本發(fā)明涉及重金屬尾礦修復(fù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法。

【技術(shù)背景】

生態(tài)環(huán)境與社會發(fā)展是當(dāng)前國際社會關(guān)注的重大問題，礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用所引起的一系列的生態(tài)、社會及經(jīng)濟(jì)等問題是環(huán)境與發(fā)展的焦點之一。礦山廢棄地不僅破壞和占用大量的土地資源，而且尾礦往往含有多種污染物，如極端的pH、重金屬含量過高和有害的礦物材料等，污染物通過大氣及水體等途徑擴(kuò)散，給周邊地區(qū)帶來了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染。礦山廢棄物中重金屬污染最為嚴(yán)重，由于重金屬進(jìn)入土壤后不易分解、轉(zhuǎn)化或富集，以及土壤十分貧瘠，使得礦業(yè)廢棄地重金屬污染的治理變得十分困難，導(dǎo)致土壤退化。目前，礦業(yè)廢棄地修復(fù)的方法主要有物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)發(fā)以及生物修復(fù)法，由于生物修復(fù)發(fā)比較經(jīng)濟(jì)，而且又不會造成二次污染，所以現(xiàn)在許多研究人員尋求用生物的方法修復(fù)尾礦。

微生物修復(fù)技術(shù)是生物修復(fù)法的一種，土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中有重要作用，直接推動著土壤的物質(zhì)循環(huán)和能量流動，并通過影響土壤物質(zhì)的合成與分解，從而間接地影響著植物的生長，土壤微生物在整個生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。植物根際促生菌(PGPR)是定居于植物根部可以通過分泌植物激素、特異性酶和抗生素，以及可以產(chǎn)生如含鐵細(xì)胞、大分子螯合物和植物病原體抑制物質(zhì)來促進(jìn)植物的生長。PGPR也可以通過合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯(ACC)脫氨酶(以下簡稱ACC細(xì)菌)來促進(jìn)植物的生長，ACC脫氨酶在許多微生物種類中存在，包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、根瘤菌等。植物根系產(chǎn)生大量的ACC在植物體內(nèi)被ACC氧化酶分解生成乙烯，植物體內(nèi)大量的乙烯的生成會阻止植物的生長；ACC也會被分泌到植物根或種子外面，然后被ACC細(xì)菌所產(chǎn)生的ACC脫氨酶所分解為氨和α-酮丁酸，ACC菌所產(chǎn)生的ACC脫氨酶阻止了乙烯的產(chǎn)生，降低了植物根部乙烯的濃度，從而阻止了乙烯對于植物根的生長阻止作用。ACC細(xì)菌已被證實可以在不同的脅迫下促進(jìn)植物生長，包括鹽脅迫、干旱脅迫、重金屬脅迫以及有機物脅迫。ACC細(xì)菌作為PGPR中的一類，也可以合成和分泌植物生長因子吲哚乙酸(IAA)，IAA可以進(jìn)入植物細(xì)胞促進(jìn)植物生長。因此，分離并研究植物根系A(chǔ)CC細(xì)菌對重金屬尾礦修復(fù)有重要的作用。

本發(fā)明旨在從安徽省銅陵市楊沖山銅尾礦上生長的植株根系篩選ACC細(xì)菌，測定其特性、進(jìn)行評價以及其對植物生長的促進(jìn)作用，解決銅陵市銅尾礦重金屬含量高，土壤貧瘠，無法種植或定植植物生長不良的問題，對推動全國重金屬尾礦修復(fù)也具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于從銅尾礦上生長的植物群落的根系分離產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶菌株(下簡稱ACC菌株)，植物群落包括白茅群落(imperata cylindrica)、狗牙根群落(cynodon dactylon)、月見草群落(oenothera erythrosepala)和直立黃芪群落(astragalus adsurgens)等常見群落，獲得優(yōu)良的菌株并將其應(yīng)用于尾礦修復(fù)領(lǐng)域，可以使植物更好的在尾礦土上定植，以克服現(xiàn)有技術(shù)中植株在尾礦上無法生長或生長不良的不足。

