專利名稱：：含活性尿激酶原的組合物、其凍干方法及凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有活性尿激酶原的藥物組合物、其凍干方法及凍干制劑。
背景技術(shù)：
：由血栓引起的心血管系統(tǒng)疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，臨床上急需一種溶栓效果好、副作用小的藥物。尿激酶原(Pro-uk)可專一地激活血栓表面的纖溶酶原，進(jìn)而特異性地溶解血栓，與此同時(shí)不會(huì)破壞纖溶系統(tǒng)，全身出血的副作用??；經(jīng)過臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，Pro-uk還具有使用劑量小、使用安全、溶栓效果好、再栓率低、無過敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種安全無毒的、理想的生物類溶栓制劑，具有廣闊的市場前景。由于天然材料中Pro-uk含量甚微，難以大量制備，人們從二十世紀(jì)八十年代開始就開始采用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)重組Pro-uk，目前，已經(jīng)在大腸桿菌(HomesWE，etal.Cloningandexpressionofthegeneforpro-urokinaseinEscherichiacoli.Biotechnology，1985；3923；WinklerME，etal.Purificationandcharacterizationofrecombinantsingle-chainurokinaseproducedinEschericheacoli.Biochemistry，1986；254041)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞如小鼠IC9細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞(NolliML，etal.Productionandcharaterisationofhumanrecombinantsinglechainurokinase-typeplasminogenactivatorfrommousecells.Fibnrinolysis，19893101；NellesL，etal.Characterizationofrecombinanthumansinglechainurokinase-typeplasminogenactivatormutantsproducedbysite-specificmutagenesisofLysine.JBiolChem，1987；2625682；李風(fēng)知等.人尿激酶原全長cDNA在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá).生物工程學(xué)報(bào)，1991；7114；SatohM，etal.Stableproductionofrecombinantpro-urokinasebyhumanlymphoblastoidNamalwaKJM-1cellsHost-celldependencyoftheespressed-proteinstability.Cytotechnology，1993；1379；SatohM，etal.Efficientexpressionofpro-urokinasebyhumanlymphoblastoidNamalwaKJM-1cellsusingMoloneyretroviralpromoter.Cytotechnology，1996；18167)和昆蟲細(xì)胞(徐楊等.人尿激酶原cDNA在昆蟲桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá).生物化學(xué)雜志，1993；6709)、骨髓瘤細(xì)胞(WeaverWD，etal.Newrecombinantglycosylatedprourokinasefortreatmentofpatientswithacutemyocardialinfarction.JAmCollCardiol，1994；241242)等中都獲得了很高的表達(dá)并進(jìn)行了純化。Pro-uk制劑極不穩(wěn)定，容易被多種蛋白酶切割成尿激酶(UK)，同時(shí)，在液體狀態(tài)下，即使低溫保存也會(huì)自動(dòng)分解(于芳等，重組尿激酶原半成品的穩(wěn)定性觀察，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2000，24(1)70)；另外，由于實(shí)驗(yàn)室測定、臨床使用以及日常運(yùn)輸和貯存的需要，通常需要采用干燥的方法穩(wěn)定其活性防止降解。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中尿激酶原制劑不穩(wěn)定的問題，本發(fā)明的發(fā)明人通過長期研究，獲得了一種含有活性尿激酶原的組合物，與現(xiàn)有的尿激酶原制劑相比，本發(fā)明的組合物可以長期穩(wěn)定保存。本發(fā)明另一方面提供了該尿激酶原組合物的制備方法。本發(fā)明藥物組合物含有適量的Pro-uk、賦形劑和緩沖溶液和鹽類。其中，賦形劑可為糖類和/或多元醇，可選擇蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麥芽糖等中的一種或多種，其中優(yōu)選甘露醇，因?yàn)楦事洞純龈傻漠a(chǎn)品無論從外觀形態(tài)還是凍干時(shí)間都優(yōu)于其它賦形劑，而且甘露醇已在臨床使用多年，價(jià)格也較便宜，因此，選擇甘露醇可以縮短產(chǎn)品的凍干時(shí)間，提高凍干效率，降低成本。