、FeSO4·7H2O10mg、MnSO4·5H2O10mg、生物素500μg、鹽酸硫胺2mg、尿素1g(基于1L的生產(chǎn)用水)。最后，結(jié)束培養(yǎng)，并通過HPLC測定L-谷氨酸的生產(chǎn)量(表5)。表5根據(jù)引入的果糖激酶基因的L-谷氨酸平均濃度的比較(單位：g/L)實驗組菌株L-谷氨酸的平均濃度14KFCC1077411.215KFCC10774::pcj7_cscK15.8如表5中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組15)比沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組14)顯示更高的L-谷氨酸濃度。因此，可以看出用大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株還可以優(yōu)選用于生產(chǎn)L-谷氨酸。序列表<110>CJ第一制糖株式會社<120>用來源于埃希氏菌的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌及使用該棒桿菌制備L-氨基酸的方法<130>OPA12017<150>KR10-2011-0030392<151>2011-04-01<160>21<170>KopatentIn1.71<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gcgaattcgaaaatggggataga23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gcactagtattacctgcctgtcg23<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3cagaattcacgtgcgttaacgcatcg26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ctactagtcaccttttgtaggcctga26<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5atgccatatgtcagccaaagtatg24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6atgcactagtattacctgcctgtcg25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7atgcactagtatagggagcgttgac25<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8atgccatatgtgtttcctttcg22<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9ttcatatgtgtgcacctttcgatcta26<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10ttactagtgattgttaatgccgatgcta28<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11ttcctcgaggaggggaacttgatcagagga30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12ttcctcgagctacacagctgcccatttgtg30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ttcgtcgacgattaaggatttcaactgcgg30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14ttcgtcgacgcaacgagcaattccgagagc30<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15atcggatccaagatctagtcatcaatc27<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16cggcaaggatcctcctgagtg21<210>17<211>1285<212>DNA<213>cscK<400>17gaaaatggggatagaaagtgttaccccggtgctcatgaagttttgctagtgcgttttgcg60ccgcatgcaatcgagtttgcgtcattttaatcatccaggttaagcaaatttggtgaattg120ttaacgttaacttttataaaaataaagtcccttactttcataaatgcgatgaacatcaca180aatgttaacgttaactatgacgttttgtgatcgaatatgcatgttttagtaaatccatga240cgattttgcgaaaaagaggtttatcactatgcgtaagtcagatgaatttaagggaaaaaa300atgtcagccaaagtatgggttttaggggatgcggtcgtagatctcttgccagaatcagac360gggcggctactgccttgtcctggcggcgcgccagctaacgttgcggtgggaatcgccaga420ttaggcggaataagtgggtttataggtcgggtcggtgatgatccttttggggcgttaatg480caaagaacgctgctaactgagggagtcgatatcacgtatctgaagcaagatgaatggcac540cggacatccacggtgcttgtcgatctgaacgatcaaggggaacgttcatttacgtttatg600gtccgccccagtgccgatctttttttagagacgacagacttgccctgctggcgacatggc660gaatggttacatctctgttcaattgcgttgtctgccgagccttcgcgtaccagcgcattt720actgcgatgacggcgatccggcatgccggaggttttgtcagcttcgatcctaatattcgt780gaagatctatggcaagacgagcatttgctccgcttgtgtttgcggcaggcgctacaactg840gcggatgtcgtcaagctctcggaagaagaatggcgacttatcagtggaaaaacacagaac900gatcgggatatatgcgccctggcaaaagagtatgagatcgccatgctgttggtgactaaa960ggtgcagaaggtgtggtggtctgttatcgaggacaagttcaccattttgctggaatgtct1020gtgaattgtgtcgatagcacgggggcgggagatgcgttcgttgccgggttactcacaggt1080ctgtcctctacgggattatctacagatgagagagaaatgcgacgaattatcgatctcgct1140caacgttgcggagcgcttgcagtaacggcgaaaggggcaatgacagcgctgccatgtcga1200caagaactggaatagtgagaagtaaacggcgaagtcgctcttatctctaaataggacgtg1260aattttttaacgacaggcaggtaat1285<210>18<211>1279<212>DNA<213>mak<400>18acgtgcgttaacgcatcgctgtgcgatcccatcggaggaacccagcccatcttcgccatg60tcctggctgccgcatggggtaaatgccatcgaggctagctgtttttccatctcttctgca120cgcagcgaaatctcgcggctaagacggtaaaccattaaatttttgaaccacagcatgata180atttccacggccttgtcgttaaatttagcgggcatgataacgaattgtcggcggccttgc240attgccaatccggttgtccgtctctacgctattgatattgaaaaaaataaggagagtcat300atgcgtataggtatcgatttaggcggcaccaaaactgaagtgattgcactgggcgatgca360ggggagcagttgtaccgccatcgtctgcccacgccgcgtgatgattaccggcagactatt420gaaacgatcgccacgttggttgatatggcggagcaggcgacggggcagcgcggaacggta480ggtatgggcattcctggctcaatttcgccttacaccggtgtggtgaagaatgccaattca540acctggctcaacggtcagccattcgataaagacttaagcgcgaggttgcagcgggaagtg600cggctggcaaatgacgctaactgtctggcggtttcagaagcagtagatggcgcggcagcg660ggagcgcagacggtatttgccgtgattatcggcacgggatgcggcgcgggcgtggcattc720aatgggcgggcgcatatcggcggcaatggcacggcaggtgagtggggacacaatccgcta780ccgtggatggacgaagacgaactgcgttatcgcgaggaagtcccttgttattgcggtaaa840caaggttgtattgaaacctttatttcgggcacgggattcgcgatggattatcgtcgtttg900agcggacatgcgctgaaaggcagtgaaattatccgcctggttgaagaaagcgatccggta960gcggaactggcattgcgtcgctacgagctgcggctggcaaaatcgctggcacatgtcgtg1020aatattctcgatccggatgtgattgtcctggggggcgggatgagcaatgtagaccgttta1080tatcaaacggttgggcagttgattaaacaatttgtcttcggcggcgaatgtgaaacgccg1140gtgcgtaaggcgaagcacggtgattccagcggcgtacgcggcgctgcgtggttatggcca1200caagagtaaaaaacgtaggcaattggcgcatcatgcctgatgcgacgcttgccgcgtctt1260atcaggcctacaaaaggtg1279<210>19<211>3240<212>DNA<213>hom-thrB<400>19gaggggaacttgatcagaggaatacaccatggagccgatgtcagaggcgactgcgggcag60atccttttgaagctgtttcacaatttctttgcccagttcgcggcggatctggaaccactt120ttgcatgcgatcgtcgtcagagtggttcatgtgaaaaatacactcaccatctcaatggtc180atggtgaaggcctgtactggctgcgacagcatggaactcagtgcaatggctgtaaggcct240gcaccaacaatgattgagcgaagctccaaaatgtcctccccgggttgatattagatttca300taaatatactaaaaatcttgagagtttttccgttgaaaactaaaaagctgggaaggtgaa360tcgaatttcggggctttaaagcaaaaatgaacagcttggtctatagtggctaggtaccct420ttttgttttggacacatgtagggtggccgaaacaaagtaataggacaacaacgctcgacc480gcgattatttttggagaatcatgacctcagcatctgccccaagctttaaccccggcaagg540gtcccggctcagcagtcggaattgcccttttaggattcggaacagtcggcactgaggtga600tgcgtctgatgaccgagtacggtgatgaacttgcgcaccgcattggtggcccactggagg660ttcgtggcattgctgtttctgatatctcaaagccacgtgaaggcgttgcacctgagctgc720tcactgaggacgcttttgcactcatcgagcgcgaggatgttgacatcgtcgttgaggtta780tcggcggcattgagtacccacgtgaggtagttctcgcagctctgaaggccggcaagtctg840ttgttaccgccaataaggctcttgttgcagctcactctgctgagcttgctgatgcagcgg900aagccgcaaacgttgacctgtacttcgaggctgctgttgcaggcgcaattccagtggttg960gcccactgcgtcgctccctggctggcgatcagatccagtctgtgatgggcatcgttaacg1020gcaccaccaacttcatcttggacgccatggattccaccggcgctgactatgcagattctt1080tggctgaggcaactcgtttgggttacgccgaagctgatccaactgcagacgtcgaaggcc1140atgacgccgcatccaaggctgcaattttggcatccatcgctttccacacccgtgttaccg1200cggatgatgtgtactgcgaaggtatcagcaacatcagcgctgccgacattgaggcagcac1260agcaggcaggccacaccatcaagttgttggccatctgtgagaagttcaccaacaaggaag1320gaaagtcggctatttctgctcgcgtgcacccgactctattacctgtgtcccacccactgg1380cgtcggtaaacaagtcctttaatgcaatctttgttgaagcagaagcagctggtcgcctga1440tgttctacggaaacggtgcaggtggcgcgccaaccgcgtctgctgtgcttggcgacgtcg1500ttggtgccgcacgaaacaaggtgcacggtggccgtgctccaggtgagtccacctacgcta1560acctgccgatcgctgatttcggtgagaccaccactcgttaccacctcgacatggatgtgg1620aagatcgcgtgggggttttggctgaattggctagcctgttctctgagcaaggaatctccc1680tgcgtacaatccgacaggaagagcgcgatgatgatgcacgtctgatcgtggtcacccact1740ctgcgctggaatctgatctttcccgcaccgttgaactgctgaaggctaagcctgttgtta1800aggcaatcaacagtgtgatccgcctcgaaagggactaattttactgacatggcaattgaa1860ctgaacgtcggtcgtaaggttaccgtcacggtacctggatcttctgcaaacctcggacct1920ggctttgacactttaggtttggcactgtcggtatacgacactgtcgaagtggaaattatt1980ccatctggcttggaagtggaagtttttggcgaaggccaaggcgaagtccctcttgatggc2040tcccacctggtggttaaagctattcgtgctggcctgaaggcagctgacgctgaagttcct2100ggattgcgagtggtgtgccacaacaacattccgcagtctcgtggtcttggctcctctgct2160gcagcggcggttgctggtgttgctgcagctaatggtttggcggatttcccgctgactcaa2220gagcagattgttcagttgtcctctgcctttgaaggccacccagataatgctgcggcttct2280gtgctgggtggagcagtggtgtcgtggacaaatctgtctatcgacggcaagagccagcca2340cagtatgctgctgtaccacttgaggtgcaggacaatattcgtgcgactgcgctggttcct2400aatttccacgcatccaccgaagctgtgcgccgagtccttcccactgaagtcactcacatc2460gatgcgcgatttaacgtgtcccgcgttgcagtgatgatcgttgcgttgcagcagcgtcct2520gatttgctgtgggagggtactcgtgaccgtctgcaccagccttatcgtgcagaagtgttg2580cctattacctctgagtgggtaaaccgcctgcgcaaccgtggctacgcggcatacctttcc2640ggtgccggcccaaccgccatggtgctgtccactgagccaattccagacaaggttttggaa2700gatgctcgtgagtctggcattaaggtgcttgagcttgaggttgcgggaccagtcaaggtt2760gaagttaaccaaccttaggcccaacaaggaaggcccccttcgaatcaagaagggggcctt2820attagtgcagcaattattcgctgaacacgtgaaccttacaggtgcccggcgcgttgagtg2880gtttgagttccagctggatgcggttgttttcaccgaggctttcttggatgaatccggcgt2940ggatggcgcagacgaaggctgatgggcgtttgtcgttgaccacaaatgggcagctgtgta3000gagcgagggagtttgcttcttcggtttcggtggggtcaaagcccatttcgcggaggcggt3060taatgagcggggagagggcttcgtcgagttcttcggcttcggcgtggttaatgcccatga3120cgtgtgcccactgggttccgatggaaagtgctttggcgcggaggtcggggttgtgcattg3180cgtcatcgtcgacatcgccgagcatgttggccatgagttcgatcagggtgatgtattctt32403240<210>20<211>2446<212>DNA<213>thrC<400>20gccgttgatcattgttcttcacagaggatcagggtagccctcttacaggaaaatatggga60ctttgattcccaatccatggctaagtgtgatcatttagataattgttcgatcgaccgaat120gaaatcacccgttatggagacctactggaattgagcccagaaaccgtcgatgtgtgcctc180aacgtaggggtaaagccacggcccgagcagcaccagcccgaccgcgagcaccgaacaacc240aatgagaacatacaggttccacttggacaccggcgctggattaaggatttcaactgcggt300gagattcttcttgttgttgtcctcgagtttcgagaagctggggtaatcgggagctgtcat360ctttaaagcacatcctaaaaccgacaattgaaagtgatcagcaacactttagggtatcgc420gtgggcgaagtcacctttttcaacatatttgagacggtgtgggggagtattgtgtcaccc480cttgggatagggttatatccgtggactacatttcgacgcgtgatgccagccgtacccctg540cccgcttcagtgatattttgctgggcggtctagcaccagacggcggcctgtacctgcctg600caacctaccctcaactagatgatgcccagctgagtaaatggcgtgaggtattagccaacg660aaggatacgcagctttggctgctgaagttatctccctgtttgttgatgacatcccagtag720aagacatcaaggcgatcaccgcacgcgcctacacctacccgaagttcaacagcgaagaca780tcgttcctgtcaccgaactcgaggacaacatttacctgggccacctttccgaaggcccaa840ccgctgcattcaaagacatggccatgcagctgctcggcgaacttttcgaatacgagcttc900gccgccgcaacgaaaccatcaacatcctgggcgctacctctggcgataccggctcctctg960cggaatacgccatgcgcggccgcgagggaatccgcgtattcatgctgaccccagctggcc1020gcatgaccccattccagcaagcacagatgtttggccttgacgatccaaacatcttcaaca1080tcgccctcgacggcgttttcgacgattgccaagacgtagtcaaggctgtctccgccgacg1140cagaattcaaaaaagacaaccgcatcggtgccgtgaactccatcaactgggcacgcctta1200tggcacaggttgtgtactacgtttcctcatggatccgcaccacaaccagcaatgaccaaa1260aggtcagcttctccgtaccaaccggcaacttcggtgacatttgcgcaggccacatcgccc1320gccaaatgggacttcccatcgatcgcctcatcgtggccaccaacgaaaacgatgtgctcg1380acgagttcttccgtaccggcgactaccgagtccgcagctccgcagacacccacgagacct1440cctcaccttcgatggatatctcccgcgcctccaacttcgagcgtttcatcttcgacctgc1500tcggccgcgacgccacccgcgtcaacgatctatttggtacccaggttcgccaaggcggat1560tctcactggctgatgacgccaactttgagaaggctgcagcagaatacggtttcgcctccg1620gacgatccacccatgctgaccgtgtggcaaccatcgctgacgtgcattcccgcctcgacg1680tactaatcgatccccacaccgccgacggcgttcacgtggcacgccagtggagggacgagg1740tcaacaccccaatcatcgtcctagaaactgcactcccagtgaaatttgccgacaccatcg1800tcgaagcaattggtgaagcacctcaaactccagagcgtttcgccgcgatcatggatgctc1860cattcaaggtttccgacctaccaaacgacaccgatgcagttaagcagtacatagtcgatg1920cgattgcaaacacttccgtgaagtaacttgctttacgccaaggcctgattcctctcttta1980tgggatggaaccaggcctttcgcattgagtggcgttttaaggcctccaattcttagaacg2040ggtgtttgacatggaggggtcacagtcaagccgttagaagcgattctgggagggcaagtt2100tttcggagttggaggtcgaatttccgctgaactgatgggaaccagacaggcgtgacaaga2160ttggctaaaaacctgaagttttgtcacgcctgtctggtttccctcttgtcggtgcgagcg2220agtcccttgaacgacacagatcgcgccaaatggaagtgtctgcgaccccagaatatttga2280ttccccggtccgagtcgtgcgaaaaatgctctggttagtcctcgatcatcgcaatcgcat2340caatttccacagttgcaccataaggaagcgatgatgcacccacgaaagagcgtgccgggc2400ggccttcgaggaaatgctctcggaattgctcgttgcattcttcgcg2446<210>21<211>2