專利名稱：豬進行性萎縮性鼻炎的預防、治療與檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophicrhinitis，PAR)的預防、治療與檢測，其中多殺巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)的三種亞基被使用作為進行PAR的預防、治療與檢測的活性組份。本發(fā)明也涉及能防治至少PAR的動物用多價疫苗，該疫苗包含三種針對PAR的PMT亞基以及至少一種與其它的動物疾病有關(guān)聯(lián)的病原性抗原或其抗原表位來作為疫苗的活性組份。
背景技術(shù)：
豬萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)，又稱豬進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)，是豬常見的上呼吸道細菌性疾病，它會造成豬鼻甲介骨萎縮與鼻吻變形以及影響全身骨骼發(fā)育，進而導致豬生長遲緩，且致使豬容易染患繼發(fā)復合性肺炎，而造成養(yǎng)豬業(yè)者的莫大損失。
PAR的病因曾引起諸多的爭議，直到de Jong等人(deJong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests forPasteurella multocida isolates.IPVS 6th Congress，211，1980)以及Rutter與Rojas(Vet.Rec.，110531-535，1982)證實PAR主要是由多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型產(chǎn)毒株感染所引起。多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)存在于豬上呼吸道的常駐菌群內(nèi)，在不論是否罹患有PAR的豬身上皆可分離到此細菌，而依據(jù)莢膜抗原在血清學上可區(qū)分為A、B、D、E與F等五種血清型(R.B.Rimler and K.R.Rhoades(1987)，J.Clin.Microbiol.，25615-8)，其中A型菌株的莢膜中含有透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)而使得菌落呈粘液狀，而D型菌株的莢膜所含透明質(zhì)酸則較少。此外，D型菌株被發(fā)現(xiàn)會與吖啶黃(acriflavine)產(chǎn)生凝集反應(yīng)(G.R.Carter and P.Subtonto(1973)，Am.J.Vet.Res.，34293-294)。但是，僅有在罹患PAR的豬體內(nèi)才可分離到產(chǎn)毒株(Brim et al.(1986)，I.P.V.S.9th Congress，p.237；Lariviere et al.(1992)，J.Clin.Microbiol.，301398-1401；Nielsen et al.(1986)，I.P.V.S.9thCongress，p.239)。
D型多殺巴斯德氏菌的毒素基因已被克隆、測序以及表達，并被命名為toxA基因(S.K.Petersen et al.(1989)，Infect.Immun.，573907-3913)(SEQ ID NO1)，且完整的毒素基因被發(fā)現(xiàn)包含4,380個核苷酸序列(nucleotide sequence)，G+C％為34.6％，而起始密碼子(start codon)位于第219個核苷酸，且于PMT基因的上游可能存在有一個轉(zhuǎn)錄抑制子(TxaR)來調(diào)控toxA基因的表達(S.K.Petersen(1990)，Mol.Microbiol.，4821-830)。Kamps等人利用根據(jù)部分PMT基因序列所制造的探針來進行Southern印跡分析(Southern Blottinganalysis)，所得結(jié)果顯示非產(chǎn)毒株也呈現(xiàn)有微弱的反應(yīng)，因而認為非產(chǎn)毒株也可能具有部分或不完整的毒素基因(Kamps AMIE et al.(1990)，J.Clin.Microbiol.，281858-1861)。Nagai等人利用PCR方法來鑒別多殺巴斯德氏菌分離株，而認為D型產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的差異應(yīng)在于PMT基因的有無(S.Nagai et al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，321004-1010)。
但是，除D型多殺巴斯德氏菌外，A型多殺巴斯德氏菌也常在罹患PAR豬中被分離出來(T.Sakano et al.(1992)，J.Vet.Med.Sci.，54403-7)。Foged以胎牛肺臟細胞及單克隆抗體來檢測A型與D型分離株而發(fā)現(xiàn)這兩種血清型的毒素蛋白質(zhì)皆可產(chǎn)生相似的細胞病變(Infect.Immun.，561901-1906，1988)，而Frandsen等人也發(fā)現(xiàn)A型多殺巴斯德氏菌可產(chǎn)生分子量相近的毒素蛋白質(zhì)產(chǎn)物(J.Vet.Med.，38344-452，1991)，這顯示A型與D型多殺巴斯德氏菌所產(chǎn)生的PMT毒素性質(zhì)應(yīng)極為相似，因此A型產(chǎn)毒株也常被提及是造成PAR的病原當中的一種(T.Sakano et al.(1992)，J.Vet.Med.Sci.，54403-7)。
但是，A型與D型多殺巴斯德氏菌所產(chǎn)生的PMT毒素及其編碼基因的異同性仍未被證實。此外，不論是A型或D型多殺巴斯德氏菌，它們有許多野外分離株經(jīng)重復的豬感染實驗后并無法導致任何典型的PAR病變，這引起PMT產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的爭議，而導致目前在PMT毒素蛋白質(zhì)與編碼基因的研究上仍存在有諸多疑點，也即從某些多殺巴斯德氏菌分離株所提取出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物即使以極高濃度被加入時也不會導致任何的細胞病變，而這些非產(chǎn)毒株究竟是否在PMT基因的上游具有調(diào)控因子而因此抑制PMT的表達，抑或是因為完全不具有PMT基因，或者是因為基因缺損不全而導致無法制造完整的PMT，迄今這些推論都未獲得證實。
多殺巴斯德氏菌A型與D型產(chǎn)毒株間的PMT基因與蛋白質(zhì)序列的相似程度仍然未知，而目前已被登錄于Genbank的PMT基因序列皆為D型產(chǎn)毒株，因此目前有關(guān)A型與D型產(chǎn)毒株的PMT基因序列的比對并無完整的報告。此外，多殺巴斯德氏菌也為許多動物的呼吸道內(nèi)的常在菌當中的一種，也是造成家禽的禽霍亂的一個主要病原。因此，無論是在多殺巴斯德氏菌的快速檢驗或其它實驗研究上，針對所分離出的菌株若能建立一快速精確的鑒別系統(tǒng)以供菌株類型的區(qū)別以及PMT生成與否的確認，實存在有一迫切需要。
