本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，尤其是涉及一種重組人尿激酶原的病毒去除方法。
背景技術：
尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個氨基酸組成，其本身無活性，經纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發(fā)揮其溶血栓的效能。是一種特異性的溶血栓的藥物。
上海天士力生產的重組人尿激酶原為通過基因工程方法構建的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)表達獲得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治療，已于2011年作為國家一類新藥成功上市。
國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心制定的《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》(簡稱原則)規(guī)定，凡是用細胞表達的人用生物制品均要求對生產用細胞株、細胞培養(yǎng)液、產品原液和產品進行病毒檢測，并要求純化工藝中有滅活或除去病毒的步驟，以確保產品不被病毒污染及用藥安全。
近年來，國內外多家實驗室相繼證實，離子交換層析，特別是陰離子交換層析(Anion-exchange chromatography，AEX)在純化蛋白質的同時，具有穩(wěn)定可靠的去病毒作用。陰離子交換層析對包括DNA、RNA病毒，有脂包膜和無脂包膜病毒等指示性病毒的去除效率均在99.99％(即4log10)以上。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種有效去除重組人尿激酶原病毒的方法。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：本發(fā)明以重組人尿激酶原發(fā)酵液為起始原料，對其進行純化并取病毒處理，為此本發(fā)明提供一種重組人尿激酶原的病毒去除方法，所述方法包括用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟。
本發(fā)明所述方法，還包括將重組人尿激酶原發(fā)酵液通過層析后獲得的初步純化液的步驟；
本發(fā)明所述進行離子交換層析，可以使病毒例如DNA、RNA病毒、有脂包膜和無脂包膜病毒牢固吸附在離子交換介質上，而重組人尿激酶原直接被洗脫下來，從而達到去除病毒的目的。
本發(fā)明所述的離子交換層析包括陰離子交換層析或陽離子交換層析或其結合。
本發(fā)明所述將重組人尿激酶原發(fā)酵液通過層析后獲得的初步純化液的步驟；是將重組人尿激酶原發(fā)酵液經過層析方法得到初步純化液≥95.0％；
本發(fā)明所述用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟，共有三種技術方案，目的在于去除病毒：
第一種技術方案，方法如下：初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節(jié)pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟，方法如下：初步純化液與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：1.5～3(優(yōu)選1:2)體積比混合，調節(jié)pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化后的尿激酶原。
本發(fā)明用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟中，所述的陰離子填料包括但不限于Streamline DEAE、DEAE Sephacel DE-52，優(yōu)選Streamline DEAE陰離子填料。所述的Tris-HCl緩沖液為含鹽或不含鹽的Tris-HCl緩沖液，優(yōu)選pH8.0±0.5含0～0.20mol/L NaCl，進一步優(yōu)選初步純化液與不含鹽Tris-HCl緩沖液混合。
為了更好的除去病毒，優(yōu)選先用Tris-HCl含鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，平衡時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度高于洗脫時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度。優(yōu)選平衡時Tris-HCl緩沖液液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl，洗脫時Tris-HCl洗脫緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)。
更進一步地，以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析 柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl)進行平衡。初步純化液與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被0.015～0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化重組人尿激酶原。
本發(fā)明通過陰離子填料吸附帶負電荷的DNA、宿主細胞殘留蛋白及病毒等在Tris-HCl緩沖液基礎上增加NaCl，增強雜質的負電荷強度，從而增加陰離子填料對DNA等雜質的吸附。
本方第二種技術方案，方法如下：初步純化液與磷酸鹽緩沖液混合，調節(jié)pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，重組人尿激酶原被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。
優(yōu)選的，初步純化液調節(jié)pH值至6.0±0.5后陽離子交換層析柱上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原被0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的尿激酶原。
所述的陽離子交換層析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，優(yōu)選SP Sepharose F.F.陽離子填料，本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.05～0.5mol/L NaCl。
為了更好的洗脫，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優(yōu)選pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl進行平衡，用(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫。
更進一步地，
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡，初步純化液調節(jié)pH值至6.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陽離子交換 層析柱上，尿激酶原用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的尿激酶原。
本發(fā)明的第三種技術方案，方法如下：初步純化液經過陰離子交換層析柱吸附，初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節(jié)pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的尿激酶原1；尿激酶原1再經過陽離子交換層析柱吸附，尿激酶原1與磷酸鹽緩沖液混合，調節(jié)pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。
其中，所述的初步純化液與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：1.5～3(優(yōu)選1:2)體積比混合，調節(jié)pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化后的尿激酶原1。
所述的陰離子交換柱填料包括但不限于Streamline DEAE、DEAE Sephacel DE-52，優(yōu)選Streamline DEAE陰離子填料。所述的Tris-HCl緩沖液為含鹽或不含鹽的Tris-HCl緩沖液，優(yōu)選pH8.0±0.5含0～0.20mol/L NaCl，進一步優(yōu)選初步純化液與不含鹽Tris-HCl緩沖液混合。