470<212>DNA<213>thrE<400>21cagcaagatctagtcatcaatctggtcaacgaatttaaggagcttaatttgaacacgcca60tatgaaaagtgactaatttcaacccaaacgggagcctaagtgaaatgaaataatcccctc120accaactggcgacattcaaacaccgtttcatttccaaacatcgagccaagggaaaagaaa180gcccctaagccccgtgttattaaatggagactttttggagacctcaagccaaaaaggggc240attttcattaagaaaatacccctttgacctggtgttattgagctggagaagagacttgaa300ctctcaacctacgcattacaagtgcgttgcgctgccaattgcgccactccagcaccgcag360atgctgatgatcaacaactacgaatacgtatcttagcgtatgtgtacatcacaatggaat420tcggggctagagtatctggtgaaccgtgcataaacgacctgtgattggactctttttcct480tgcaaaatgttttccagcggatgttgagttttgcgacccttcgtggccgcatttcaacag540ttgacgctgcaaaagccgcacctccgccatcgccactagccccgattgatctcactgacc600atagtcaagtggccggtgtgatgaatttggctgcgagaattggcgatattttgctttctt660caggtacgtcaaatagtgacaccaaggtacaagttcgagcagtgacctctgcgtacggtt720tgtactacacgcacgtggatatcacgttgaatacgatcaccatcttcaccaacatcggtg780tggagaggaagatgccggtcaacgtgtttcatgttgtaggcaagttggacaccaacttct840ccaaactgtctgaggttgaccgtttgatccgttccattcaggctggtgcgaccccgcctg900aggttgccgagaaaatcctggacgagttggagcaatcccctgcgtcttatggtttccctg960ttgcgttgcttggctgggcaatgatgggtggtgctgttgctgtgctgttgggtggtggat1020ggcaggtttccctaattgcttttattaccgcgttcacgatcattgccacgacgtcatttt1080tgggaaagaagggtttgcctactttcttccaaaatgttgttggtggttttattgccacgc1140tgcctgcatcgattgcttattctttggcgttgcaatttggtcttgagatcaaaccgagcc1200agatcatcgcatctggaattgttgtgctgttggcaggtttgacactcgtgcaatctctgc1260aggacggcatcacgggcgctccggtgacagcaagtgcacgatttttcgaaacactcctgt1320ttaccggcggcattgttgctggcgtgggtttgggcattcagctttctgaaatcttgcatg1380tcatgttgcctgccatggagtccgctgcagcacctaattattcgtctacattcgcccgca1440ttatcgctggtggcgtcaccgcagcggccttcgcagtgggttgttacgcggagtggtcct1500cggtgattattgcggggcttactgcgctgatgggttctgcgttttattacctcttcgttg1560tttatttaggccccgtctctgccgctgcgattgctgcaacagcagttggtttcactggtg1620gtttgcttgcccgtcgattcttgattccaccgttgattgtggcgattgccggcatcacac1680caatgcttccaggtctagcaatttaccgcggaatgtacgccaccctgaatgatcaaacac1740tcatgggtttcaccaacattgcggttgctttagccactgcttcatcacttgccgctggcg1800tggttttgggtgagtggattgcccgcaggctacgtcgtccaccacgcttcaacccatacc1860gtgcatttaccaaggcgaatgagttctccttccaggaggaagctgagcagaatcagcgcc1920ggcagagaaaacgtccaaagactaatcagagattcggtaataaaaggtaaaaatcaacct1980gcttaggcgtctttcgcttaaatagcgtagaatatcgggtcgatcgcttttaaacactca2040ggaggatccttgccggccaaaatcacggacactcgtcccaccccagaatcccttcacgct2100gttgaagaggaaaccgcagccggtgcccgcaggattgttgccacctattctaaggacttc2160ttcgacggcgtcactttgatgtgcatgctcggcgttgaacctcagggcctgcgttacacc2220aaggtcgcttctgaacacgaggaagctcagccaaagaaggctacaaagcggactcgtaag2280gcaccagctaagaaggctgctgctaagaaaacgaccaagaagaccactaagaaaactact2340aaaaagaccaccgcaaagaagaccacaaagaagtcttaagccggatcttatatggatgat2400tccaatagctttgtagttgttgctaaccgtctgccagtggatatgactgtccacccagat2460ggtagctata2470當(dāng)前第1頁1 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