技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明具體涉及包括利用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的菌株、方法及應(yīng)用，屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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豌豆是制取粉絲用淀粉的主要豆類產(chǎn)品之一，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)和膳食纖維。在我國(guó)，除少量豌豆用來(lái)直接食用外，約98%的豌豆用來(lái)加工成淀粉、蛋白和生產(chǎn)粉絲。無(wú)論是傳統(tǒng)的“酸漿法”豌豆淀粉生產(chǎn)工藝，還是現(xiàn)代的豌豆蛋白、豌豆淀粉生產(chǎn)工藝過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量廢水，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。目前我國(guó)豌豆粉絲生產(chǎn)企業(yè)中，每生產(chǎn)一噸豌豆粉絲會(huì)產(chǎn)生13-15噸廢水，而“粉絲之都”招遠(yuǎn)每年產(chǎn)生的粉絲廢水高達(dá)600萬(wàn)噸。這些廢水中含有豐富的蛋白質(zhì)，膳食纖維，低聚糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，COD、BOD、SS等指標(biāo)特別高，此類污水治理難度非常大，投入成本很高，同時(shí)造成了資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。

枯草芽孢桿菌大量應(yīng)用于生物肥料，當(dāng)作用于作物或土壤時(shí)，能夠在作物根際或體內(nèi)定殖，并起到特定肥料效應(yīng)，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對(duì)硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用方面廣泛應(yīng)用，既能夠保護(hù)環(huán)境，又可以提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全。

目前已有的枯草芽孢桿菌液體生物肥料菌劑有固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝和液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝兩種。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝很難做到純種發(fā)酵，且勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)環(huán)境惡劣；液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝生產(chǎn)方式先進(jìn)，但生產(chǎn)成本高、售價(jià)高，限制了產(chǎn)品的推廣應(yīng)用。另外有的枯草芽孢桿菌沒(méi)有經(jīng)過(guò)專項(xiàng)選育，肥效不好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的菌株、方法及應(yīng)用，高質(zhì)化解決豌豆蛋白廠廢水的綜合利用問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案：本發(fā)明用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的菌株為納豆枯草芽孢桿菌，保藏名稱為：Bacillus subtilis LD-9308，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。

用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）菌種活化：

采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.0-7.5；

在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-24小時(shí)，備用；

（2）搖瓶種子制備：

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 10-20，蛋白胨 5-15，酵母提取物 3-5， KH₂PO₄ 1-3，MgSO₄ 0.2-0.5，余量水，pH 6.5-7.5；

250ml三角瓶裝液量為20-50ml，500ml三角瓶裝液量為40-80ml，115℃滅菌20-30分鐘；

在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200-250 rpm，培養(yǎng)時(shí)間6-15小時(shí)；

（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸銨5-10，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 6.5-7.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量0.5%-2.0%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量1：0.2-0.5,培養(yǎng)時(shí)間6-12小時(shí)；

（4）發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基：豌豆蛋白廢水，pH 6.5-7.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量1%-3%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培養(yǎng)時(shí)間15-25小時(shí)，菌體濃度達(dá)到2.0×10⁹ CFU/mL以上。

用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑在生物肥料的應(yīng)用，生產(chǎn)的液體菌劑稀釋200倍后,以灌根法施肥于西紅柿、黃瓜等蔬菜作物，顯示出顯著的增產(chǎn)、抗病效果。

本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果：本發(fā)明完全以豌豆蛋白廢水為培養(yǎng)基，能夠?qū)ν愣沟鞍讖U水進(jìn)行高質(zhì)化利用，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，效果好，解決環(huán)境污染，菌體濃度高，能夠產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明利用豌豆蛋白廢水生產(chǎn)的納豆枯草芽孢桿菌液體菌劑在農(nóng)作物栽培中應(yīng)用，表現(xiàn)出了顯著的增效、抗病毒作用。

具體實(shí)施方式：下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明利用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的菌株為納豆枯草芽孢桿菌，保藏名稱為：Bacillus subtilis LD-9308，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。