一分子量約為146kDa的多殺巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)已從D型多殺巴斯德氏菌被提取出(Rutter and Mackenzie(1984)，Vet.Rec.，11489-90)，該毒素經(jīng)肌肉注射可引發(fā)豬呈現(xiàn)典型的PAR病變，因而PMT毒素被證實是造成鼻甲骨萎縮變形的致病因子(N.Chanter et al.(1986)，J.Gen.Microbiol.，1321089-1097)。經(jīng)純化的PMT是一單一的多肽(N.T.Foged(1988)，Infect.Immun.，561901-1906)，其經(jīng)測序分析被確認含有1,285個氨基酸，分子量為146kDa(R.Felix et al.(1992)，Infect.Immun.，604984-4988)，且該毒素的氨基酸組成是以谷氨酸(glutamic acid)、天冬氨酸(aspartic acid)、甘氨酸(glycine)、脯氨酸(prolin)、丙氨酸(alanine)與亮氨酸(leucine)占較大的比例(T.Nakai et al.(1984)，Infect.Immun.，46429-434)。
PMT的氨基酸序列(SEQ ID NO2)可從NCBI網(wǎng)站查得，登記號(accession number)為CAA35885。
若將純化的毒素保存于去離子水(DW)中，或予以置放于高于pH10或低于pH4的溶液中，皆會使毒素不穩(wěn)定。因此傳統(tǒng)用于預防豬萎縮性鼻炎的疫苗抗原是利用福爾馬林(formaldehyde)將PMT不活化，以使PMT成為失去毒性但保有抗原性的類毒素(toxoid)，以供作為PAR疫苗的主要抗原組份。但是，生產(chǎn)PMT類毒素的制程耗時繁復，首先，需于37℃下以血液培養(yǎng)基來培養(yǎng)多殺巴斯德氏菌產(chǎn)毒株歷時26小時，或是以腦心浸出物肉湯培養(yǎng)基(brain heart infusionbroth，BHI broth)予以培養(yǎng)歷時72小時，然后進行PMT的提取與濃縮，所收獲的毒素于37℃下以1％福爾馬林予以滅活處理4天之后，才能得到低毒性但仍具抗原性的類毒素。因此，除了制程繁復以外，傳統(tǒng)PAR類毒素疫苗所需的生產(chǎn)成本極高，因而成為臺灣地區(qū)目前自國外進口的豬用細菌性疫苗(swine bacterial vaccines)中單價最為昂貴的種類。
此外，由于PMT類毒素在制造過程中需使用福爾馬林予以長時程處理，而可能使該毒素的抗原性產(chǎn)生一些無法預估的化學結(jié)構(gòu)性變化，進而影響到疫苗的效力，因此在臺灣農(nóng)民使用PAR疫苗的意愿并不高。另外，多殺巴斯德氏菌本身的抗藥性極高，諸多抗生素藥物已無法有效控制PAR，造成此病的罹患率在臺灣境內(nèi)一直居高不下。因此，對于獲得一種具有生產(chǎn)時間短、效率高、生產(chǎn)成本低廉、無毒性、高安全性及高免疫保護效力特點的PAR疫苗，存在有一迫切需求。
另外，假性狂犬病(pseudorabies，PR)也是豬的一種高傳染性與致死性疾病，哺乳仔豬及離乳幼豬感染此病后的死亡率甚至可高達100％，而即使耐過此病的豬也會因生長遲緩而導致?lián)Q肉率變差，而懷孕母豬若感染本病則會造成流死產(chǎn)(H.J.Nauwynck(1997)，Vet.Microbiol.，553-11)。為撲滅此疾病，臺灣規(guī)定需使用gE基因缺損的病毒來作為制造疫苗的病毒株，而因為此病毒株的gE基因被完全去除而使得該病毒在復制時，不能產(chǎn)生gE糖蛋白，以致于所生成的病毒外套上缺少gE糖蛋白。于是，以此種疫苗予以免疫的豬將不會產(chǎn)生對抗gE糖蛋白的抗體(van Oirschot，J.T.et al.(1986)，J.Gen.Virol.，671179-82)，配合針對gE的酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的檢測，即可與因感染野生型病毒而于體內(nèi)產(chǎn)生有抗gE抗體的陽性豬作明顯區(qū)別，而后將gE抗體陽性豬淘汰，而達到撲滅PR的目的(P.C.Yang(1996)，J.Chin.Soc.Vet.Sci.，22323-30)。
多價疫苗(multi-valent vaccine)為現(xiàn)今疫苗發(fā)展的主要趨勢，其優(yōu)點是經(jīng)免疫后能同時預防多種疾病的感染，并可大幅降低因免疫多種疫苗所導致的多重壓力(multiple stress)以及減少接種疫苗的人工成本。由于年齡越小的豬在感染PAR和/或PR后所產(chǎn)生的癥狀會越嚴重，而以這兩種疾病的疫苗來免疫懷孕母豬的時機是相接近的，為了避免懷孕母豬因多次免疫而產(chǎn)生壓力進而造成流產(chǎn)，若能開發(fā)出針對PAR與PR的雙價疫苗并通過免疫懷孕母豬后所產(chǎn)生的移行抗體，將能有效達到保護仔豬免于這兩種疾病的早期感染的目的。此外，疫苗的價格、疫苗用于豬身上的安全性以及能否在豬體內(nèi)激起良好的抗體保護效力等，也都是良好疫苗所必須滿足的條件。
PMT是一種非分泌型的內(nèi)毒素，而且對熱敏感。由于致病所需PMT的量十分的低，而且PMT的免疫原性低，自然感染下不易引發(fā)宿主對PMT的免疫反應(yīng)，因而在感染PAR的豬身上難以測得大量的中和抗體。
PMT的檢測方式有多種，就細菌的分離而言，可利用小白鼠致死實驗(mouse lethal test，MLT)、天竺鼠皮膚壞死實驗(GPST)、EBL細胞與非洲綠猿腎臟細胞株(Vero cell line)的細胞病變(CPE)、三明治ELISA(N.T.Foged et al.(1988)，J.Clin.Microbiol.，261419-1420)、PCR(S.Nagai et.al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，321004-1010)等方法來作檢測，由此檢測PAR產(chǎn)毒株的存在與毒力。
關(guān)于監(jiān)測PAR疫苗的免疫效力以及進行豬群感染時的監(jiān)控，用來檢測血清中和抗體效價的傳統(tǒng)方法是利用PMT對EBL細胞(E.M.Kamps et.al.(1987)，Vet.Microbiol.，13235-248)與Vero細胞(A.M.Pennings and P.K.Storm(1984)，Vet.Microbiol.，9503-508)的細胞病變(CPE)或是小鼠致死試驗(MLT)。由于EBL細胞并非細胞株，這造成檢測上的一大限制。Vero細胞雖為細胞株，但培養(yǎng)細胞的步驟耗時且繁瑣，所需要的操作時間及費用均高，而且在判定上易受人為主觀及細胞狀態(tài)的影響。使用小鼠致死試驗(MLT)時，需要注射待測血清和PMT的混合液至小鼠身上，因而操作時間長且必須犧牲動物，故也有不利的地方。
因此，若能建立一快速檢驗方法來檢測抗-PMT抗體，將可解決在PAR感染時以及免疫后抗體效價的檢測問題，而有利于評估豬群的免疫狀況。
此外，佐劑(adjuvant)在疫苗的制備上可能扮演一重要角色。佐劑是非抗原性物質(zhì)，其可以顯著提升抗原的免疫能力，其中所涉及的作用機制可能是佐劑會改變蛋白質(zhì)分子上的抗原表位(epitopes)的電荷或構(gòu)造因而增加蛋白質(zhì)分子的抗原性。佐劑還能延緩抗原被吸收及釋出的速率以及促使抗原與免疫細胞結(jié)合，由此而提升免疫者的免疫反應(yīng)(R.Edelman(1980)，Rev.Infect.Dis.，2370-383)。佐劑也能促使少量抗原產(chǎn)生高效力且長時效的免疫反應(yīng)，由此降低疫苗的生產(chǎn)成本(R.K.Gupta and G.R.Siber(1995)，Vaccine，131263-76)。
