專利名稱：天山雪蓮抗寒基因SiCOR3708及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中基因克隆和生物體轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉 及一種天山雪蓮抗寒基因及其在植物抗寒中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
溫度是植物正常生長(zhǎng)、生存的重要條件之一，同時(shí)也是限制植物形態(tài)和分布的重 要因素之一。低溫傷害植物已成為全球公害。我國(guó)緯度跨度大，氣候多樣，寒害時(shí)有發(fā)生， 而且近年來看在非寒冷季節(jié)寒害已經(jīng)成為我國(guó)重要自然災(zāi)害之一，并且有逐漸加劇趨勢(shì)， 有可能成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最大的自然災(zāi)害。目前，解決寒害基本途徑有三條第一，采取更加 先進(jìn)的栽培技術(shù)；第二，對(duì)已有植物品種，尤其是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物品種進(jìn)行改良， 然而傳統(tǒng)改良方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并缺乏針對(duì)性；第三，隨植物抗寒機(jī)制的研究，抗寒相關(guān)基因 的克隆以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，以相關(guān)受體植株的轉(zhuǎn)基因植物的研究，使得基因工程培育 高效抗寒品種成為一種重要途徑，因此，迫切需要開發(fā)抗寒的相關(guān)基因與蛋白。在1970年Weiser提出低溫鍛煉可能會(huì)引起基因表達(dá)改變的設(shè)想，之后通過大量 研究表明大多數(shù)植物在低溫鍛煉過程中均有冷調(diào)節(jié)物質(zhì)的存在，目前已經(jīng)從棉花、大麥、水 稻、冬葡萄、花椰菜、擬南芥、黑麥、沙冬青、胡蘿卜、紅景天等多種植物中發(fā)現(xiàn)冷調(diào)節(jié)基因。 而天山雪蓮有著極強(qiáng)的生命力，耐寒能力很強(qiáng)，是天山上植物分布最高上線的惟一大型高 等植物，其有效積溫的生理功能具有很高的利用性。如果將獲得這種雪蓮抗凍蛋白基因與 植物表達(dá)載體連接，再導(dǎo)入棉花、小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物中，可提高植物的抗寒性能，產(chǎn) 生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，尤其是可挽回4月至5月“倒春寒”對(duì)農(nóng)作物造成的經(jīng)濟(jì)損失，甚至可 使農(nóng)作物提前早播或延長(zhǎng)種植期，把對(duì)霜凍敏感的農(nóng)作物改造成耐霜凍的農(nóng)作物，并延長(zhǎng) 農(nóng)作物的生產(chǎn)期。因此，這一技術(shù)應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種天山雪蓮中克隆抗寒相關(guān)基因SiC0R3708及其制備方法。本發(fā)明所提供的SiC0R3708基因如序列表中序列1所示，由632個(gè)堿基組成，該基 因的編碼框?yàn)樽?’端28至585堿基；以及與序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性， 且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列1所述的DNA序列，是通過以下技術(shù)得到。將雪蓮組培苗在4°C培養(yǎng)0.5小 時(shí)后，提取其mRNA，同時(shí)提取20°C生長(zhǎng)的雪蓮無菌苗的mRNA，采用抑制差減雜交技術(shù)，得到 雪蓮低溫誘導(dǎo)cDNA差減文庫，對(duì)文庫中的cDNA片斷進(jìn)行序列測(cè)定，得到雪蓮SiC0R3708基 因。經(jīng)Northern雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，與雪蓮抗寒性有密切關(guān)系。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供雪蓮SiC0R3708基因在植物抗寒中應(yīng)用。具體的， 本發(fā)明將構(gòu)建的SiC0R3708基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗寒能力。以植物表達(dá)載體pCHF3為基礎(chǔ)，將雪蓮SiC0R3708基因克隆于Smal位點(diǎn)，
3SiC0R3708基因的表達(dá)受啟動(dòng)子CaMV 35S的調(diào)控，將其命名為pCHF3_SiC0R3708。將重組 載體pCHF3-SiC0R3708轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后，以農(nóng)桿菌“浸花法”導(dǎo)入模式植物擬南芥中， 通過卡那霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)基因擬南芥純系。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥總DNA， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定雪蓮SiC0R3708基因已經(jīng)整合在基因組中；提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型 擬南芥總RNA，進(jìn)行RT-PCR，確定雪蓮SiC0R3708基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中正確表達(dá)。將溫室 中生長(zhǎng)2周的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥同時(shí)在_8°C處理6小時(shí)，之后繼續(xù)在溫室中生 長(zhǎng)2周，統(tǒng)計(jì)凍后存活率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥的存活率顯著高于野生型擬南芥。通過實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果1、提供了一種天山雪蓮抗寒相關(guān)基因SiC0R3708。2、將構(gòu)建的SiC0R3708基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗 寒能力。


