專利名稱：一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)；具體地說是一種來源于感病煙草品種枯斑三生煙(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)的煙草促分裂原活化蛋白激酶基因。
背景技術(shù)：
促分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶，又稱為ERK(external-signal regulated protein kinase，外部信號調(diào)節(jié)蛋白激酶)，是普遍存在于真核生物(煙草)中的一類保守的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，植物MAP激酶及MAP激酶級聯(lián)途徑在病原反應(yīng)、機械損傷、水分脅迫、激素以及細胞周期等多種信號的傳遞中起重要作用。在擬南芥等植物中也發(fā)現(xiàn)有許多MAP激酶的成員，因此在植物中肯定也存在多種MAP激酶級聯(lián)途徑。這些途徑相互交織構(gòu)成信號傳遞的網(wǎng)絡(luò)，有些信號如干旱、高鹽和低溫信號可通過同一條MAP激酶級聯(lián)途徑進行傳遞。有些激酶如SIPK、WIPK、MMK4、ATMPK3等也可能作為多種信號的傳遞體。這些與多種信號傳遞有關(guān)的激酶可能位于不同信號途徑的交叉點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因，其可揭示殼寡糖誘導植物抗性反應(yīng)及進行寡糖生物農(nóng)藥應(yīng)用的研究。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因，具有序列表中SEQ ID NO 1堿基序列；其編碼序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.對生物農(nóng)藥的應(yīng)用指導作用明顯。1)將該基因的cDNA反向插入植物表達載體中，導如根癌農(nóng)桿菌中并轉(zhuǎn)化煙草，鑒定該基因失活對于植物抗性反應(yīng)及其他生理活動的影響；2)利用該基因獲得基因的啟動子，從而獲得啟動基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，找到該基因作用的網(wǎng)絡(luò)。
2.意義長遠。我們克隆的煙草MAPK基因是煙草經(jīng)過殼寡糖處理后早期在煙草葉片中出現(xiàn)的基因，殼寡糖作為生物農(nóng)藥對于植物的抗性具有重要的作用，但是其誘導植物抗病的分子機理還不清楚。根據(jù)以往的文獻報道，MAPK在參與激素、環(huán)境脅迫以及細胞分化等多種信號傳導中起作用，因此該基因的克隆對于揭示殼寡糖誘導植物抗性反應(yīng)的分子信號通路很有價值，并在寡糖生物農(nóng)藥的應(yīng)用方面具有重要的理論指導意義。
具體實施例方式
蛋白質(zhì)磷酸化與脫磷酸化幾乎涉及所有的生理過程，在細胞對外界信號的持續(xù)反應(yīng)中具有重要作用，功能上具有多樣性，調(diào)節(jié)過程廣泛；煙草MAPK是在殼寡糖處理的條件下特異表達的，與煙草的抗性具有重要的關(guān)系，通過MAP激酶級聯(lián)途徑可以啟動一系列與病原反應(yīng)、機械損傷、水分脅迫、激素以及細胞周期等多種信號傳遞傳遞有關(guān)的基因表達；因此煙草MAPK基因是與煙草抗病反應(yīng)密切相關(guān)的基因。
實施例1一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因，其由序列表中SEQ ID NO.1堿基序列編碼而成，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；同系基因一(1)SEQ ID NO.1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度1848堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓樸結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源枯斑三生煙草(Nicotiana tabacum var.samsun NN)(2)SEQ ID NO.2的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度615氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓樸結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)實施例2煙草促分裂原活化蛋白激酶基因具體制備過程如下1.殼寡糖(50～200mg/l)噴施煙草葉片。