佐劑依來源可分成四種，第一種為植物源性，如植物皂素(saponin)或葡聚糖(glucan)提取物；第二類為細菌源性，如trehalose dymicolate、霍亂毒素(choleric toxin)、單磷?；|(zhì)A(monophosphoryl lipid A)、脂多糖(lipopolysaccharides)及其衍生物；第三類為化學物質(zhì)，如氫氧化鋁(aluminum hydroxide)、表面活性劑(surfactants)以及乳劑(emulsions)；第四類則包含細胞因子(IFN或GM-CSF)與性激素二羥表雄甾酮(dihydroxyepiandrosterone，DHEA)(F.M.Audibert and L.D.Lise(1993)，Immunol.Today，14281-4)。
在疫苗制造上慣用的佐劑包括鋁化合物[Aluminumcompounds，又稱鋁膠(aluminum gel)]，其中以氫氧化鋁(aluminum hydroxide，Al(OH)3)與磷酸鋁(aluminumphosphate，AlPO4)最為常見，此外還有硫酸鋁鉀鹽(potassiumaluminum sulfate，KAl(SO4)2·12H2O)等鋁化合物(D.E.S.Stewart-Tull(1996)，Aluminum adjuvants.In Vaccineprotocols，Robinson，A.，G.H.，and C.N.Wiblin，F(xiàn)arrarHuman Press.Totoga，New Jersey，USA.pp.135-139)；弗氏完全佐劑(Freund`s complete adjuvant，F(xiàn)CA)、弗氏不完全佐劑(Freund`s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)；油包水型(water-in-oil，W/O)乳劑以及水包油型(oil-in-water，O/W)乳劑等。
刀豆素A(Concanavalin A，Con A)是一種有效的免疫反應(yīng)刺激物，它可以活化T淋巴球并使其產(chǎn)生增殖與活化，而經(jīng)活化的T淋巴球會分泌IL-2以及其它細胞因子進而啟動相關(guān)的免疫反應(yīng)。李玲玟等人從白鳳豆(Canavalia ensifomis)中提取出Con A，并在小白鼠接種癌細胞之時或之后給予連續(xù)口服Con A，結(jié)果有口服Con A的小白鼠身上的癌細胞面積均顯著小于未給予Con A的對照組，因而白鳳豆所含的Con A被推測可活化免疫系統(tǒng)而具有抗癌效果(李玲玟等人(1995)，中華癌醫(yī)學會雜志，1127-34)。
另外，已知β-葡聚糖(β-glucan)可以和白血球上的受體結(jié)合，具有使白血球活化進而調(diào)節(jié)免疫與防衛(wèi)能力(T.Miura，etal.(1997)，Biol.Pharm.Bull.，201103-1107；J.Soltys andM.T.Quinn(1999)，Am.Sci.Microbiol.，67244-252)，可增加巨噬細胞的吞噬作用，以及在感染狀態(tài)下也可以抑制炎癥早期細胞素的生成而降低疾病造成的死亡率(J.W.Hadden(1993)，Immunol.Today，14275-280；Roitt，I.M.，J.Brostoff，and D.K.Male.1998.Immunology，5th ed.，Mosby Company，Tavistock Square，London，UK)。由于β-葡聚糖可以有效刺激非專一性免疫反應(yīng)，它已被廣泛使用于佐劑、抗腫瘤、抗感染等方面(Hadden(1993)，如上述；Roitt et al.(1998)，如上述；I.Suzuki et al.(1990)，Int.J.Immunopharmacol.，12675-684)。
因此，基于佐劑確實具有增強抗原的免疫原性的效用，若一抗原在免疫后所激發(fā)的中和抗體效價不夠高，但在攻擊后能產(chǎn)生出高效價的中和抗體，這時即可以考慮使用佐劑來加強該抗原的免疫原性。
基于以上所述，提供具有生產(chǎn)時間短、生產(chǎn)成本低廉、無毒性、高安全性以及高免疫保護效力等特點的豬用疫苗以及用以監(jiān)控PAR的快速檢測工具，由此解決肉畜市場以及養(yǎng)豬工業(yè)上長久以來因PAR所蒙受的重大損失，存在有一迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
于是，在第一個方面，本發(fā)明提供一種針對進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用疫苗，其包含
(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基。
在第二個方面，本發(fā)明提供一種能防治至少進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用多價疫苗，其包含(i)與進行性萎縮性鼻炎有關(guān)的抗原組份(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素(PMT)蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基；以及(ii)至少一種與其它的動物疾病有關(guān)聯(lián)的病原性抗原或其抗原表位。


下面結(jié)合附圖及實施例來對本發(fā)明進行詳細說明，所以本發(fā)明在上述以及其它目的與特征，可通過參照下文的描述、隨附的權(quán)利要求書和附圖而變得更為明顯，附圖中圖1與2分別顯示9個多殺巴斯德氏菌分離株的PMT蛋白質(zhì)電泳及Western印跡分析結(jié)果，其中道M標記；道1ATCC 12945；道2PMA 33；道3PMA 2；道4PMA10；道5PMD 20；道6ATCC 7707；道7PMD 21；道8PMD 48；以及道9NCTC 12178；圖3與圖4分別顯示使用HhaI來消化多殺巴斯德氏菌分離株的染色體DNA所進行的限制片段長度多態(tài)性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)結(jié)果以及多殺巴斯德氏菌分離株的PMT編碼基因的Southern雜交反應(yīng)結(jié)果，其中道M標記；道1ATCC 12945；道2PMA 33；道3PMA 2；道4PMA 10；道5PMD 27；道6PMD 20；道7PMD 48；以及道8NCTC 12178；圖5顯示通過PCR方法使用不同的引物來檢測PMT編碼基因的結(jié)果，其中道M標記；道1J1J2(1227bp)；道2A3B2(3869bp)；道3A3B1(1588bp)；道4A2B3(1949bp)；道5A4B2(1768bp)；道6A1B4(2135bp)；以及道7A1B1(1587bp)；圖6顯示于42℃下使用引物A3B2來鑒定多殺巴斯德氏菌分離株的PMT編碼基因的結(jié)果，其中道M標記；道1PMA 33；道2ATCC 12945；道3PMA 2；道4PMA 10；道5PMD 27；道6PMD 20；道7ATCC 7707；道8PMD 21；道9PMD 48；以及道10NCTC 12178；圖7顯示使用所設(shè)計的J1J2引物以1％瓊脂糖凝膠電泳來進行多殺巴斯德氏菌分離株的PMT編碼基因PCR分析的結(jié)果，其中道M1kb標記；道1PMA 33；道2PMA 59；道3PMA 2；道4PMA 10；道5PMD 20；道6PMD 27；道7PMD 48；以及道8PMD 21；圖8顯示使用J-20隨機引物來進行多殺巴斯德氏菌分離株的隨機擴增的多態(tài)性DNA(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)分析的結(jié)果，其中道M1kb標記；道1PMA 33；道2PMA 59；道3PMA 2；道4PMA 10；道5PMD 20；道6PMD 27；道7PMD 48；以及道8PMD 21；圖9顯示使用DNASTAR的MegAlign