本發(fā)明是一種銅尾礦上植物根際促生菌的分離及其性能評價的方法，具體包括ACC菌株的篩選方法、性能評價方法以及對于植物促生效應(yīng)的評價方法。

本發(fā)明具體技術(shù)方法如下：

1、ACC菌株的篩選

樣品采集：以多點法分別從銅尾礦上的植物群落的根系分離土壤各1kg，0℃低溫保存，并在48小時內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行ACC菌株分離；

ACC菌株分離與篩分純化：將1克根際土壤加入PAF培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24小時，再取0.1ml的菌懸液到含有3mmol/L的DF培養(yǎng)基中，在28℃下，搖床培養(yǎng)3天；將0.1ml的菌懸液加入到不含ACC的DF培養(yǎng)基中，作為空白對照。將菌液稀釋100倍后涂布于DF培養(yǎng)基(先用3mmol/L ACC涂布在DF固體培養(yǎng)基上)上。篩選出以利用ACC為氮源的根際促生菌。

ACC脫氨酶活性測定：在28℃下，供試菌株在TSB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，4℃離心收集，菌體細(xì)胞用DF培養(yǎng)液洗滌三次，重新懸浮于ADF培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)2d后，4℃離心收集菌體，用0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH＝7.6)洗滌三次，重新懸浮于600ul 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH＝8)中，加入30ul甲苯并迅速震蕩30s以破碎細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至200ul含甲苯的細(xì)胞提取物，加入20ul 0.5mol/L的ACC混勻，同時做不添加ACC的空白試驗。在30℃下，培養(yǎng)15分鐘，添加1ml 0.56mol/L HCl，8000g離心10分鐘，取1ml懸浮液，加入800ul 0.56mol/L HCl和300ul 2,4-二硝基苯肼，30℃培養(yǎng)30分鐘，加入2ml 2mol/L NaOH，終止反應(yīng)，在540nm下測吸光度。蛋白質(zhì)測定采用BioRad蛋白質(zhì)微量測定法，以牛血清蛋白為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。ACC脫氨酶活單位為umolα-KA·(mgPr·h)-1。酶活性測定均扣除樣品對照空白后計算，重復(fù)3次。

IAA分泌量測定：供試菌株先在DF培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d，再微量轉(zhuǎn)入添加色氨酸的DF培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2d。取樣測菌液的OD600，其余培養(yǎng)液室溫下8000g離心，取500ul上清液，添加2ml Salkowski試劑，溫室培養(yǎng)20分鐘后，在535nm處測吸光度。IAA含量單位為ug·(ml·OD600)-1，IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線平行2次，樣品重復(fù)3次。

鐵載體分泌量測定：取0.0605g鉻天青S溶于50ml水中，并與10ml 1mmol/L的FeCl3溶液混勻，得溶液A；將0.0729g的十六烷基三甲基溴化銨溶于8ml水中，得溶液B；將A溶液緩慢加入B溶液中，充分混勻，得到鉻天青S染液，定容到1L。先制備LB固體培養(yǎng)基，等凝固后切去一半，再將加入瓊脂粉的CAS染液倒入，取CAS染液上產(chǎn)生顯色圈的菌株，根據(jù)其顯色圈的大小判斷其分泌鐵載體的能力。

菌株溶磷量測定：將已純化的菌株接種于Pikouskaya氏無機磷培養(yǎng)基的平板中，放入28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后取出觀察溶磷圈大小，通過測定溶磷圈直徑，從而比較他們?nèi)芙鉄o機磷能力的大小。