菌種選育、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化：以自然菌種富集法制作納豆，從拉絲好的納豆制品中分離芽孢桿菌菌株。從分離純化的685株菌中，篩選到一株聚谷氨酸產(chǎn)量高的菌株，首先按芽孢桿菌的要求進(jìn)行了傳統(tǒng)方法鑒定，包括形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定，如革蘭氏染色和芽孢染色，接觸酶、甲基紅、V-P 反應(yīng)、硝酸鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、水解淀粉、明膠液化、卵磷脂酶、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、形成吲哚、分解酪素等試驗(yàn)，表明為芽孢桿菌屬。又進(jìn)行了16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物純化和測(cè)序，利用Blast軟件與基因庫(kù)中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，菌株l6S rDNA與枯草芽孢桿菌的16s rDNA序列同源性達(dá)99.12% ，表明該菌株確為枯草芽孢桿菌。對(duì)該菌株的產(chǎn)生聚谷氨酸的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

實(shí)施例1：用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的方法，其包括如下步驟：

（1） 菌種活化：

采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.0；

在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10小時(shí)，備用。

（2）搖瓶種子制備：

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨 10，酵母提取物4， KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 0.3 余量水，pH 7；

250ml三角瓶裝液量為35ml，500ml三角瓶裝液量為60ml，115℃滅菌25分鐘；

在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速220 rpm，培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。

（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，硫酸銨8，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 7；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量1.0%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-250 rpm，通氣量1：0.3,培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基：豌豆蛋白廢水，pH 6.9；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量2%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.25,后期1：0.4,培養(yǎng)時(shí)間21小時(shí)，菌體濃度達(dá)到3.8×10⁹ CFU/mL。

將生產(chǎn)的液體菌劑稀釋200倍后,以灌根法施肥于西紅柿、黃瓜等蔬菜作物，顯示出顯著的增產(chǎn)、抗病效果。

實(shí)施例2：用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的方法，其包括如下步驟：

（1）菌種活化：

采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH 7.2；

在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15小時(shí)，備用。

（2）搖瓶種子制備：

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10，蛋白胨 5，酵母提取物3， KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.2 ，余量水，pH 6.5；

250ml三角瓶裝液量為20ml，500ml三角瓶裝液量為40ml，115℃滅菌20分鐘；

在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí)。

（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，硫酸銨5，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 6.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量0.5%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量1：0.2,培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí)。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基：豌豆蛋白廢水，pH 6.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量1%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量前10小時(shí)1：0.2,后期1：0.3,培養(yǎng)時(shí)間15小時(shí)，菌體濃度達(dá)到2.5×10⁹ CFU/mL。

將生產(chǎn)的液體菌劑稀釋200倍后,以灌根法施肥于西紅柿、黃瓜等蔬菜作物，顯示出顯著的增產(chǎn)、抗病效果。

實(shí)施例3：用豌豆蛋白廢水液體發(fā)酵生產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌菌劑的方法，其包括如下步驟：

（1）菌種活化：

采用斜面培養(yǎng)基對(duì)保存的納豆枯草芽孢桿菌種進(jìn)行活化，菌種活化用的斜面培養(yǎng)基為固體LB固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，瓊脂粉15，余量水，pH7.5；

在斜面培養(yǎng)基上無(wú)菌操作，劃線，置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，備用。

（2）搖瓶種子制備：

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨15，酵母提取物5， KH₂PO₄ 3，MgSO₄ 0.5，余量水，pH 7.5；

250ml三角瓶裝液量為50ml，500ml三角瓶裝液量為80ml，115℃滅菌30分鐘；

在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌操作接種三角瓶培養(yǎng)基，每瓶接種一環(huán)上述活化后的菌種，置于恒溫?fù)u床37℃培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速250 rpm，培養(yǎng)時(shí)間15小時(shí)。

（3）發(fā)酵種子罐液體菌種制備：

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，硫酸銨10，余量為豌豆蛋白廢水，以氨水調(diào)節(jié)pH 7.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種搖瓶種子，接種量2.0%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速250 rpm，通氣量1： 0.5,培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基：豌豆蛋白廢水，pH 7.5；

115℃滅菌30分鐘，降溫至38℃以下，接種種子罐液體菌種，接種量3%（V/V）；

培養(yǎng)參數(shù)：溫度37±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速250 rpm，通氣量前10小時(shí)1： 0.3,后期1： 0.5,培養(yǎng)時(shí)間25小時(shí)，菌體濃度達(dá)到2.3×10⁹ CFU/mL。

將生產(chǎn)的液體菌劑稀釋200倍后,以灌根法施肥于西紅柿、黃瓜等蔬菜作物，顯示出顯著的增產(chǎn)、抗病效果。

以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，其它優(yōu)選實(shí)施方式在此不一一累述，且并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落于本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。