program來進行臺灣本土的多殺巴斯德氏菌分離株與D型多殺巴斯德氏菌(NCTC 12178)的PMT編碼基因的核苷酸序列比較；圖10示意說明依據(jù)本發(fā)明所克隆出的編碼PMT亞基的DNA片段分別對應(yīng)于PMT編碼基因的所在位置；圖11顯示攜帶有依據(jù)本發(fā)明所克隆出的編碼PMT亞基的DNA片段的線形重組型載體的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中道1NEB1kb標記；道2對照組載體(空載體pET32a，5900bp)；道3重組型載體Tox1(7326bp)；道4重組型載體Tox2(7408bp)；道5重組型載體Tox7(6790bp)；道6對照組載體(空載體pET25b，5547bp)；以及道7重組型載體Tox6(9356bp)；圖12顯示由本發(fā)明所得到的重組型載體克隆株的表達而收獲的重組型PMT亞基的SDS-PAGE結(jié)果，其中道1BIO-RAD廣范圍標記(BIO-RAD Broad Range Standards)；道2Tox1重組型蛋白質(zhì)(86kDa)；道3Tox2重組型蛋白質(zhì)(86kDa)；道4Tox7重組型蛋白質(zhì)(55.4kDa)；道5Tox6重組型蛋白(158kDa)；道6天然PMT蛋白(155kDa)；以及道7pET32b/BL21(DE3)；圖13與圖14分別顯示由本發(fā)明所得到的重組型載體克隆株的表達而收獲的重組型PMT亞基在使用抗-PMT單克隆抗體7-10A與多克隆抗體下的Western印跡分析結(jié)果，其中道1BIO-RAD廣范圍標記；道2Tox1重組型蛋白質(zhì)(86kDa)；道3Tox2重組型蛋白質(zhì)(86kDa)；道4Tox7重組型蛋白質(zhì)(55.4kDa)；道5Tox6重組型蛋白質(zhì)(158kDa)；道6天然PMT蛋白質(zhì)(155kDa)；以及道7pET32b/BL21(DE3)；圖15-17顯示由本發(fā)明所得到的重組型載體克隆株的表達而收獲的重組型PMT亞基對于非洲綠猴腎纖維細胞(Verocell)的細胞毒性，其中圖15Vero細胞的正常細胞型態(tài)；圖16使用天然PMT蛋白質(zhì)的最小毒性劑量(140ng/ml)來處理Vero細胞后造成結(jié)節(jié)細胞病變；以及圖17以Tox1重組型蛋白質(zhì)(1mg/ml)來處理Vero細胞，并沒有產(chǎn)生結(jié)節(jié)細胞病變；圖18是養(yǎng)于一沒有PAR病例的一貫作業(yè)豬場內(nèi)的母豬，于懷孕第85天時以rsPMT細菌疫苗予以免疫，并于分娩時采集其初乳及血清來進行中和效價分析的結(jié)果；圖19是養(yǎng)于一有PAR病例的一貫作業(yè)豬場內(nèi)的母豬，于懷孕第85天時以rsPMT細菌疫苗予以免疫，并于分娩時所采集的血清與初乳的中和抗體效價分析結(jié)果；圖20是圖19中所檢測的母豬所產(chǎn)下的仔豬分別于4與6周大時，以以rsPMT細菌疫苗予以免疫，并于疫苗接種的12與18個月之后，于宰殺后取豬頭來進行鼻甲介骨肉眼檢查的結(jié)果；圖21顯示兔子在以本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗來免疫之前與之后的血清PMT中和抗體變化情形，其中橫軸為免疫次數(shù)，而縱軸為中和抗體效價(Log2)；圖22顯示兔子在以本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗來免疫之前與之后的血清PR中和抗體變化情形，其中橫軸為免疫次數(shù)，而縱軸為中和抗體效價(Log2)；
圖23顯示懷孕母豬在以本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗來免疫之前與之后的血清PMT中和抗體變化情形，其中橫軸為抗體效價，而縱軸為母豬頭數(shù)；以及圖24顯示懷孕母豬在以本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗來免疫之前與之后的血清PR中和抗體變化情形，其中橫軸為抗體效價，而縱軸為母豬頭數(shù)。
具體實施例方式
在臨床上，由PAR病豬鼻腔分離病原時，除了多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型菌株以外，常常會分離到許多A型菌株，而這些A型菌株常造成鑒別上與判定是否也是PMT產(chǎn)毒株的困擾。
在多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型及D型菌株的傳統(tǒng)鑒別方法中，若單以血清學進行凝集試驗時，在A型及D型菌株之間常會有抗原交叉反應(yīng)而無法正確區(qū)別，若是僅利用透明質(zhì)酸酶抑制試驗進行鑒定A型菌株時，雖可觀察到某些程度上的抑制結(jié)果但是不易區(qū)分。而若進行吖啶黃(acriflavine)凝集試驗來鑒定D型菌株時，又常會因細菌濃度不同或細菌太老等因素而有假陽性或假陰性的情形，因此，若只單純應(yīng)用生化鑒定結(jié)果常會導致在判讀上的困擾，特別是因操作或判讀人員不同時更常導致不同判定結(jié)果。此外，在豬鼻道間也常分離到許多非產(chǎn)毒株或其它呼吸道常在細菌，因而增加許多診斷分析上的困擾。
因此，申請人于本發(fā)明中嘗試利用RFLP及RAPD-PCR方法來建立多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型與D型菌株的不同基因型別，由此于未來能利用所建立的分子差異性比對來快速鑒定多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的菌株類型。
申請人在RFLP實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，當以HhaI對所提取的多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)染色體DNA進行RFLP分析后，可利用所呈現(xiàn)的主要7kb的切割片段來區(qū)分D型與A型菌株。此外，當以DNA探針進行雜交反應(yīng)，更發(fā)現(xiàn)所有PMT產(chǎn)毒株經(jīng)HhaI作用后在2kb及9kb處也會呈現(xiàn)特異性的切割片段，而可由此來進一步區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株。而在分析PMT基因上的HhaI切割位時，發(fā)現(xiàn)PMT基因上存有3個HhaI的切割位(分別位在2219、2393、4331殘基處)，所以PMT基因經(jīng)切割后應(yīng)會有174bp、1938bp及另一未知長度的片段。申請人另由Southern雜交反應(yīng)結(jié)果得知，該未知長度的片段大小為9kb，因此，申請人推論在PMT基因的上游約7kb處應(yīng)有另一HhaI切割位，故會形成約9kb與2kb的基因反應(yīng)片段。
為更客觀防止基因組DNA(genomic DNA)常因提取純度不一而有酶切割不全的困擾，進而影響到RFLP的呈現(xiàn)與判讀結(jié)果，申請人另外于實驗中再應(yīng)用8-10聚體的隨機引物(random primers)來進行RAPD篩檢，實驗并利用相同提取的DNA同時以RFLP進行雙重驗證，由此更客觀評估D型與A型菌株的區(qū)分比對的準確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以隨機引物J-20(aagcggcctc)(SEQ ID NO13)來進行RAPD后，D型菌株可于2.8kb大小處產(chǎn)生一段與A型菌株具明顯鑒別性的擴增產(chǎn)物(amplicon)。