所用培養(yǎng)基配方為：PAF培養(yǎng)基配方為(1L)：蛋白胨10g，酪蛋白水解物10g，MgSO4 1.5g，K2HPO4 1.5g，甘油10ml，pH值為7.5；TSB培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨17g，大豆胨3g，NaCl 5g，葡萄糖2.5g，K2HPO4 2.5g，pH值為7.5；DF培養(yǎng)基配方為：KH2PO4 4g，Na2HPO4·7H2O 11.3g，MgSO4 0.2g，F(xiàn)eSO4 0.01mg，葡萄糖2g，葡萄糖酸2g，檸檬酸2g，(NH4)2SO4 2g，pH值為7.5；ADF培養(yǎng)基配方為(1L)：50mmol/LACC替代DF培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4作為唯一氮源；Pikovskaya氏培養(yǎng)基為(1L)：酵母提取物0.5g，葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.2g，MgSO4 0.1g，MnSO4 0.0001g，F(xiàn)eSO4 0.0001g，pH值為7.5；Salkowski試劑配方為：濃硫酸150ml，蒸餾水250ml，0.5mol/L FeCl3·6H2O 7.5ml(1.35g溶于10ml水中)；LB培養(yǎng)基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH值為7.5；

2、ACC菌種性能評價：通過對ACC脫氨酶、IAA產(chǎn)生量、鐵載體產(chǎn)生量以及溶磷能力四個指標(biāo)對ACC菌種進(jìn)行能力大小排序，ACC脫氨酶權(quán)重為5，IAA產(chǎn)生量權(quán)重為3，鐵載體產(chǎn)生量權(quán)重為2，溶磷能力權(quán)重為1，計算公式為ACC菌種性能數(shù)值＝ACC脫氨酶量×5+IAA產(chǎn)生量×3+鐵載體產(chǎn)生量×2+溶磷圈直徑×1，最終可以對每個菌種的性能綜合評估；

3、菌株重金屬耐性試驗：在ADF培養(yǎng)基中加入不同量的硫酸銅，將培養(yǎng)皿按照硫酸銅濃度0mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L以及1000mg/L，設(shè)置成5個不同梯度；將純化后的菌種分別接種于不同濃度的固體培養(yǎng)基上，測試其生長情況；

4、盆栽試驗：分別選用本土及外來植株進(jìn)行ACC接種試驗，以未浸染的種子為對照，取銅尾礦表層0-30cm土壤，均勻過篩，滅菌后裝于栽培盆中；將供試植物種子用70％酒精消毒1分鐘，1％次氯酸鈉消毒10分鐘，之后用無菌水洗滌3-5次；將消過毒的植物種子，浸與菌懸液中2-4h，使用一種或多種菌株，取出播種用，以無菌水的處理作為對照；將處理后的種子播種于尾礦土中，每盆10-15粒種子，追施有機肥，并在種子發(fā)下后2-4天和15-20天追施加菌劑，溫室培養(yǎng)，隔天澆一次水，維持土壤的含水量。60-180天后收獲盆中的植株，分別測量根長、根干重、地上部分長和地上部分干重，以及地上地下部分的重金屬含量分析。本發(fā)明的技術(shù)效果如下：

本發(fā)明采用改良后的技術(shù)方法篩選ACC細(xì)菌，并對分離出的ACC細(xì)菌進(jìn)行了綜合評價，并實施了不同植株的侵染生長試驗，對植物根部的ACC細(xì)菌進(jìn)行了局部富集，使其對植物在銅尾礦上生長的作用更加明顯，本發(fā)明方法可以推廣至全國各種尾礦ACC細(xì)菌的分離篩選。

【附圖說明】

圖1為實例中分離菌株ACC脫氨酶活性；圖2為實例中分離菌株IAA合成酶活性；圖3為象草60天的生長情況；圖4為月見草60天生長情況。

【具體實施方式】

本發(fā)明的實施方式具體步驟為：1)采集銅尾礦上不同植株的根際土壤；2)ACC細(xì)菌菌株的分離及純化；3)ACC細(xì)菌的性能測試；4)ACC細(xì)菌的性能評價；5)ACC細(xì)菌對植物促生效應(yīng)的評價。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實施例1：