為了更好的除去病毒，優(yōu)選先用Tris-HCl含鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，平衡時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度高于洗脫時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度。優(yōu)選平衡時Tris-HCl緩沖液液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl，洗脫時Tris-HCl洗脫緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)。
更進一步地，以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl)進行平衡。初步純化液與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原1被0.015～0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透 液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1；純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.0±0.5后陽離子交換層析柱上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1被0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的重組人尿激酶原原液。
所述的陽離子交換層析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，優(yōu)選SP Sepharose F.F.陽離子填料，本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.05～0.5mol/L NaCl。
為了更好的洗脫，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡，用(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫。
更進一步地，
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡，純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫直接穿透，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的重組人尿激酶原。
本發(fā)明三種技術方案中所述的重組人尿激酶原發(fā)酵液通過CN 1062016、CN1178244(說明書第5頁7-9的方法)、公開的方法制備得到。
本發(fā)明三種技術方案中所述的初步純化液是經過一定純化步驟，使得重組人尿激酶原蛋白純度達到一定標準≥95％的尿激酶原純化中間體?？赏ㄟ^現(xiàn)有技術例如，通過免疫親和層析法，或是陽離子交換層析和免疫親和層析法等方法純化方法制備完成。
為了達到更好的技術效果，優(yōu)選本發(fā)明的初步純化液是通過下述方法完成的。
步驟(A)蛋白捕獲：尿激酶原發(fā)酵液選用陽離子交換層析法得到純化中間體1；
步驟(B)凝膠層析：中間體1通過凝膠層析法獲得純化中間體2；
步驟(C)陽離子交換層析：中間體2通過陽離子交換層析法獲得純化中間體3；
步驟(D)親和層析：中間體3通過親和層析法獲得初步純化液。
進一步地，步驟(A)中所述發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至5.5～6.5后陽離子交換層柱法上樣(優(yōu)選pH值至6.0)，采用0.005～0.015mol/L(優(yōu)選0.008～0.01mol/L)磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。
所述的陽離子交換層析柱填料包括但不限于Streamline SP、SP Sepharose F.F.，優(yōu)選Streamline SP為介質的陽離子填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl的磷酸鹽溶液，優(yōu)選pH6.0±0.5含0.05～0.7mol/L NaCl。
為達到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl的濃度低于洗脫時磷酸鹽緩沖液含NaCl的濃度，也就是說低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。目的是通過緩沖液平衡使目標蛋白帶正電荷，吸附在填料上，再通過緩沖液使目標蛋白帶負電荷洗脫下來。緩沖液的pH值可以改變目標蛋白的電荷性質，鹽離子(NaCl)濃度調節(jié)電荷強度。平衡層析柱時的磷酸鹽緩沖液中加入低濃度的NaCl可增加目標蛋白的電荷強度，從而增強陽離子填料對目標蛋白的捕獲能力。接下來通過高鹽(NaCl的濃度高于平衡時NaCl濃度)緩沖液洗脫使目標蛋白的離子強度降低，降低其與目標蛋白的結合能力。如果洗脫時的緩沖液鹽離子濃度過高(＞0.7mol/L NaCl)會將吸附在填料上的其它雜蛋白一并洗脫下來進入純化中間體1。因此本發(fā)明的洗脫時磷酸緩沖液的濃度pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl。
具體為，
步驟(A)以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至5.5～6.5后上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。
本發(fā)明的步驟(B)中間體1上凝膠層析柱后，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰即為純化中間體2。
所述的凝膠層析柱的填料包括但不限于Sephacryl S-200HR、Sephadex G-50，優(yōu)選Sephacryl S-200HR凝膠分子篩。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl的磷酸鹽溶液，優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)。
為達到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，平衡時磷酸鹽緩沖液濃度與洗脫時磷酸鹽緩沖液相同。
具體為，
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽平衡緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)進行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化中間體2。
本發(fā)明的步驟(C)中間體2調節(jié)pH值至6.0±0.5后陽離子交換層析柱上樣，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化中間體3。
所述的陽離子交換層析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，優(yōu)選SP Sepharose F.F.陽離子填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.05～0.35mol/L NaCl。
為達到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫。所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡。所述的磷酸鹽緩沖液洗脫時，采用從低鹽到高鹽兩步梯度洗脫，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.20～0.35mol/L NaCl。第一次用低鹽的緩沖液洗脫，洗脫雜質蛋白，第二次用高鹽的緩沖液洗脫，收集目標蛋白，同時可以將純化中間體3進行濃縮。這樣獲得的純化3中間體的雜蛋白更少，目標蛋白量不變，但體積更小了，便于生產貯存。
具體為：
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005～ 0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進行平衡，將純化中間體2調節(jié)pH值至6.0±0.5后上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)洗脫雜質，0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化中間體3。
純化中間體3可于-20℃以下冷凍儲存。待需要下一步操作時可提前取出復融混合，并進行第4步操作。
該步驟(C)能夠更好的分離雜質蛋白及目標蛋白，濃縮得到高純度的中間體3.