2.取處理8小時后的煙草葉片提取總RNA，對照也同時取樣；利用LIFE TECHNOLOGIES GIBCOBRL公司的Trizol試劑提取RNA的方法加以改進①取50～300mg煙草葉片組織，加1mlTrizol，勻漿器均勻；②室溫靜止5分鐘，使蛋白充分變性；③加0.2ml氯仿，振蕩15秒，靜止2～3分鐘，4℃，11000rpm/min離心15分鐘；④將上清轉(zhuǎn)移至一新的EP管中，加入0.5ml異丙醇，靜止10分鐘，4℃，11000rpm/min離心10分鐘；⑤倒去上清，用1ml 75％乙醇洗RNA，4℃，7500rpm/min離心5分鐘；⑥干燥RNA(不要完全干燥，否則極難溶)，溶于20ul RNase-free水中；⑦甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA的完整性。
3.利用錨定引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用錨定引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件煙草葉片總RNA2ul(0.4ug)，錨定引物2ul(2uM)，混勻后70℃，5min，放到冰上，添加H2O4.8ul，5×buffer 4ul，dNTP(250uM each)2ul，DTT(100mM)2ul，Super ScriptTMII RT0.2ul，混勻后42℃，5min，55～60℃，50Min，70℃，15Min，4℃保存；錨定引物TMR-T7(dT12)AP6序列-5′ACGACTCACTATAGGGCT(12)CC3′4.利用熒光標記的錨定引物和隨機引物進行mRNA差別顯示(DDRT-PCR)反應(yīng)隨機引物M13r-ARP1序列5′*ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG3′，PCR反應(yīng)體系10×buffer 1ul，MgCl2(25mM)1.5ul，dNTP(250uM)2uM，5′TMR-T7(dT12)AP6(2uM)1.75ul，3′M13r-ARP1(5uM)0.7ul，RT-Mix 1ul，TaKaRA ExTaq(5unit/ul)0.1ul，H2O 1.95ul，總反應(yīng)體積10ul；反應(yīng)條件95℃ 2Min；92℃ 15秒，50℃ 30秒，72℃ 2Min，4個循環(huán)；92℃ 15秒，55～60℃ 30秒，72℃ 2Min，30個循環(huán)；72℃ 10Min，4℃保存，用錫箔紙包上，-20℃?zhèn)溆茫?.聚丙烯酰胺凝膠電泳取5ul PCR產(chǎn)物上樣用Beckmen的genomyx LRTMDNA Sequencer電泳裝置(GX100)進行電泳，電壓3000V，恒功率100W，跑膠5小時；電泳結(jié)果用genomyx SCTMFluorescent Imaging Scanner(FL 100-4)進行分析6.回收差別條帶，進行PCR擴增50mg/l殼寡糖處理8h的煙草葉片與對照相比，共發(fā)現(xiàn)差別條帶22條(在聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中進行比較)，其中16條擴增后回收并連接到T-vector上測序。測序結(jié)果利用Blast軟件在Genbank中進行序列比較發(fā)現(xiàn)1號片段與擬南芥的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)具有63％核苷酸同源性；因此決定要得到1號片段的cDNA全長。從凝膠中回收1號差別條帶，加入50ul ddH2O中，利用二次擴增引物進行PCR擴增，引物序列為M5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3′T5′GTAATACGACTCACTATAGGGC 3′反應(yīng)體系為10×Buffer 4ul，MgCl2(25mM)2.4ul，dNTP(250uM)3.2ul，引物M(2uM)4ul，引物T(2uM)4ul，TaKaRA ExTaq(5unit/ul)0.4ul，ddH2O 18.9ul，差別條帶樣品6ul，總反應(yīng)體積40ul；反應(yīng)條件為92℃ 2Min；92℃ 15秒，50℃ 30秒，72℃ 2Min，4個循環(huán)；92℃ 15秒，55～60℃ 30秒，72℃ 2Min，30個循環(huán)；72℃ 10Min，4℃保存；7.用TaKaRa的凝膠回收kit回收PCR產(chǎn)物(1)取10ul PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳；(2)在紫外燈下切出含有目的PCR片段的瓊脂糖凝膠，切碎膠塊，稱取重量，大約100mg；(3)向膠塊中加入300ul DR-I Buffer，均勻混合后75℃加熱融化膠塊6-10分鐘，期間間斷振蕩混合；(4)向上述膠塊融化液中加入150ul的DR-II Buffer，均勻混合；(5)將試劑盒中的Spin Column按置于Collection Tube上；(6)將混合液轉(zhuǎn)移到Spin Column中，3,6000rpm離心1分鐘，棄濾液；(7)將500ul的Rinse A加入Spin Column中，3,6000rpm離心30秒，棄濾液；(8)將700ul的Rinse B加入Spin Column中，3,6000rpm離心30秒，棄濾液；(9)重復操作步驟8，12,000rpm離心1分鐘；(10)將Spin Column按置于1.5ml的新離心管中，在Spin Column膜的中央處加入25ul的ddH2O；(11)12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA；(12)取3ul電泳檢測濃度。