1、按照本發(fā)明所述的采樣方法，采集安徽省銅陵市楊沖山銅尾礦上不同植株的根際土壤，在48小時內(nèi)帶回實驗室進(jìn)行微生物分離試驗，其中，采樣時先挖去植物周圍尾礦土，將植物根系連同土壤一同緩慢取出，根系攜帶土壤抖落到采樣袋中，不足土壤從根系周邊5cm范圍內(nèi)補充，本次共取到4種植株的根際土壤，包括白茅群落(imperata cylindrica)、狗牙根群落(cynodon dactylon)、月見草群落(oenothera erythrosepala)和直立黃芪群落(astragalus adsurgens)，每種植株平行采集5個樣品，共采集20個樣品；

2、按照本發(fā)明所述分離方法，分離出4種分泌ACC脫氨酶菌株，分別為一種細(xì)桿菌屬(microbacterium oxydans，簡稱ACC1)、一種克雷白氏桿菌屬(klebsiella pneumonia，簡稱ACC2)、兩種假單胞菌屬(pseudomonas.sp.，簡稱ACC3和ACC4)；

3、菌株性能測試

本實例對分離出的菌株進(jìn)行性能測試，測試其ACC脫氨酶活性、IAA合成酶活性、鐵載體分泌圈以及溶磷圈，菌株測試結(jié)果見下表，其中ACC脫氨酶活性ACC2＞ACC4＞ACC3＞ACC1，IAA合成酶活性為ACC2＞ACC3＞ACC1＞ACC4，體載體分泌圈為ACC4＞ACC1＞ACC2＞ACC3，溶磷圈為ACC1＞ACC2＞ACC3＞ACC4，可以看到各個菌株不同指標(biāo)性能差異比較大，無法很好地評價其綜合性能。

表1 4種菌株的性能測試

4、菌株性能評價

菌株綜合性能評價，從表2可以看出ACC2＞ACC3＞ACC1＞ACC1，其綜合性能ACC2菌株最好，ACC1菌株最差，可以很直觀的反映出各個菌株之間的差距。

表2綜合評價指標(biāo)

從表3中可以看出，這四種菌株均有較強的耐銅性能，菌株ACC2的生長最快，菌株ACC1的生長最慢，可以側(cè)面驗證綜合評價指標(biāo)與菌株性能之間呈現(xiàn)正相關(guān)。

表3耐銅性能測試

5、菌株對植物促生效應(yīng)的評價

分別用月見草(oenothera erythrosepala)、象草(pennisetum purpureum)、黑麥草(perennial ryegrass)以及紫花苜蓿(medicago sativa)進(jìn)行ACC接種試驗，以未浸染的種子為對照，取銅尾礦表層0-20cm土壤，均勻過篩，滅菌后裝于栽培盆中；將供試植物種子用70％酒精消毒1min，1％次氯酸鈉消毒10％，之后用無菌水洗滌5次；將消過毒的植物種子，浸與菌懸液中2h，使用一種或多種菌株，取出播種用，以無菌水的處理作為對照；將處理后的種子播種于尾礦土中，每盆10粒種子，追施有機肥，并在種子發(fā)下后2天和15天追施加菌劑，溫室培養(yǎng)，隔天澆一次水，維持土壤的含水量。60天后收獲盆中的植株，分別測量根長、根干重、地上部分長和地上部分干重。圖3為象草60天的生長情況，圖4為月見草60天生長情況。

從表4中可以看出，混合菌株對于土著植株以及外來植株均有明顯的生長促進(jìn)效果，可以為以后銅尾礦土壤改良提供有益的幫助。

表4菌株對不同植物生長的促生作用

上述實施例僅是對本發(fā)明的說明而不限于本實施例。此外，在閱讀了本發(fā)明內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明做出的各種修改，在本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。