甘露醇含量的優(yōu)選范圍為6％-12％(重量/體積比)，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，最優(yōu)選6％(重量/體積比)；緩沖液可以為磷酸鹽緩沖液和/或Tris-HCl，其中磷酸鹽緩沖液的含量的優(yōu)選范圍為8-25mmol/L，Tris-HCl含量的優(yōu)選范圍為0.005-0.015mol/L；在該組合物中，其中的鹽類可以為氯化鈉，氯化鈉含量的優(yōu)選范圍為0.03-0.20mol/L；Pro-uk可以為任何可能的濃度，但為了凍干和醫(yī)療上使用的方便，優(yōu)選濃度范圍為1.5-5.5mg/ml。另外，在上述組合物中，如果添加保護(hù)劑則可得到更好的凍干效果，保護(hù)劑可為蛋白質(zhì)，優(yōu)選白蛋白，白蛋白在組合物中含量的優(yōu)選范圍為1.5-7.5‰(重量/體積比)。需要說明的是上述藥物組合物中的Pro-uk可按現(xiàn)有技術(shù)的方法制備，但并不限于這些方法；溶液可按一般溶液的配制方法配制，但為防止Pro-uk的降解，最好在低溫下配制，配制時(shí)動(dòng)作應(yīng)溫和。本發(fā)明還提供了含活性Pro-uk的組合物溶液的冷凍干燥方法，該方法包括以下步驟將分裝好的Pro-uk產(chǎn)品放入預(yù)先降溫至-35℃～-45℃的凍干機(jī)，預(yù)凍2-4h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-25℃～-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至25℃～35℃，穩(wěn)定后保持0.5h～1.5h，即可結(jié)束凍干。生物制品干燥的方法很多，但多數(shù)可使蛋白質(zhì)變性。而冷凍干燥技術(shù)利用冷凍的溶液在低溫低壓條件下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)直接升華除去水分完成干燥。冷凍干燥技術(shù)可以很好地保持藥物原有的理化性質(zhì)和生理活性，且有效成分損失極少。此外，凍干制劑特有的疏松多孔結(jié)構(gòu)，可以使藥物易于重新復(fù)水而恢復(fù)活性，而且凍干制劑含水量低，易于長期保存。因此，冷凍干燥是臨床和實(shí)驗(yàn)室保存蛋白產(chǎn)品的最佳方法之一。本發(fā)明的含活性Pro-uk的藥物組合物采用以上方法凍干后，獲得了活性Pro-uk的凍干制劑。該凍干制劑外觀良好，在-20℃和4℃貯存條件下，保存3年活性無變化；通過加速貯存試驗(yàn)對凍干制劑在不同條件下的長期穩(wěn)定性進(jìn)行觀察，對貯存壽命進(jìn)行了估算，結(jié)果如下Pro-uk活性損失50％的情況下Pro-uk凍干制劑在37℃可存放173d，25℃存放2.78年，4℃存放70.8年，0℃存放118年；活性損失10％時(shí)，Pro-uk凍干制劑在37℃可存放20d，25℃存放100d，4℃存放7.6年，0℃存放11年，足以滿足Pro-uk實(shí)驗(yàn)室和臨床貯存的需要。附圖1Pro-uk活性降解速度曲線。附圖2Pro-uk的貯存壽命曲線。具體實(shí)施例方式以下是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方案的例證。實(shí)施例僅用于說明發(fā)明的目的，并非意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一尿激酶原的制備(參見中國專利重組人糖基化尿激酶原的制備方法，公告號(hào)CN1062016C，公告日2001年2月14日)(1)尿激酶原基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建采用肉豆寇酯(PMA)誘導(dǎo)Detroit562細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，構(gòu)建cDNA文庫，通過篩選獲得了含有編碼尿激酶基因片段的陽性克隆株，得到人尿激酶原全長cDNA基因，通過多步基因重組技術(shù)操作，將表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體，分別受金屬硫蛋白(MT)和SV40早期啟動(dòng)子控制。(2)轉(zhuǎn)染和篩選高效表達(dá)的CHO工程細(xì)胞將20-40μgpMTSV-du質(zhì)粒DNA通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞，先用HAT選擇培養(yǎng)基篩選，10天后換成含1-3×10-8MMTX的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行dhfr和MTX雙重篩選，并對表達(dá)有尿激酶原活性的陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)多次亞克隆和MTX加壓擴(kuò)增基因，鋅離子誘導(dǎo)，最終篩選到能高效表達(dá)尿激酶原的細(xì)胞株。(3)CHO工程細(xì)胞的培養(yǎng)和放大采用微載體(Cytopore)灌流培養(yǎng)技術(shù)和低血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)表達(dá)尿激酶原的工程細(xì)胞株，得到含尿激酶原的原料。