綜合以上分子鑒別結(jié)果，當從豬鼻腔分離出疑似多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)菌落后，可應(yīng)用此快速又簡便的方法取代傳統(tǒng)鑒別A型及D型的生化試驗，且更可利用J-20隨機引物進行RAPD-PCR來再次確定其血清型別。
申請人又嘗試確認，多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)不管是A型或D型菌株，其會是產(chǎn)毒株是否取決有無具有一PMT毒素基因。于是，申請人針對本身實驗室所分離鑒別出的多株包含多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)D型及A型的野外分離株以及標準菌株，利用小白鼠致死試驗、天竺鼠皮膚壞死試驗、Vero細胞毒性試驗、PMT毒素蛋白質(zhì)電泳分析與Western印跡法分析，來進行這些菌株是否會產(chǎn)生毒素以及是否有PMT基因存在的重復交叉比對試驗。
結(jié)果顯示，在所選擇10株受測菌株中，共有3株菌株(PMA 2、PMD 20及PMD 21)與傳統(tǒng)測試結(jié)果不符合。關(guān)于PMD 20，其在小白鼠接種未直接導致小白鼠死亡，但在天竺鼠皮膚壞死性試驗中所造成的紅腫病變已超出陽性的判定標準，故應(yīng)予以判定為D型產(chǎn)毒株；但是，若經(jīng)由Vero細胞毒性試驗、蛋白質(zhì)電泳分析、Western印跡法分析、RFLP及PCR檢測PMT基因的結(jié)果，它應(yīng)被判定為非產(chǎn)毒株。
另外，PMA 2及PMD 21原本在小白鼠致死性試驗以及天竺鼠皮膚壞死性試驗中皆無法造成死亡或明顯病變，故以往被歸納為非產(chǎn)毒株，但若以Vero細胞毒性試驗、蛋白質(zhì)電泳分析、Western印跡法分析、RFLP及PCR檢測PMT基因的結(jié)果，則應(yīng)判定為產(chǎn)毒株。
由上述結(jié)果可知，若單純利用傳統(tǒng)小白鼠致死性試驗以及天竺鼠皮膚壞死性試驗鑒定產(chǎn)毒株，則很可能由于人為操作上的疏失或敏感性不夠等原因，而造成假陰性或假陽性的結(jié)果。相對地，若利用Vero細胞毒性試驗、PMT毒素蛋白質(zhì)電泳分析以及利用PCR來檢測PMT基因，所得結(jié)果皆能精確地相互符合，且皆具高專一性。但若以操作簡便及快速診斷而言，則應(yīng)以利用PCR來直接檢測PMT基因最為實用，此法可于分離到疑似菌落后數(shù)小時內(nèi)即得知初步檢驗結(jié)果，并能正確判定該菌株是否具有PMT基因。
為更明了非產(chǎn)毒株無法制造PMT毒素的原因，除直接不具有毒素基因外，抑或是由于其基因有調(diào)控因子在控制其基因的表達，申請人根據(jù)Petersen所發(fā)表的PMT基因(S.K.Petersen(1990)，如前述)而設(shè)計出多組專一性引物(參見下面實施例1中的表1)，以PCR的方法來進行毒素基因的擴增檢測，結(jié)果D型與A型產(chǎn)毒株皆可擴增出預期大小的PCR產(chǎn)物，而非產(chǎn)毒株即使降低引物的粘合溫度至40℃，也無預期大小的PCR擴增產(chǎn)物生成。
為驗證非產(chǎn)毒株是否仍具有部份PMT毒素基因的可能性，申請人又以完整的PMT基因作為模板，再以Hexamers的隨機引物來制造同位素標定的探針，并利用它們來進行Southern雜交反應(yīng)，由此檢測非產(chǎn)毒株是否具有部分的毒素基因存在。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有產(chǎn)毒株有雜交反應(yīng)訊號產(chǎn)生，而在Vero細胞中毫無細胞病變的非產(chǎn)毒株則完全無雜交反應(yīng)。
綜合以上結(jié)果驗證得知，不論D型與A型產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的主要差異應(yīng)在于PMT基因的有無，且只有多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)產(chǎn)毒株才具有PMT基因并且會導致PAR的臨床病征，而D型與A型的非產(chǎn)毒株則完全不具有完整或部分的PMT基因也無法產(chǎn)生PMT毒素，此一結(jié)果排除了非產(chǎn)毒株是受其它因子的調(diào)控，而使PMT基因不能表達進而無法制造出足量的PMT毒素造成病害。此結(jié)論不同于Kamps等人所提出者(Kamps，AMIE et al.(1990)，J.Clin.Microbiol.，281858-1861)，但與Nagai等人的推論結(jié)果較為一致(S.Nagai et al.(1994)，J.Clin.Microbiol.，321004-1010)。
申請人復利用J1J2引物(參見下面實施例1中的表1)，以PCR反應(yīng)來檢測10株分離自禽類的多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，結(jié)果也同時證實禽類來源的多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)A型菌株皆完全不具有PMT基因。
為進一步探討多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型與A型產(chǎn)毒株的PMT基因的同源相似性，申請人再選取D型及A型產(chǎn)毒株各三株，以PCR產(chǎn)物進行自動測序分析，并利用已發(fā)表的D型PMT基因序列進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在被測序出的4206核苷酸殘基(由114到4319核苷酸殘基)中，在臺灣本土所分離的D型及A型產(chǎn)毒株的PMT基因序列100％完全相同，且與Laxs等人(AJ Lax et al.(1990)，J.Gen.Microbiol.，13681-87)以及Buys等人(WE Buys et al.(1990)，Nucleic Acids Res.，182815-2816)在國外不同區(qū)域所分離的菌株的PMT基因序列也完全相同。再經(jīng)與ATCC標準產(chǎn)毒株(NCTC 12178)的PMT基因序列(SEQ ID NO1)比較后發(fā)現(xiàn)也僅有一個氨基酸殘基的改變。由此可知，PMT基因是一個十分安定的基因，且不論是分離自臺灣本土或其它國家，多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)D型或A型產(chǎn)毒株的PMT基因序列幾乎完全相同，顯示沒有任何重組或基因變異的情形發(fā)生。
由此推斷，實驗上所合成的對PMT基因具專一性的各組引物，若被應(yīng)用在PCR以供檢測PMT基因的專一性(specificity)及再現(xiàn)性(reproducibility)上，應(yīng)無分離株血清型別及地域差異性的疑慮。
PMT的分泌量非常微量，約只占多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的總細菌蛋白質(zhì)的1％，故傳統(tǒng)疫苗需培養(yǎng)極大量的細菌才能提取足夠濃度的PMT以制成具保護效力的類毒素疫苗。目前對于PAR的防治雖已有商品化疫苗上市，但大多由國外進口，且對PAR的防治只有基本的保護效果，更因價格高昂而仍無法普及使用。
