一種純化尿激酶的方法
【專利摘要】一種純化尿激酶的方法。本發(fā)明將尿激酶粗品中2個主要分子量區(qū)域的蛋白分開處理，通過調(diào)節(jié)pH值等手段進一步去除粗品中的雜質(zhì)、熱源和細胞內(nèi)毒素，得到了尿激酶精品。
【專利說明】一種純化尿激酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及從尿激酶粗品中進一步純化尿激酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尿激酶是一種堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人體及哺乳動物的尿液中，血液凝固時人體的正常機能，但是在某些病理狀態(tài)下，由血管內(nèi)形成血栓堵塞血液流通時，就會造成嚴重后果。尿激酶是溶血栓藥物，但它本身并不直接用于血塊本身，而是首先激活體內(nèi)的纖溶酶原，成為有活性的纖溶酶，纖溶酶作用于纖維蛋白酶凝塊，使其分解成可溶性多碳。
[0003]尿激酶有多種分子量形式，高分子量的尿激酶溶解血栓臨床效果要比低分子量的約高一倍，因此，國際上把尿激酶的分子量作為質(zhì)量標準的檢查項目之一，為減少低分子量的產(chǎn)生，生產(chǎn)過程中pH值不宜過低。
[0004]《中國藥典》2005版和2010版，明確規(guī)定“本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)60°C加熱10小時，以使病毒滅活”；且質(zhì)量標準要求尿激酶的細菌內(nèi)毒素小于1.0EU/萬單位。
[0005]目前，國內(nèi)不少專 家針對尿激酶的制備工藝進行了深入的試驗研究，如一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用(楊華英等專利號CN101693748A)、一種尿激酶制備方法(張志武等專利號CN101701215A)等，都結(jié)合使用離子交換層析法、凝膠分子篩法、免疫親和層析、對氨基苯甲脒-Sepharose親和層析技術(shù)，純化精制得到尿激酶。使產(chǎn)品的比活、高分子尿激酶相對含量以及尿激酶生物活性的回收率不斷提高。但是這些技術(shù)大多將細菌內(nèi)毒素和純化工藝分離，增加了工藝步驟和生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供了一種能夠從尿激酶粗品中純化尿激酶，同時去除病毒及熱原的尿激酶制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將尿激酶粗品經(jīng)溶解超濾、超濾的上層液和下層液分別處理后混合，經(jīng)過乙醇沉淀得到尿激酶精品，包括如下步驟:
[0008](I)粗品提取:取尿激酶粗品，加正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液進行溶解，尿激酶粗品與PH6.0正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的比例為:lg: 2-6ml;攪拌；過濾，將濾餅再加正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液進行溶解，濾餅與正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液按的比例為:Ig: 2~5ml ;攪拌,過濾；合并兩次的濾液,調(diào)節(jié)濾液pH至6.0 ;
[0009]正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的配制:將180g正丁酸銨溶解于1000ml70%乙醇溶液中，得18%正丁酸銨/乙醇溶液；將18%正丁酸銨/乙醇溶液與pH值6.0的磷酸緩沖溶液等體積混合，即得。
[0010](2) 30,000道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置15小時，用pH6.0磷酸緩沖液洗凈。[0011]20,000道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置15小時，用pH6.0磷酸緩沖液洗凈。
[0012](3)超濾:將粗提液用30，000道爾頓超濾膜進行超濾，超濾至原體積的1/5至1/20，分別收集濃縮液和濾液。
[0013](4)濃縮液處理:濃縮液加苯甲酸鈉2%溶液至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5至1/15。收集濃縮液，然后緩慢加入0.1~0.3mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入0.1~0.5mol/L硫酸銅溶液，調(diào)節(jié)pH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用pH7.0磷酸緩沖液溶解，加入緩沖液的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀。
[0014](5)濾液處理:濾液，然后緩慢加入0.1~0.3mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入
0.1~0.5mol/L醋酸鈣溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用水溶解，加入水的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀。
[0015](6)濃縮液沉淀和濾液沉淀:將步驟(4)和(5)的沉淀溶于ρΗ6.0磷酸緩沖液，用20，000道爾頓超濾膜過濾，至原體積的1/5至1/20 ;加水至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5，反復(fù)2-3次，濃縮液加入乙醇進行沉淀，濃縮液與加入乙醇的體積比為:1: 4~6，離心。再用乙醇洗滌沉淀物，離心，反復(fù)2~4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
[0016] 本發(fā)明將尿激酶粗品溶解于混合溶劑中，再沉淀使得粗品中的雜質(zhì)被清除；并且創(chuàng)造性的將尿激酶中2個主要分子量區(qū)域的蛋白分開處理，通過調(diào)節(jié)pH值等手段進一步去除粗品中的雜質(zhì)、熱源和細胞內(nèi)毒素，得到了尿激酶精品。高分子尿激酶成分的單獨純化手段，提高了純化的效率，得到高分子尿激酶相對含量高的精制產(chǎn)品。本發(fā)明的處理手段也有效的提聞了廣品的回收率。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0018]實施例1
[0019]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將尿激酶粗品經(jīng)溶解超濾、超濾的上層液和下層液分別處理后混合，經(jīng)過乙醇沉淀得到尿激酶精品，包括如下步驟:
[0020](I)粗品提取:取尿激酶粗品400g，加正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液進行溶解，尿激酶粗品與正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的比例為:lg: 5ml ;攪拌；過濾，將濾餅再加磷酸緩沖液進行溶解，濾餅與正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液按的比例為:Ig: 4ml;攪拌，過濾；合并兩次的濾液,調(diào)節(jié)濾液pH至6.0 ;
[0021]正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的配制:將180g正丁酸銨溶解于1000ml70%乙醇溶液中，得18%正丁酸銨/乙醇溶液；將18%正丁酸銨/乙醇溶液與pH值6.0的磷酸緩沖溶液等體積混合，即得。
[0022](2) 30，000道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置15小時，用pH6.0磷酸緩沖液洗凈。
[0023]20,000道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置15小時，用pH6.0磷酸緩沖液洗凈。
[0024](3)超濾:將粗提液用超濾膜進行超濾，超濾至原體積的1/5，分別收集濃縮液和濾液。[0025](4)濃縮液處理:濃縮液加苯甲酸鈉2%溶液至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5。收集濃縮液，然后緩慢加入0.25mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入0.3mol/L醋酸鈣溶液，調(diào)節(jié)PH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用pH7.0磷酸緩沖液溶解，加入緩沖液的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀。
[0026]濾液處理:濾液，然后緩慢加入0.25mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入0.3mol/L醋酸鈣溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用水溶解,加入水的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀。
[0027]濃縮液沉淀和濾液沉淀:將步驟(4)和(5)的沉淀溶于pH6.0磷酸緩沖液，用20，000道爾頓超濾膜過濾，至原體積的1/5 ;加水至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5，反復(fù)2次，濃縮液加入乙醇進行沉淀，濃縮液與加入乙醇的體積比為:1: 4.5，離心。再用乙醇洗滌沉淀物，離心，反復(fù)3次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
[0028]400g尿激酶粗品的總效價為0.170億單位，尿激酶精品中高分子尿激酶相對含量98.5%，活性回 收率80%。
【權(quán)利要求】
1.一種能夠從尿激酶粗品中純化尿激酶，同時去除病毒及熱原的尿激酶制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)粗品提取:取尿激酶粗品，加正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液進行溶解，尿激酶粗品與PH6.0正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的比例為:lg: 2-6ml ;攪拌；過濾，將濾餅再加正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液進行溶解，濾餅與正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液按的比例為:Ig: 2~5ml ;攪拌,過濾；合并兩次的濾液，調(diào)節(jié)濾液pH至6.0 ； 正丁酸銨/乙醇/磷酸鹽溶液的配制:將180g正丁酸銨溶解于1000ml70%乙醇溶液中，得18%正丁酸銨/乙醇溶液；將18%正丁酸銨/乙醇溶液與pH值6.0的磷酸緩沖溶液等體積混合，即得； (2)30，OOO道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置.15小時，用pH6.0磷酸緩沖液洗凈； .20,000道爾頓超濾膜預(yù)處理:用堿處理，lmol/1的氫氧化鈉溶液循環(huán)35分鐘，靜置15小時，用PH6.0磷酸緩沖液洗凈。 (3)超濾:將粗提 液用30，000道爾頓超濾膜進行超濾，超濾至原體積的1/5至1/20，分別收集濃縮液和濾液； (4)濃縮液處理:濃縮液加苯甲酸鈉2%溶液至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5至1/15。收集濃縮液，然后緩慢加入0.1~0.3mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入0.1~.0.5mol/L硫酸銅溶液，調(diào)節(jié)pH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用pH7.0磷酸緩沖液溶解，加入緩沖液的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至5.0-5.5，用乙醇進行沉淀； (5)濾液處理:濾液，然后緩慢加入0.1~0.3mol/L磷酸鈉溶液，攪拌，最后加入0.1~.0.5mol/L醋酸鈣溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀。沉淀用水溶解，加入水的比例為Ig: 10ml，攪拌，調(diào)節(jié)pH值至10.0-10.5，用乙醇進行沉淀； (6)濃縮液沉淀和濾液沉淀:將步驟(4)和(5)的沉淀溶于pH6.0磷酸緩沖液，用20，000道爾頓超濾膜過濾，至原體積的1/5至1/20 ;加水至原體積后，繼續(xù)超濾至原體積的1/5，反復(fù)2-3次，濃縮液加入乙醇進行沉淀，濃縮液與加入乙醇的體積比為:1: 4~6，離心。再用乙醇洗滌沉淀物，離心，反復(fù)2~4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
【文檔編號】C12N9/72GK104031901SQ201410222057
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月21日
【發(fā)明者】郭國嶺, 扈會平, 徐曉, 曹延琴, 王偉梅, 邱偉 申請人:麗珠集團麗珠制藥廠