圖1所示為雪蓮Si⑶R3708基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)情況，圖中第一排為雪蓮組培苗 總RNA變性膠電泳，第二排為雪蓮組培苗Northern雜交結(jié)果，其中1為生長(zhǎng)于22°C雪蓮苗， 2為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)30min，3為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)lh，4為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)2h，5 為雪蓮苗在4°C下培養(yǎng)3h。圖2所示為pCHF3_SiC0R3708重組表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。圖3所示為轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定結(jié)果，圖中1為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，從上至下依次 為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2為野生型擬南芥，3_16為轉(zhuǎn)基因擬南芥。圖4所示為轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR鑒定結(jié)果，圖中1為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量，從上至下依 次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ；2為野生型擬南芥，3_16為轉(zhuǎn)基因擬南芥。
具體實(shí)施例方式下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的 說明中，如無特別說明，則％皆指質(zhì)量百分比。實(shí)施例1 天山雪蓮SiC0R3708基因的克隆將雪蓮實(shí)生苗在4°C培養(yǎng)0. 5小時(shí)，采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總 RNA，利用 cDNA 抑制差減試劑盒(PCR-Select cDNA Subtraction kit，Clontech 公司)， 按其操作步驟，構(gòu)建與天山雪蓮抗寒有關(guān)的cDNA差減文庫，從中挑選1800個(gè)cDNA，分別與 正向、反向差減cDNA進(jìn)行雜交，從中挑選有正向雜交信號(hào)，而沒有反向雜交信號(hào)的cDNA進(jìn) 行核苷酸序列測(cè)定，得到雪蓮SiC0R3708基因，序列見序列表1，基因全長(zhǎng)為632bp，具有一 個(gè)完整的閱讀框(28-588bp)以及5，非翻譯區(qū)(l-27bp)和3，非翻譯區(qū)(589_632bp)，閱 讀框?yàn)?8-588bp，5，非翻譯區(qū)為l-27bp，3，非翻譯區(qū)為589_632bp，該序列在NCBI中經(jīng) Blast比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)同源序列。將雪蓮組培苗分別在20°C、4°C下培養(yǎng)0.5小時(shí)后，用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取總RNA后，以同位素標(biāo)記的雪蓮SiC0R3708基因?yàn)樘结樳M(jìn)行 Northern雜交，結(jié)果表明SiC0R3708基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，參見附圖1。實(shí)施例2 :SiC0R3708基因組成型高效表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體pCHF3_Si⑶R3708的構(gòu)建過程為首先以雪蓮cDNA為模板，擴(kuò)增得到 SiC0R3708基因全長(zhǎng)cDNA，擴(kuò)增引物如下，兩端帶有SmaI酶切位點(diǎn)
正向引物5，-CCCGGGATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-GGGCCCCTTACTCATATCCCGCCTCCA-3，反應(yīng)條件為95°C，4min，l個(gè)循環(huán)；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 個(gè)循 環(huán)；72°C，lOmin，結(jié)束反應(yīng)。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，進(jìn)行Small酶切、純化，同時(shí)對(duì) 載體pCHF3也進(jìn)行Small酶切、脫磷反應(yīng)并純化，之后進(jìn)行連接反應(yīng)，對(duì)得到的重組載體首 先用限制性內(nèi)切酶SpecI和SalI進(jìn)行雙酶切，挑選酶切片斷中有400bp的重組載體，接著 進(jìn)行PCR鑒定，所用引物序列如下正向引物5，-GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3，反向引物5，-ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3，反應(yīng)條件如下95°C，4min，l個(gè)循環(huán)；94°C，30sec，54°C，30sec，72°C，lmin，30 個(gè) 循環(huán)；72°C，10min，結(jié)束反應(yīng)。挑選擴(kuò)增產(chǎn)物大小為400bp的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過上述 步驟最終得到高效表達(dá)SiC0R3708基因的植物表達(dá)載體pCHF3-SiC0R3708。載體包括CaMV 35s啟動(dòng)子、RBCS終止子、目的基因SiC0R3708基因、卡那霉素抗性基因NPTII、壯觀霉素抗 性基因SpeC、半乳糖苷酶基因LacZ。詳細(xì)載體結(jié)構(gòu)參見附圖2。實(shí)施例3 :pCHF3-SiC0R3708表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌接種農(nóng)桿菌GV3101單菌落于50mlYEB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_ 為0. 4，冰浴30分鐘，4000rpm離心10分鐘，收集菌體并用IOml 0. 15M CaCl2懸浮。再次 離心收集菌體，懸浮于Iml 20mM CaCl2溶液中，取IOOul菌液裝入無菌1. 5ml離心管中，加 入0. 5ug pCHF3-SiC0R3708質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30分鐘，在液氮中迅速冷凍1分鐘，37°C 融化后，加入Iml YEB培養(yǎng)液，280C、IOOrpm培養(yǎng)2小時(shí)，4000rpm離心30秒后棄上清，加入 lOOulYEB培養(yǎng)液，菌體充分懸浮后涂布于含有50ug/ml壯觀霉素的YEB固體培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出，堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。