(4)重組人尿激酶原的純化采用四步法，即CM陽離子層析、MPG吸附層析、SephacrylS-200凝膠過濾和對氨基苯甲脒層析，即可得到純品尿激酶原。實(shí)施例二Pro-uk組合物的真空冷凍干燥經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至10mmol/L，氯化鈉濃度至0.05mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，放入預(yù)先降溫至-40℃的凍干機(jī)，預(yù)凍3h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至30℃，穩(wěn)定后保持1h，即可結(jié)束凍干。實(shí)施例三Pro-uk組合物的真空冷凍干燥經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品4mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至10mmol/L，氯化鈉濃度至0.10mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，放入預(yù)先降溫至-40℃的凍干機(jī)，預(yù)凍3h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至30℃，穩(wěn)定后保持1h，即可結(jié)束凍干。實(shí)施例四Pro-uk組合物的真空冷凍干燥經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品5mg/ml，加甘露醇至10％(重量/體積比)，白蛋白至7‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至20mmol/L，氯化鈉濃度至0.20mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，放入預(yù)先降溫至-40℃的凍干機(jī)，預(yù)凍4h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至35℃，穩(wěn)定后保持1h，即可結(jié)束凍干。實(shí)施例五Pro-uk組合物的真空冷凍干燥經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至20mmol/L，氯化鈉濃度至0.20mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，放入預(yù)先降溫至-40℃的凍干機(jī)，預(yù)凍3h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至30℃，穩(wěn)定后保持1h，即可結(jié)束凍干。實(shí)施例六Pro-uk組合物的真空冷凍干燥經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，Tris-HCl緩沖液濃度至0.10mol/L，氯化鈉濃度至0.05mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，放入預(yù)先降溫至-40℃的凍干機(jī)，預(yù)凍3h，然后開始抽真空，進(jìn)行首次升溫至-30℃，當(dāng)瓶內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至30℃，穩(wěn)定后保持1h，即可結(jié)束凍干。實(shí)施例七不同濃度賦形劑和保護(hù)劑對Pro-uk凍干制劑形態(tài)及活性的影響經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加磷酸鹽緩沖液濃度至10mmol/L，氯化鈉濃度至0.05mol/L，并加不同濃度賦形劑和保護(hù)劑以評價(jià)它們對pro-uk凍干制劑形態(tài)及活性的影響。Pro-uk的活性測定采用改良的瓊脂糖-纖維蛋白溶解圈法(參見XiaoC，HuangZ，LinF，etal.Highdensitycultivationofgenetically-engineeredCHOcelllinewithmicrocarrierculturesystem.ChinMedSciJ，1994，9(2)71-74)。以下未具體說明，則活性測定均采用同樣方法。表一不同濃度賦形劑和保護(hù)劑對pro-uk凍干制劑形態(tài)及活性的影響N＝3++外觀形態(tài)好，活性損失??；+外觀形態(tài)好；-不成形實(shí)施例八緩沖液類型、緩沖液濃度及氯化鈉的濃度對Pro-uk凍干制劑外形的影響含有不同的緩沖液和氯化鈉濃度的Pro-uk產(chǎn)品，加入7％的甘露醇、5‰的人血白蛋白使其完全溶解后裝入小瓶，每瓶1ml，放入凍干箱內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，待干燥完畢后，取出產(chǎn)品進(jìn)行外觀檢查，可以看出含有磷酸緩沖液(PB)、Tris-HCl的Pro-uk制劑外觀疏松，形態(tài)良好(見表二)，加水后溶解迅速而完全、透明度好，立即恢復(fù)原來的性狀。表二不同緩沖液濃度對pro-uk凍干產(chǎn)品外觀形態(tài)的影響N＝4++外觀形態(tài)良好；+外觀形態(tài)好；-不成形實(shí)施例九Pro-uk凍干制劑的穩(wěn)定性觀察經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至10mmol/L，氯化鈉濃度至0.05mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，按實(shí)施例二的方法凍干。