8.利用TaKaRa公司的T-vector kit將PCR產(chǎn)物連接到載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
連接條件2×連接Buffer 5ul，回收的PCR產(chǎn)物4ul，T載體1ul，16℃連接過夜。
大腸桿菌JM109的轉(zhuǎn)化A.氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞(1)-20℃冷凍的大腸桿菌JM109于冰上解凍，取200μl接到3ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分，振蕩過夜；(2)取500μl菌液接到50ml LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)2～3小時，直到OD600≈0.5；(3)在無菌條件下，將菌液轉(zhuǎn)移到4℃預冷的50ml離心管中，冰浴30分鐘，于4℃，6000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，以回收細胞；(4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；用10ml 4℃預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀(無菌操作)，冰浴20分鐘，離心，倒出培養(yǎng)液(同上)；
(5)用2ml 4℃預冷的0.1M CaCl2重新懸浮沉淀，用冷卻的無菌吸頭將感受態(tài)細胞懸液按200μl/管分裝到無菌的Eppendorf管中，混勻，4℃保存24～48小時；B.轉(zhuǎn)化(1)取連接產(chǎn)物5μl，加入預冷的200μl大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，立即置冰上30分鐘；(2)將離心管置42℃恒溫水浴中熱激90秒鐘，不要搖動Eppendorf管；(3)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻3～5分鐘；(4)加入800μl無附加抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，混勻，37℃，100轉(zhuǎn)/分45分鐘；(5)將4μl IPTG(200mg/ml)、40ul X-gal(20mg/ml)和200μl轉(zhuǎn)化菌混勻，涂布于含Amp 50mg/lL的LB平板。37℃倒置培養(yǎng)16小時；9.挑取轉(zhuǎn)化克隆，提取質(zhì)粒，利用EcoRI和HindIII進行酶切，鑒定陽性克隆A.隨機挑取6個陽性菌落(白色)，堿法小量制備質(zhì)粒DNA。
(1)挑取單菌落，接種到Amp 50mg/lL的3ml LB培養(yǎng)液中，37℃，200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)過夜；(2)轉(zhuǎn)移約1.2ml過夜培養(yǎng)液到1.5ml離心管中，在13000rpm離心1分鐘，收集菌體，棄上清液后，再離心5秒鐘，吸去剩余上清；(3)每個離心管中加入預冷的溶液I 100μl(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA)在混和器上振蕩使菌體充分懸浮、分散、混勻；(4)每管各加入200μl新配制的溶液II(0.2N NaOH，1％SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配)，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻，處理5分鐘，使細胞膜完全裂解；(5)每管各加150μl預冷的溶液III(3mol/L鉀鹽，5mol/L醋酸(pH4.8))，倒轉(zhuǎn)幾次混勻，冰浴10分鐘；(6)在13000rpm離心10分鐘，沉淀染色體DNA，及不溶的變性蛋白，取上清；(7)上清液用等體積的Tris-HCl飽和苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次；(8)上清加等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘；(9)在13000rpm離心10分鐘，得到質(zhì)粒DNA沉淀；(10)用70％乙醇洗一次，13000rpm離心2分鐘，取沉淀，干燥；(11)沉淀溶于20μlTE(pH8.0)溶液中，加入1μlRNase(DNase-free)(10mg/ml)，37℃，30分鐘。-20℃放置待用。
B.酶切鑒定重組子分別將6個質(zhì)粒用進行酶切鑒定；酶切反應(yīng)體系(20ul)10×Buffer M 2ul，EcoRI(20u/ul)0.5ul，HindIII(12u/ul)0.5ul，質(zhì)粒2ul，ddH2O 15ul；酶切反應(yīng)條件37℃，2-3小時。