實(shí)施例4 :PCHF3-SiC0R3708表達(dá)載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥在OD6tltl為0. 8的pCHF3-SiC0R3708表達(dá)載體農(nóng)桿菌溶液中，加入蔗糖至終濃度為 5%，將擬南芥花在其中浸泡5秒鐘后取出，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)種。收集單株種子，播種在含有 0.5%卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，置溫室中培養(yǎng)，挑選黃苗和綠苗數(shù)量比例為3 1的株系， 進(jìn)行再一次播種篩選，直至在含有0. 5%卡那霉素的MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的幼苗均為綠苗，即 為轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因擬南芥檢測(cè)PCR 檢測(cè)采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的總DNA，以此為模板，陽性對(duì)照為質(zhì)粒 pCHF3-SiC0R3708,陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因擬南芥總DNA，PCR擴(kuò)增所用引物如下正向引物5，-ATGAGTTATTCATACGATGA-3，反向引物5，-CTCATATCCCGCCTCCACCA-3，擴(kuò)增條件為94°C, 3 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；94°C, 30s, 53°C，30s, 72°C，lmin, 30 個(gè)循環(huán)； 72°C，10min，反應(yīng)結(jié)束后在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，得到大小為560bp的條帶，見附圖 3，初步證明該株系為轉(zhuǎn)基因株系。RT-PCR 檢測(cè)為了檢測(cè)SiC0R3708基因在轉(zhuǎn)基因植株中是否得到了表達(dá)，進(jìn)一步利用RT-PCR
5法進(jìn)行檢測(cè)。用CTAB法提取樣品總RNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用RT-PCR試劑盒 (Takara公司)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增SiC0R3708基因所用引物為
正向引物 5 ‘ -GAAACCGACCCTTTTTTCTA-3 ‘
反向引物 5 ‘ -ACTGACAAAGAGGCAAACAC-3 ‘?dāng)U增條件為94 °C，3 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；94 V，30s, 54 V，30s, 72 V，Imin, 30 個(gè)循 環(huán)；72°C，10min，反應(yīng)結(jié)束后在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，大小為400bp的條帶，則證明 SiC0R3708基因在擬南芥中得到了表達(dá)，參見附圖4。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗凍性能檢測(cè)將轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系和野生型擬南芥同時(shí)置于_8°C冰箱中處理6小時(shí)后取 出，置于溫室中培養(yǎng)，二周后統(tǒng)計(jì)植株存活率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥的存活率為80%，顯 著高于野生型的存活率(25% )，證明SiC0R3708基因的導(dǎo)入能提高擬南芥的抗寒性，且差 異顯著。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三個(gè)重復(fù)，利用Spassll. 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA處理以獲得平均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)誤差，并用t-test檢測(cè)顯著性差異(LSD)。
權(quán)利要求
一種天山雪蓮中克隆抗寒相關(guān)基因SiCOR3708如SEQUENCE LISTING所示，其特征在于，該SiCOR3708基因由632個(gè)堿基組成，該基因的編碼框?yàn)樽?’端28至585堿基；一個(gè)完整的閱讀框?yàn)?8 588bp，5’非翻譯區(qū)為1 27bp，3’非翻譯區(qū)為589 632bp。
2.如權(quán)利要求1所述的天山雪蓮中克隆抗寒相關(guān)基因SiC0R3708在植物抗寒中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種天山雪蓮抗寒基因SiCOR3708及其在植物抗寒中的應(yīng)用。通過將雪蓮組培苗在4℃培養(yǎng)0.5小時(shí)后，提取其mRNA，同時(shí)提取20℃生長(zhǎng)的雪蓮無菌苗的mRNA，采用抑制差減雜交技術(shù)，得到雪蓮低溫誘導(dǎo)cDNA差減文庫，對(duì)文庫中的cDNA片斷進(jìn)行序列測(cè)定，得到雪蓮SiCOR3708基因。該雪蓮SiCOR3708基因由632個(gè)堿基組成，該基因的編碼框?yàn)樽?’端28至585堿基，將構(gòu)建的SiCOR3708基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，可以顯著提高植株的抗寒能力。將獲得這種雪蓮抗凍蛋白基因與植物表達(dá)載體連接，再導(dǎo)入棉花、小麥、水稻、玉米等農(nóng)作物中，可提高植物的抗寒性能，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101899448SQ20101016669
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者徐虹, 李晨華, 歐陽平凱, 王博, 王志方, 艾秀蓮 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué);新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所;中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所