本發(fā)明步驟(D)純化中間體3pH值至7.0±0.5后親和層析柱上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。
所述的親和層析柱填料包括但不限于Benzamidine Sepharose 4FF H-sub、Arginine Sepharose 4B，優(yōu)選BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl。
優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，平衡時磷酸鹽緩沖液濃度與洗脫時磷酸鹽緩沖液相同。
步驟(D)主要目的是出去UK，具體為，
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.0±0.5后上樣。采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為初步純化液。
對本發(fā)明的初步純化液用本發(fā)明的方法進行去除病毒，即可得到本發(fā)明的產物。本發(fā)明的有益效果
通過下述試驗例闡述本發(fā)明的三個技術方案有益效果
1.選擇三種指示病毒進行病毒去除效果的驗證。指示病毒特征如表1：
2病毒滴度檢測數(shù)據(jù)
2.1陰離子交換層析(實施例5)
表2 VSV陰離子交換層析的病毒滴度
表3 EMCV陰離子交換層析的病毒滴度
表4 HSV-1陰離子交換層析的病毒滴度
陰離子交換層析對3種病毒去除效果明顯。
2.2陽離子交換層析(實施例9)
表5 VSV陽離子交換層析的病毒滴度
表6 EMCV陽離子交換層析的病毒滴度
表7 HSV-1陽離子交換層析的病毒滴度
從表2-7可見，陽離子交換層析對3種病毒去除效果明顯。
3、陰陽離子交換層析對3種病毒的累計去除效果(實施例13)
表8陰陽離子交換層析對3種病毒的累計去除效果
通過實驗證明，經過陰、陽離子交換層析兩個工藝處理后，3種指示病毒在目標產品中的下降幅度均大于4Logs，病毒下降幅度累計均大于7logs。注射用重組人尿激酶陰陽離子交換層析對病毒的去除效果大于99.99％。
具體實施方式
下述實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。
實施例1
純化第1步：蛋白捕獲
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質，0.01mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.0后上樣。采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例2
純化第1步：蛋白捕獲
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脫雜質，0.005mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至6.5后上樣。采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例3
純化第1步：蛋白捕獲
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.7mol/LNaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脫雜質，0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例4
純化第1步：蛋白捕獲
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.12mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.4mol/L洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.07mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.07mol/LNaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.012mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.012mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質，0.012mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例5
純化第1步：蛋白捕獲
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephadex G-50凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質，0.01mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.0后上樣。采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例6
純化第1步：蛋白捕獲
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sephadex C-50陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脫雜質，0.005mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以Arginine Sepharose 4B親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至6.5后上樣。采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例7
純化第1步：蛋白捕獲
以Sephadex G-50陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.7mol/LNaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。
純化第2步：凝膠層析
以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質進行凝膠層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)進行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化2中間體。
純化第3步：陽離子交換層析
以SP Sephadex C-50陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡，將純化2中間體調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脫雜質，0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脫目標蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲存。
純化第4步：親和層析
以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質進行親和層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復融及混合，混合溶液調節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體本發(fā)明的初步純化液。
實施例8
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1初步純化液與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原。
實施例9
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液與0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)按1：1.5體積比混合，調節(jié)pH值至7.5后上樣，用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為重組人尿激酶原原液。
實施例10
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)進行平衡。純化4中間體與0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.5后上樣，用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為重組人尿激酶原原液。
實施例11
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.15mol/L NaCl)進行平衡。實施例1-7任意一項初步純化液與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：3體積比混合，調節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl) 洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得重組人尿激酶原原液。
實施例12
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1初步純化液調節(jié)pH值至6.0后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的尿激酶原。
實施例13
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的尿激酶原。
實施例14
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.11mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的尿激酶原。
實施例15
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的重組人尿激酶原。
實施例16
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1初步純化液與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1。
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進行平衡。純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.0后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的重組人尿激酶原。
實施例17
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液與0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至7.5后上樣，用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1。
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡。純化尿激酶原1調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脫， 根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的尿激酶原。
實施例18
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液與0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.5后上樣，用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1。以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進行平衡。純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的重組人尿激酶原。
實施例19
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.15mol/L NaCl)進行平衡。取實施例1-7任意一項初步純化液與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1。
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.11mol/L NaCl)進行平衡。純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的重組人尿激酶原。
實施例20
以蛋白G-Sepharose 4B為填料進行親和層析，上樣前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液進行平衡，將尿激酶原發(fā)酵液調節(jié)pH至7.5±0.5后上樣，上樣完畢后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl緩沖液洗脫目標蛋白，根據(jù)UV280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，既得初步純化液。
實施例21
以Streamline SP陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進行平衡，發(fā)酵液取上清液調節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體；以蛋白G-Sepharose4B為填料進行親和層析，上樣前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液進行平衡，將純化中間體調節(jié)pH至7.5±0.5后上樣，上樣完畢后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl緩沖液洗脫目標蛋白，根據(jù)UV280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，既得初步純化液。
實施例22
以Streamline DEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.15mol/L NaCl)進行平衡。取實施例17或18的初步純化液與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化尿激酶原1。
以SP Sepharose F.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.11mol/L NaCl)進行平衡。純化尿激酶原1調節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的重組人尿激酶原。