鑒定結(jié)果1％瓊脂糖電泳檢測，在6個克隆中，有2個有插入，為所需要的重組子。
10.將含有差異片段的重組質(zhì)粒進行序列分析，在聯(lián)合基因科技(集團)有限公司用3700，Bigdye-Terminator測序儀進行序列分析；測序結(jié)果如下CGACTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGAGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAAATGAAATGGTGAAGGAATTAGAAATTACAGACTGGAAACCATATGAAACAGCTAATATGATTGACGGAGAGATATCTGGTTTGGTACCTCAGTGGAAGAAATGGAATCAGTTTGAATCCGCCGATTACCATGTGCTAAGCTATAAAGATGACGATAATGATCACCATAACCCTTTCCGAGGTTTCTCATCTTGCTCATCTTCCCAAGTGTCATTGTCAGGTGATATGTTTGACGACACCAGCTCCCAGAGCTCATCACACTCAGCAAATTATTCCAACTTCAATTACTTCTCTGATGATGAGAATGATCCTGTGACGACCTCTACAAAACAAAGTCAGCCAGCTACTGCAATTAACCACCATACTTCCCGGTTTTGTCCCGGGGAAAACTCAAGCACTGGGCAGTCTTTAGCAAGAATGTGCTACAAGCAGTGCAAAGATATGCTAGAATTAAAAAGAACTTCTTCCACTTCTAAAGAGAAGGGCAAAGTTGATACGCGTAGACTAACAAGGAACAAGTCCTTGGTGGATATGCGCAGCCAGTTGCTGCACAAGACATTGGTGGAGGAAGTGCACAAGAGACGATTGTTCAAGACGGTTGGCGCTGTGGAAAATATTGGGTTTCAACAACCTTATGAGGATTCAAGAAGGAGTCCTCAATCAATGAATTCTACTTATTCCATGAGATTGTGGAATGATGGGAAGGGACAAGGTCACAAACCAAGAAGACATTGATTTCTTTTCCTGAATATATATCTTAAATGTACGAGGATATATGCATATGCTAGTTTTAAGCAGGTCCGAGTTTTGAATTAGGCAGGTGTAAATGGCAATAAAAGTGTTTGTTCAAATTTTGTACATTTGTACCTTATAGCAATGTAAGAATAAACATCCCTTGCGCTTACATGCTCTCATCAACAGAATTCCAAAGGTACCTAGCGGAAAAAAAAAAAA11.測序結(jié)果利用blast軟件在Genbank中進行同源比較mRNA差別顯示試驗獲得的1號片段經(jīng)測序后，利用Blast軟件在Genbank中進行序列比較，發(fā)現(xiàn)與擬南芥的促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)具有63％核苷酸同源性。
12.利用CLONTECH公司的5′RACE試劑盒獲得煙草MAPK的cDNA全長。
A.5′RACE第一鏈cDNA合成(5′RACE-Ready cDNA)(1)0.5ml反應(yīng)管中添加下列成分1-3ul總RNA樣品(1ug，用50mg/l殼寡糖噴施煙草葉片8小時后提取)1ul 5′-CDS primer1ul SMART II oligo(2)添加無菌水到每管終體積5ul，混勻反應(yīng)成分(3)70℃，2min(4)放置冰上2min，Spin離心管(5)添加下列成分到反應(yīng)管中2ul 5×First-Strand buffer1ul DTT(20mM)1ul dNTP Mix(10mM)1ul PowerScript Reverse Transcriptase
10ul 總反應(yīng)體積(6)混勻反應(yīng)成分，在空氣浴保溫42℃，1.5h(7)用100ul Tricine-EDTA buffer稀釋反應(yīng)產(chǎn)物(8)72℃加熱反應(yīng)管7min，-20℃儲存B.根據(jù)3′端的核苷酸序列，設(shè)計基因特異引物，進行PCR反應(yīng)GspM-5′ CGGGACAAAACCGGGAAGTATGG 3′反應(yīng)體系34.5ul H2O5ul 10×Advantage 2 PCR Buffer1ul dNTP Mix(10mM)1ul 50×Advantage 2 Polymerase Mix2.5ul 5′RACE-Ready cDNA5ul UPM(10×)1ul GSPM(10uM)50ulfinal volume反應(yīng)條件5cycles94℃ 5sec，72℃ 3min5cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec， 72℃ 3min25cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min72℃ 5min，4℃保存PCR反應(yīng)結(jié)果利用引物UPM和GSPM擴增出一條大約1400C.