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一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝的制作方法

文檔序號:12696954閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于所述工藝包括以下步驟:

1)天山雪蓮細胞系篩選:采用天然雪蓮試管苗進行外植體誘導,獲得愈傷組織,對固體細胞進行Ser-137、uv-B誘變,低溫4℃處理,將MS培養(yǎng)基的含糖量提高至50-100g/L后作為篩選培養(yǎng)基,以篩選培養(yǎng)基反復進行篩選獲得細胞系,進行細胞系篩選時的培養(yǎng)條件為23-25℃,光周期為16h/8h,光照強度為1000-3000Lux,每兩周繼代一次;

2)搖瓶規(guī)模繼代培養(yǎng):挑選生長狀態(tài)良好,顏色鮮亮,質(zhì)地緊實的固體細胞放入含有培養(yǎng)液的搖瓶中,培養(yǎng)液為含有0.4~0.6mg/L 6-BA、0.8~1.2mg/L NAA的MS生長培養(yǎng)基,所述MS生長培養(yǎng)基的含糖量為20~40g/L,細胞接種量為30~50g/L,培養(yǎng)條件為23-25℃,光周期為16h/8h,光照強度為1000-3000Lux,搖床轉(zhuǎn)速為100-120rpm,每7-10天繼代一次;

3)搖瓶轉(zhuǎn)反應器繼代培養(yǎng):將搖瓶中細胞轉(zhuǎn)接到反應器中進行繼代培養(yǎng),每次繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為7-10天,反應器中加入培養(yǎng)液,所述培養(yǎng)液為含有0.4~0.6mg/L 6-BA、0.8~1.2mg/L NAA的MS培養(yǎng)基,所述MS生長培養(yǎng)基的含糖量為20~40g/L,培養(yǎng)條件為23-25℃,光周期為16h/8h,光照強度為1000-3000Lux,通氣保持反應器中培養(yǎng)液的溶氧濃度在2-6mg/L。

2.如權利要求1所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于步驟3)中,每次繼代培養(yǎng)細胞鮮重翻倍量為3-5倍,培養(yǎng)完成時細胞鮮重不低于150g/L。

3.如權利要求1~2任一所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于步驟3)中,反應液中培養(yǎng)液的溶氧濃度保持在2~4mg/L。

4.如權利要求1所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于所述反應器為帶有曝氣裝置的波浪回頭式生物反應器。

5.如權利要求4所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于步驟3)搖瓶轉(zhuǎn)反應器培養(yǎng)包括以下步驟

3.1)搖瓶轉(zhuǎn)20L反應器繼代培養(yǎng),將搖瓶細胞無菌接入20L反應器中,接種量為30~50g/L,保持反應器振頻為5-15rpm,通氣量為0.1-0.3m3/h;

3.2)20L轉(zhuǎn)200L反應器繼代培養(yǎng),在20L反應器繼代培養(yǎng)結(jié)束后,通過無菌連接的方式將20L反應器中完成繼代的細胞種源轉(zhuǎn)接入200L反應器中,保持反應器振頻為10-20rpm,并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應器中,通氣量為0.4-1.0m3/h,混合氣體的初始氧氣比例為零,隨著培養(yǎng)過程梯度增加氧氣比例,每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高5-10個百分點,將溶氧濃度控制在2mg~6mg/L;

3.3)200L轉(zhuǎn)1000L反應器繼代培養(yǎng):在200L的反應器繼代培養(yǎng)結(jié)束后,通過無菌連接的方式將200L反應器中完成繼代的細胞種源轉(zhuǎn)接到1000L反應器中,培養(yǎng)第1-5天的反應器振頻為10-15rpm,培養(yǎng)第6天以上的反應器振頻為15-25rpm;并將空氣和氧氣的混合氣體通入到反應器中,通氣量為1.5-4.0m3/h,混合氣體的初始氧氣比例為零,隨著培養(yǎng)過程梯度增加氧氣比例,每次將氧氣占混合氣體的體積百分比含量提高10-20個百分點,將溶氧濃度控制在2mg~6mg/L。

6.如權利要求5所述的一種大規(guī)模繼代培養(yǎng)天山雪蓮細胞的工藝,其特征在于步驟3)中,反應液中培養(yǎng)液的溶氧濃度保持在2~4mg/L。

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