pro-uk凍干制劑放入-20℃、4℃、25℃和37℃下保存，并定期(1月、3月、6月、9月、12月、15月)對其活性的穩(wěn)定性進(jìn)行觀察。可見在-20℃和4℃下保存，其活性無變化；而在25℃和37℃下保存，其活性分別下降37％和81％(見表三)。表三Pro-uk保存在-20℃、4℃、25℃和37℃時(shí)的活性(IU/ml)實(shí)施例十Pro-uk凍干產(chǎn)品的加速貯存試驗(yàn)經(jīng)分離純化后的Pro-uk純品2mg/ml，加甘露醇至6％(重量/體積比)，白蛋白至3‰(重量/體積比)，磷酸鹽緩沖液濃度至10mmol/L，氯化鈉濃度至0.05mol/L，分裝到1ml的安瓿瓶中，按實(shí)施例二的方法凍干。加速試驗(yàn)采用Greiff等(GriffD，etal，Anacceleratedstoragetestforpredictingthestabilityofsuspensionofmeaslesvirusdriedbysublimationinvacuo.JImmunol，1965；94395)報(bào)道的多點(diǎn)等溫穩(wěn)定性試驗(yàn)(MIS)，將凍干后的Pro-uk小瓶分別置于60℃(20瓶)、70℃(12瓶)、80℃(5瓶)的水浴中，每間隔24h從3種不同溫度水浴中取一瓶，測pro-uk的活性(表五)。表五MIS試驗(yàn)?zāi)蚣っ冈瓬y定結(jié)果數(shù)據(jù)處理與Greiff等介紹的方法大致相同，將不同溫度貯存后測得的Pro-uk效價(jià)的對數(shù)與各效價(jià)相對應(yīng)的時(shí)間、貯存時(shí)間的對數(shù)與各相對應(yīng)的Pro-uk活性降解的對數(shù)分別輸入計(jì)算機(jī)，即可求出不同貯存時(shí)間時(shí)Pro-uk活性降解速度〔K1〕分別為-0.068、-0.161和-0.443，其降解速度曲線如附圖1。通過該曲線可計(jì)算出Pro-uk凍干制劑在37℃、25℃、4℃和0℃時(shí)的降解速度分別為-0.00608、-0.00169、-0.00016和-0.00011。據(jù)降解速度K1和各K1值相對應(yīng)的Pro-uk活性降解10％或50％所需的時(shí)間，繪制Pro-uk的貯存壽命估算曲線，依據(jù)上述兩條曲線即可對Pro-uk凍干制劑活性的降解速度和貯存壽命進(jìn)行估算依據(jù)MIS試驗(yàn)計(jì)算出Pro-uk凍干制劑在60℃、70℃和80℃貯存時(shí)，其活性損失50％時(shí)所需時(shí)間為6.27d、1.92d和0.48d；活性損失10％時(shí)所需時(shí)間為0.8d、0.2d和0.04d，并由此可繪制出Pro-uk的貯存壽命曲線(附圖2)。由此曲線可估算出Pro-uk活性損失50％的情況下Pro-uk凍干制劑在37℃可存放173d；25℃存放2.78年，4℃存放70.8年，0℃存放118年。同樣根據(jù)此方法也可推測出活性損失10％時(shí)，Pro-uk凍干制劑在37℃可存放20d，25℃存放100d，4℃存放7.6年，0℃存放11年。權(quán)利要求1.一種尿激酶原組合物，含有適量的尿激酶原、賦形劑、緩沖溶液和鹽類。2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中還包括保護(hù)劑。3.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中尿激酶原含量為1.5-5.5mg/ml。4.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所說的保護(hù)劑是濃度為1.5‰-7.5‰(重量/體積比)的白蛋白。5.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中的賦形劑是糖類和/或多元醇。6.權(quán)利要求6所述的組合物，其中的糖類和/或多元醇選自甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麥芽糖中的一種或幾種。7.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。8.權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中的鹽類是濃度為0.03-0.20mol/L的氯化鈉。9.權(quán)利要求1至8中任意組合物的冷凍干燥方法，該方法包括以下步驟i)取權(quán)利要求1至8的任意組合物，放入預(yù)先降溫至-35℃～-45℃的凍干機(jī)，預(yù)凍2-4h；ii)然后開始抽真空，升溫至-25℃～-35℃；iii)當(dāng)容器內(nèi)水分基本升華后進(jìn)行第二次升溫，使其溫度上升至-25℃～-35℃，穩(wěn)定后保持0.5h～1.5h。10.由權(quán)利要求9的方法制備得到的尿激酶原凍干制劑。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有活性尿激酶原的藥物組合物、其凍干方法及凍干制劑。文檔編號(hào)A61K9/19GK1730098SQ20041005800公開日2006年2月8日申請日期2004年8月6日優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日發(fā)明者姜燕,胡鐵強(qiáng),肖成祖申請人:上海天士力藥業(yè)有限公司