嵌套PCR反應(yīng)結(jié)果設(shè)計嵌套引物nGspM，進行PCR反應(yīng)nGspM序列5′GCGACCTCCGTTGGGGTGTCAGT 3′反應(yīng)體系34.5ul H2O5ul10×Advantage 2 PCR Buffer1uldNTP Mix(10mM)1ul50×Advantage 2 Polymerase Mix2.5ul GspM引物PCR擴增產(chǎn)物5ulUPM(10×)1ulnGSP M(10uM)50ul final volume反應(yīng)條件5cycles94℃ 5sec，72℃ 3min5cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min25cycles94℃ 5sec，60～70℃ 10sec，72℃ 3min72℃ 5min，4℃保存PCR反應(yīng)結(jié)果利用引物UPM和nGSPM擴增出一條大約1100bp的條帶，略小于引物UPM和GSPM擴增出的條帶。
D.電泳并回收UPM和nGSPM擴增條帶E.將回收的擴增條帶連接到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選并挑取陽性克隆。
E.用EcoRI和HindIII進行酶切鑒定，挑選出有插入的克隆。
G.測序分析含有插入片段的質(zhì)粒測序結(jié)果AACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGAACTCTTTTTTAAGTAGATCATAAAAAAGATGAGTAATTAACTTCTCTTTTCAAGTTTCAACTTATACCAACTTTCTTGATTAACTGAAACTCTTGTAAGAATCAATTCAATATGTACAAGGGACGATTTTCAGAACACTGTAAAGAATCAGAGGATGATCTTAGATATGTTGAAATTGATCCTACTGCTCGTTATGGACGTTTCGAGGAAGTTTTGGGAAAAGGGGCAATGAAAACAGTGTATAGAGCAATTGATGAGTTGCTAGGTATGGAAGTGGCATGGAACCAAATTAAACTAAATGATTTGCTTCATTCACCAGAGGATATGGAGAGGCTTTACTCTGAAGTTCATCTGCTTAGCACTCTCAATCATCATTCTATCATGAGATTCTATACTTCTTGGATTGATGTTGAACACAGGACCTTTAATTTCATTACCGAGATGTTCACCTCCGGTACTCTCCGAGGATACAGAAAGAAGTATCAGCGAGTAGACATTCGAGCTATAAAGAATTGGGCGCGCCAAATACTGGAAGGTCTTGTTTATTTACACGAACATGATCCGCCAGTTATCCATCGAGACCTGAAGTGTGACAACATATTTGTTAACGGTCATCTTGGACAAGTGAAAATTGGGGACTTGGGCTTGGCAGCAATTCTTCGTGGATCACAGAGAGCGCACAGTGTTATAGGGACACCTGAGTTCATGGCACCGGAACTATACGAGGAGAACTACAATGAGCTAGTCGATGTATATTCATTTGGCATGTGCATGTTAGAGATGCTTACGGGTGAATATCCATACAGTGAATGTGTTAACCCTGCACAAATATACAAAAAAGTGACCTCTGGTAAGAGGCCTCGGGCATTTTATAAAGTTCAAGATTTGGATGCACAAAGATTTATTAGGAAATGCTTGGAGCCAGCATCAAAAAGATTATCAGCTAAAGAACTAATGGTTGATCCCTTCCTTGTATTTAATAATGTTGATGGTAAGTCGGTAACAATGATGCAACTTCAAAAGCCTTTCTTGAATGATAAAATTGCTATCGAGGACCTCCACTTGAACGAGGACGCTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGCGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAH.根據(jù)測序結(jié)果和1號片段的測序結(jié)果，設(shè)計一對用于擴增MAPKcDNA全長的引物。
引物序列為MAPK3-5’＞GG CTGCAG CGGGGAACTCTTTTTTAAGTAG＜3’MAPK2-5’＞GGGGATCCGCATGTAAGCGCAAGGGATG＜3’PCR反應(yīng)體系36.5ul H2O5ul 10×Buffer(Mg2+plus)1ul dNTP Mix(10mM)0.5ul TaKaRa LA Taq(5u/ul)1ul MAPK2(10uM)1ul MAPK3(10uM)5ul 5′RACE-Ready cDNA50ulfinal volumePCR反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 1Min，50～60℃ 1.5Min，72℃ 1.5min，30cycles；72℃10minPCR反應(yīng)結(jié)果擴增出一條大約2100bp的條帶；I.電泳并回收MAPK2和MAPK3的擴增條帶