于是，本發(fā)明提供一種針對進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用疫苗，其包含(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗是供用于防治豬的進行性萎縮性鼻炎。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT蛋白質(zhì)。
在另一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT蛋白質(zhì)。在一更優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD 48的PMT蛋白質(zhì)。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是合成產(chǎn)物，它們可根據(jù)PMT的已知氨基酸序列(例如，序列表中的SEQ ID NO2所示者)而通過，例如氨基酸序列合成儀，來予以分別地生成。
在另一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的三種多肽組份是重組型產(chǎn)物。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的多肽組份(a)為一第一DNA片段所編碼，該第一DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板(template)并以下面正向引物(forward primer)A1與反向引物(reverse primer)B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶BamHI與HindIII切割后所形成的一個1456bpBamHI-HindIII片段所具有的核苷酸序列正向引物A15′-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO3)反向引物B25′-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ IDNO10)。
在一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT編碼基因。
在另一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT編碼基因。在一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。在另一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD 48的PMT編碼基因(參見圖9)。
在一優(yōu)選實施方案中，編碼該多肽組份(a)的該第一DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第一重組型載體。在一更優(yōu)選實施方案中，該第一重組型載體是重組型載體Tox1。
在一優(yōu)選實施方案中，該第一重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的該多肽組份(b)為一第二DNA片段所編碼，該第二DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以如上所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII切割后所形成的一個1502bp HindIII-HindIII片段所具有的核苷酸序列。
在一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT編碼基因。
在另一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT編碼基因。在一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。在另一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD48的PMT編碼基因(參見圖9)。
在一優(yōu)選實施方案中，編碼該多肽組份(b)的該第二DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第二重組型載體。在一更優(yōu)選實施方案中，該第二重組型載體是重組型載體Tox2。
在一優(yōu)選實施方案中，該第二重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗當中所包含的該多肽組份(c)為一第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以上所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII與NheI切割后所形成的一個883bp HindIII-NheI片段所具有的核苷酸序列。
在一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT編碼基因。
在另一優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT編碼基因。在一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。在另一更優(yōu)選實施方案中，該PMT編碼基因是多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD48的PMT編碼基因(參見圖9)。
在一優(yōu)選實施方案中，編碼該多肽組份(c)的該第三DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第二重組型載體。在一更優(yōu)選實施方案中，該第二重組型載體是重組型載體Tox7。
在一優(yōu)選實施方案中，該第三重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(c)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗進一步包含下列的至少一者PMT類毒素、A型多殺巴斯德氏菌細胞、D型多殺巴斯德氏菌細胞以及支氣管炎博德特氏菌細胞。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用疫苗進一步包含一選自于下列一組中的佐劑弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁膠、油質(zhì)佐劑(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳劑、水包油型(O/W)乳劑、刀豆素A(ConA)、β-葡聚糖，以及它們的組合。
除非另有指明，一核酸序列除了于本文中所顯示的特測序列外，也涵蓋其互補序列(complementary sequences)以及保守性類似物(conservative analogs)，例如具有簡并性密碼子取代(degenerative codon substitutions)的同源性序列(homologous sequences)。特別地，簡并性密碼子取代可以經(jīng)由，例如，在一核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換以其它的核苷酸殘基而被產(chǎn)生。
如本文中所用的，“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”等術(shù)語可被相互交換使用，且意指一種由氨基酸殘基所構(gòu)成的聚合物，其中一或多個氨基酸殘基是天然存在的氨基酸(naturallyoccurring amino acids)或人造化學仿效物。
如本文中所用的，“細胞”、“宿主細胞(host cell)”、“轉(zhuǎn)化宿主細胞(transformed host cell)”與“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”等術(shù)語可被互換使用，而且不僅指特定的個體細胞(individual cells)還包括繼代培養(yǎng)的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代細胞可能在后續(xù)世代中因為突變作用或環(huán)境影響而發(fā)生特定的遺傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能與母細胞并不相一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術(shù)語的范疇內(nèi)。
適用于進行DNA重組技術(shù)的宿主細胞的適當培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件，在生物技術(shù)領(lǐng)域中已被詳知。例如，可將宿主細胞培養(yǎng)在本領(lǐng)域中所慣用的發(fā)酵生物反應(yīng)儀、搖動燒瓶、試管、微滴盤與平淺培養(yǎng)皿中，且該培養(yǎng)可在適合于重組型宿主細胞生長的溫度、pH值及氧含量下進行。
如本文中所用的，“重組型載體”此術(shù)語意指任一種重組型表達系統(tǒng)，其可在任一勝任的宿主細胞(competent hostcell)內(nèi)組成性地(constitutively)或誘導性地(inducibly)表達依據(jù)本發(fā)明的該第一DNA片段、該第二DNA片段或該第三DNA片段。該重組型載體可為一線性或環(huán)形表達系統(tǒng)，且涵蓋保持游離基因形式或是被整合至宿主細胞的基因組內(nèi)的表達系統(tǒng)。該重組型表達系統(tǒng)可具有或不具有自我復制的能力，它可能只會驅(qū)使宿主細胞的瞬時表達。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“轉(zhuǎn)化(transformation)”可與術(shù)語“轉(zhuǎn)染(transfection)”交替地使用，并且泛指將一核酸分子被引進一選定的宿主細胞內(nèi)的方式。依據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構(gòu)物或一重組型載體)可通過多種技術(shù)而被引入至一選定的宿主細胞內(nèi)，例如磷酸鈣或氯化鈣介導的轉(zhuǎn)染作用(transfection)、電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞擊法(particle bombardment)、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染作用(liposome-mediated transfection)、利用細菌噬菌體的轉(zhuǎn)染作用或其它方法。
另外，現(xiàn)今有關(guān)動物疫苗的制造，相關(guān)研究人員也有嘗試開發(fā)能有效防治至少一種標的疾病的多價疫苗。以豬常見的疾病而言，除了進行性萎縮性鼻炎(PAR)以外，尚有假性狂犬病、豬口蹄疫(porcine foot-and-mouth disease)等等。
于是，申請人于本發(fā)明中也提供一種能防治至少進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)的動物用多價疫苗，其包含(i)與進行性萎縮性鼻炎有關(guān)的抗原組份(a)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素(Pasteurella multocidatoxin，PMT)蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列是大體上對應(yīng)于PMT蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基；以及(ii)至少一種與其它的動物疾病有關(guān)聯(lián)的病原性抗原或其抗原表位。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用多價疫苗所包含的組份(i)(a)、(i)(b)與(i)(c)的特征是如前面就多肽組份(a)、(b)與(c)所描述的。
在一優(yōu)選實施方案中，該動物用多價疫苗所包含的組份(ii)是滅活的假性狂犬病gE缺損病毒(inactivatedpseudorabies gE defective virus)，以供防治假性狂犬病。
本發(fā)明將就下面實施例來作進一步說明，但應(yīng)了解的是，這些實施例僅為例示說明用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實施上的限制。
實施例實施例1.A型與D型多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的分子級鑒定以及PMT編碼基因的核苷酸序列比對I、材料與方法A、菌株來源申請人以臺灣中部的臺中市、臺中縣、彰化縣與南投縣這四個縣市的監(jiān)控豬場內(nèi)所淘汰的保育豬為對象，進行豬萎縮性鼻炎疫情調(diào)查、采樣與病理學檢查，在經(jīng)生化鑒定為多殺巴斯德氏菌的分離株中，利用Vero細胞的CPE效應(yīng)試驗而選取出D型產(chǎn)毒株(PMD 14、PMD 21、PMD 48)、D型非產(chǎn)毒株(PMD 20、PMD 27)、A型產(chǎn)毒株(PMA 2、PMA 10、PMA 23)以及A型非產(chǎn)毒株(PMA 33、PMA 59)共10個分離株，并另外采用標準參考菌株(D型產(chǎn)毒株NCTC 12178為購自食品工業(yè)發(fā)展研究所菌種中心，而A型非產(chǎn)毒株ATCC12945以及D型非產(chǎn)毒株ATCC 7707是購自于美國菌種保存中心)來進行多殺巴斯德氏菌的分子鑒別。
B、PMT蛋白質(zhì)的制備將試驗菌株以1×107菌落數(shù)培養(yǎng)于含7％去纖維蛋白原綿羊血的血液培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24小時后，加入2mLPBS(pH7.2)以將細菌刮洗下來。另一方式是，于37℃下將細菌培養(yǎng)于HI肉湯培養(yǎng)基內(nèi)歷時26小時，之后以離心來收集菌塊，并以十分之一培養(yǎng)體積的PBS(pH7.2)予以懸浮。
以超聲波(Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，輸出功率20％，作用30分鐘)將細菌擊碎后，以10,000xg進行高速離心歷時30分鐘。取上清液，以孔徑為0.45μm及0.22μm的過濾膜來過濾，而經(jīng)兩次過濾的過濾液即為粗制的多殺巴斯德氏菌毒素(crude PMT)。以Bio-Rad protein assay來測定蛋白質(zhì)濃度，并分裝保存于-20℃冰箱內(nèi)備用。