J.將回收的擴增條帶連接到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選并挑取陽性克隆。
K.用Bam HI和Pst I進行酶切鑒定，挑選出有插入的克隆。
L.測序分析含有插入片段的質(zhì)粒13.煙草MAPK基因的核苷酸序列分析結(jié)果核苷酸序列(114～1961部分為cDNA編碼序列)GAACTCTTTTTTAAGTAGATCATAAAAAAGATGAGTAATTAACTTCTCTTTTCAAGTTTCAACTTATACCAACTTTCTTGATTAACTGAAACTCTTGTAAGAATCAATTCAATATGTACAAGGGACGATTTTCAGAACACTGTAAAGAATCAGAGGATGATCTTAGATATGTTGAAATTGATCCTACTGCTCGTTATGGACGTTTCGAGGAAGTTTTGGGAAAAGGGGCAATGAAAACAGTGTATAGAGCAATTGATGAGTTGCTAGGTATGGAAGTGGCATGGAACCAAATTAAACTAAATGATTTGCTTCATTCACCAGAGGATATGGAGAGGCTTTACTCTGAAGTTCATCTGCTTAGCACTCTCAATCATCATTCTATCATGAGATTCTATACTTCTTGGATTGATGTTGAACACAGGACCTTTAATTTCATTACCGAGATGTTCACCTCCGGTACTCTCCGAGGATACAGAAAGAAGTATCAGCGAGTAGACATTCGAGCTATAAAGAATTGGGCGCGCCAAATACTGGAAGGTCTTGTTTATTTACACGAACATGATCCGCCAGTTATCCATCGAGACCTGAAGTGTGACAACATATTTGTTAACGGTCATCTTGGACAAGTGAAAATTGGGGACTTGGGCTTGGCAGCAATTCTTCGTGGATCACAGAGAGCGCACAGTGTTATAGGGACACCTGAGTTCATGGCACCGGAACTATACGAGGAGAACTACAATGAGCTAGTCGATGTATATTCATTTGGCATGTGCATGTTAGAGATGCTTACGGGTGAATATCCATACAGTGAATGTGTTAACCCTGCACAAATATACAAAAAAGTGACCTCTGGTAAGAGGCCTCGGGCATTTTATAAAGTTCAAGATTTGGATGCACAAAGATTTATTAGGAAATGCTTGGAGCCAGCATCAAAAAGATTATCAGCTAAAGAACTAATGGTTGATCCCTTCCTTGTATTTAATAATGTTGATGGTAAGTCGGTAACAATGATGCAACTTCAAAAGCCTTTCTTGAATGATAAAATTGCTATCGAGGACCTCCACTTGAACGAGGACGCTCCAAGGACTAATATGACCATCACCGGGAAATTGAATCCTGAAGATGATACCATTTTAATTAAAGTGCAGATTGCGGATAAAAAAGGTGATGTTAGGAATGTGTATTTCCCGTTCGACATTGTAACTGACACCCCAACGGAGGTCGCAAATGAAATGGTGAAGGAATTAGAAATTACAGACTGGAAACCATATGAAACAGCTAATATGATTGACGGAGAGATATCTGGTTTGGTACCTCAGTGGAAGAAATGGAATCAGTTTGAATCCGCCGATTACCATGTGCTAAGCTATAAAGATGACGATAATGATCACCATAACCCTTTCCGAGGTTTCTCATCTTGCTCATCTTCCCAAGTGTCATTGTCAGGTGATATGTTTGACGACACCAGCTCCCAGAGCTCATCACACTCAGCAAATTATTCCAACTTCAATTACTTCTCTGATGATGAGAATGATCCTGTGACGACCTCTACAAAACAAAGTCAGCCAGCTACTGCAATTAACCACCATACTTCCCGGTTTTGTCCCGGGGAAAACTCAAGCACTGGGCAGTCTTTAGCAAGAATGTGCTACAAGCAGTGCAAAGATATGCTAGAATTAAAAAGAACTTCTTCCACTTCTAAAGAGAAGGGCAAAGTTGATACGCGTAGACTAACAAGGAACAAGTCCTTGGTGGATATGCGCAGCCAGTTGCTGCACAAGACATTGGTGGAGGAAGTGCACAAGAGACGATTGTTCAAGACGGTTGGCGCTGTGGAAAATATTGGGTTTCAACAACCTTATGAGGATTCAAGAAGGAGTCCTCAATCAATGAATTCTACTTATTCCATGAGATTGTGGAATGATGGGAAGGGACAAGGTCACAAACCAAGAAGACATTGATTTCTTTTCCTGAATATATATCTTAAATGTACGAGGATATATGCATATGCTAGTTTTAAGCAGGTCCGAGTTTTGAATTAGGCAGGTGTAAATGGCAATAAAAGTGTTTGTTCAAATTTTGTACATTTGTACCTTATAGCAATGTAAGAATAAACATCCCTTGCGCTTACATGCTCTCATCAACAGAATTCCAAAGGTACCTAGCGGAAAAAAAAAAAA蛋白質(zhì)氨基酸序列MYKGRFSEHCKESEDDLRYVEIDPTARYGRFEEVLGKGAMKTVYRAIDELLGMEVAWNQIKLNDLLHSPEDMERLYSEVHLLSTLNHHSIMRFYTSWIDVEHRTFNFITEMFTSGTLRGYRKKYQRVDIRAIKNWARQILEGLVYLHEHDPPVIHRDLKCDNIFVNGHLGQVKIGDLGLAAILRGSQRAHSVIGTPEFMAPELYEENYNELVDVYSFGMCMLEMLTGEYPYSECVNPAQIYKKVTSGKRPRAFYKVQDLDAQRFIRKCLEPASKRLSAKELMVDPFLVFNNVDGKSVTMMQLQKPFLNDKIAIEDLHLNEDAPRTNMTITGKLNPEDDTILIKVQIADKKGDVRNVYFPFDIVTDTPTEVANEMVKELEITDWKPYETANMIDGEISGLVPQWKKWNQFESADYHVLSYKDDDNDHHNPFRGFSSCSSSQVSLSGDMFDD
TSSQSSSHSANYSNFNYFSDDENDPVTTSTKQSQPATAINHHTSRFCPGENSSTGQSLARMCYKQCKDMLELKRTSSTSKEKGKVDTRRLTRNKSLVDMRSQLLHKTLVEEVHKRRLFKTVGAVENIGFQQPYEDSRRSPQSMNSTYSMRLWNDGKGQGHKPRRH*(1)煙草枯斑三生煙(Nicotiana tabacum var.samsun NN)MAPK基因的cDNA全長為1848bp，編碼615個氨基酸和一個TGA終止密碼子。
(2)同源分析表明，煙草MAPK基因與擬南芥的MAPK基因的氨基酸同源性為80％。
SEQUENCE LISTING<110> 中國科學院大連化學物理研究所<120> 一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因<130>
<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2180<212> DNA<213> 枯斑三生煙草<220>
<221> CDS<222> (114)..(1961)<223>
<400> 1gaactctttt ttaagtagat cataaaaaag atgagtaatt aacttctctt ttcaagtttc60aacttatacc aactttcttg attaactgaa actcttgtaa gaatcaattc aat atg 116Met1tac aag gga cga ttt tca gaa cac tgt aaa gaa tca gag gat gat ctt 164Tyr Lys Gly Arg Phe Ser Glu His Cys Lys Glu Ser Glu Asp Asp Leu5 10 15aga tat gtt gaa att gat cct act gct cgt tat gga cgt ttc gag gaa 212Arg Tyr Val Glu Ile Asp Pro Thr Ala Arg Tyr Gly Arg Phe Glu Glu20 25 30gtt ttg gga aaa ggg gca atg aaa aca gtg tat aga gca att gat gag 260Val Leu Gly Lys Gly Ala Met Lys Thr Val Tyr Arg Ala Ile Asp Glu35 40 45ttg cta ggt atg gaa gtg gca tgg aac caa att aaa cta aat gat ttg 308Leu Leu Gly Met Glu Val Ala Trp Asn Gln Ile Lys Leu Asn Asp Leu50 55 60 65ctt cat tca cca gag gat atg gag agg ctt tac tct gaa gtt cat ctg 356Leu His Ser Pro Glu Asp Met Glu Arg Leu Tyr Ser Glu Val His Leu70 75 80
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<211> 615<212> PRT<213> 枯斑三生煙草<400> 2Met Tyr Lys Gly Arg Phe Ser Glu His Cys Lys Glu Ser Glu Asp Asp1 5 10 15Leu Arg Tyr Val Glu Ile Asp Pro Thr Ala Arg Tyr Gly Arg Phe Glu20 25 30Glu Val Leu Gly Lys Gly Ala Met Lys Thr Val Tyr Arg Ala Ile Asp35 40 45Glu Leu Leu Gly Met Glu Val Ala Trp Asn Gln Ile Lys Leu Asn Asp50 55 60Leu Leu His Ser Pro Glu Asp Met Glu Arg Leu Tyr Ser Glu Val His65 70 75 80Leu Leu Ser Thr Leu Asn His His Ser Ile Met Arg Phe Tyr Thr Ser85 90 95Trp Ile Asp Val Glu His Arg Thr Phe Asn Phe Ile Thr Glu Met Phe100 105 110Thr Ser Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Arg Lys Lys Tyr Gln Arg Val Asp115 120 125Ile Arg Ala Ile Lys Asn Trp Ala Arg Gln Ile Leu Glu Gly Leu Val130 135 140Tyr Leu His Glu His Asp Pro Pro Val Ile His Arg Asp Leu Lys Cys145 150 155 160Asp Asn Ile Phe Val Asn Gly His Leu Gly Gln Val Lys Ile Gly Asp165 170 175
Leu Gly Leu Ala Ala Ile Leu Arg Gly Ser Gln Arg Ala His Ser Val180 185 190Ile Gly Thr Pro Glu Phe Met Ala Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Asn Tyr195 200 205Asn Glu Leu Val Asp Val Tyr Ser Phe Gly Met Cys Met Leu Glu Met210 215220Leu Thr Gly Glu Tyr Pro Tyr Ser Glu Cys Val Asn Pro Ala Gln Ile225 230 235 240Tyr Lys Lys Val Thr Ser Gly Lys Arg Pro Arg Ala Phe Tyr Lys Val245 250 255Gln Asp Leu Asp Ala Gln Arg Phe Ile Arg Lys Cys Leu Glu Pro Ala260 265 270Ser Lys Arg Leu Ser Ala Lys Glu Leu Met Val Asp Pro Phe Leu Val275 280 285Phe Asn Asn Val Asp Gly Lys Ser Val Thr Met Met Gln Leu Gln Lys290 295 300Pro Phe Leu Asn Asp Lys Ile Ala Ile Glu Asp Leu His Leu Asn Glu305 310 315 320Asp Ala Pro Arg Thr Asn Met Thr Ile Thr Gly Lys Leu Asn Pro Glu325 330 335Asp Asp Thr Ile Leu Ile Lys Val Gln Ile Ala Asp Lys Lys Gly Asp340 345 350Val Arg Asn Val Tyr Phe Pro Phe Asp Ile Val Thr Asp Thr Pro Thr355 360 365
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565 570 575Ile Gly Phe Gln Gln Pro Tyr Glu Asp Ser Arg Arg Ser Pro Gln Ser580 585 590Met Asn Ser Thr Tyr Ser Met Arg Leu Trp Asn Asp Gly Lys Gly Gln595 600 605Gly His Lys Pro Arg Arg His610 61權(quán)利要求
1.一種煙草促分裂原活化蛋白激酶基因，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO 1堿基序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的煙草促分裂原活化蛋白激酶基因，其特征在于其編碼序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)；具體地說是一種來源于感病煙草品種枯斑三生煙(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)的煙草促分裂原活化蛋白激酶，其由序列表中SEQ ID NO 1堿基序列編碼而成，具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)點如下對生物農(nóng)藥的應(yīng)用指導作用明顯；該基因的克隆對于揭示殼寡糖誘導植物抗性反應(yīng)的分子信號通路很有價值，并在寡糖生物農(nóng)藥的應(yīng)用方面具有重要的理論指導意義。
文檔編號C12N9/12GK1603414SQ0313503
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者馮斌, 杜昱光, 白雪芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所