C、天竺鼠皮膚試驗及小鼠致死試驗(MLT)取體重約400g成熟的天竺鼠，并參考de Jong等人的方法(de Jong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocida isolates.IPVS 6thCongress，211，1980)來進行天竺鼠皮膚試驗。先將天竺鼠背部兩側(cè)的毛剔除，再取0.2mL的上述制備的粗制PMT來進行皮內(nèi)注射，于注射后48小時觀察皮膚病變的大小及程度，病變區(qū)域的直徑大于1厘米者判定為陽性。
關(guān)于BALB/c小鼠致死性試驗，取0.5mL的上述制備的粗制PMT來進行腹腔注射，每組6只，于注射后10天死亡數(shù)多于3只者即判定為陽性。
D、PMT蛋白質(zhì)對于非洲綠猿腎臟細胞株(Vero cell)的細胞致病效應(yīng)(CPE)與最小毒性劑量(minimum toxin dose；MTD)的測定Vero細胞的CPE測定方法主要是參考de Jong等人的方法(de Jong MF，Oei HL，Terenburg JG.AR-pathogenicity-tests for Pasteurella multocida isolates.IPVS 6th Congress，211，1980)并稍做修改后進行。先將Vero細胞濃度調(diào)成2×105細胞/mL，以每孔100μL的數(shù)量予以加入至96孔組織培養(yǎng)盤中，并于被設(shè)定為37℃并含有5％CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24～48小時，待有細胞單層(monolayerof cells)形成后，移除培養(yǎng)液并予以加入以不含胎牛血清的杜貝可氏改良的依格氏培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eaglemedium，DMEM)，繼而將經(jīng)2倍連續(xù)稀釋的上述制備的粗制PMT分別以100μL的數(shù)量置入各孔內(nèi)，每個稀釋倍數(shù)的粗制PMT各進行四個重復試驗，并以只含2％胎牛血清的DMEM作為對照組。培養(yǎng)細胞歷時5天并于每日觀察細胞的形態(tài)變化，將最高稀釋倍數(shù)但仍可造成所有四孔細胞皆呈現(xiàn)病變的毒素濃度定為最小毒性劑量(minimal toxicity dose，MTD)。
E、PMT蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析以及Western印跡分析制備10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)，將1mg/mL的上述制備的粗制PMT加入等體積的2X樣品緩沖液(sample buffer)，所形成的混合物在煮沸歷時5分鐘后被裝填至備妥的凝膠上，在以80伏特進行電泳后，膠以固定液(45％甲醇、10％乙酸、45％去離子水)予以固定歷時10分鐘，繼而以含0.1％考馬斯亮藍R-250(Coomassie brilliantblue R-250)的染色液進行染色。
另外進行相同的凝膠電泳處理但不予染色，所得到的電泳膠片利用轉(zhuǎn)漬半干式電泳槽(TRANS-BLOT SD，semi-drytransfer cell；Bio-Rad)，以120mA予以轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)上。以5％脫脂乳(skimmed milk)進行封阻處理(blocking)歷時30分鐘后，加入抗-PMT單克隆抗體1B2A3(得自ATCC)，并于室溫下作用1小時，繼而以PBST(0.5％Tween 20 in PBS)清洗，再加入結(jié)合有堿性磷酸酶的第二抗體(secondary antibody conjugatedwith alkaline phosphatase)，最后加入底物(NBT/BCIP，Tris緩沖液)來進行呈色反應(yīng)。
F、染色體DNA的提取及濃度測定此實驗是參照Short protocols in molecular biology II的方法(Moore DD.Preparation and analysis of DNA.InAusubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struhl K，ed.Short protocols in molecular biologyII.John Wiley & Sons，New York，2.10-2.11，1992)來進行。
將各實驗菌株培養(yǎng)于5mL BHI肉湯培養(yǎng)基(BHI broth)中，于37℃下培養(yǎng)歷時14～18小時后，于4℃下以5,000xg進行離心歷時5分鐘。在去除上清液后，予以加入100μL TE緩沖液(Tris 10mM；EDTA 1mM，pH8.0)以及10μL溶菌酶(lysozyme)(200mg/mL)，令混合物混合均勻并于37℃下作用30分鐘，然后加入315μL TEN(Tris 10mM；EDTA 1mM，pH8.0；NaCl 100mM)、50μL 10％SDS、25μL RNase A(10mg/mL)并于56℃下作用歷時1小時，之后再加入5μL蛋白酶K(proteinase K)(10mg/mL)并于56℃下作用歷時2小時，然后以酚/氯仿(phenol/chloroform)以及氯仿進行提取，以含0.3M醋酸鈉的絕對乙醇來沉淀DNA，以100μL滅菌水來溶解被沉淀的DNA，并以吸光值A(chǔ)260/280來測定DNA的濃度與純度。
G、限制片段長度多態(tài)性分析(Restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)
取各為10μg的DNA樣品，分別加入不同的限制酶(BamHI、EcoRI、HindIII、ClaI及HhaI)并于37℃下作用歷時4小時。以1％瓊脂糖凝膠(agarose gel)進行電泳，經(jīng)溴化乙啶(ethidium bromide)染色后，置于波長312nm的紫外光顯像器(VILBER LOURMAT)上觀察并照相。
H、PMT編碼基因的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)Petersen所發(fā)表的多殺巴斯德氏菌(P.multocida)NCTC12178分離株的PMT編碼基因具有序列表中的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列(參見Petersen S K.Mol Microbiol 4821-830，1990；NCBI accesson no.X51512)。在此實驗中，根據(jù)該核苷酸序列設(shè)計出如表1中所示的引物來進行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)條件如下在100μL反應(yīng)溶液中含有模板DNA0.2ug、2UTaq聚合酶、1X反應(yīng)緩沖液、2.5mM MgCl2、0.25mM dNTPs以及20pmole引物，將反應(yīng)溶液置入聚合酶鏈反應(yīng)儀(Omnigene Temperature Cycler；Hybaid)中，反應(yīng)條件設(shè)定為95℃40秒、55℃30秒、72℃1分鐘，進行30次循環(huán)；在反應(yīng)結(jié)束后，以1％瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳膠片以溴化乙啶染色觀察并照相分析。
表1.被設(shè)計用來進行PMT編碼基因的PCR擴增反應(yīng)的引物

I、Southern雜交反應(yīng)(Southern hybridization)雜交反應(yīng)用的探針是以PCR合成完整的PMT編碼基因開放閱讀框(ORF，213bp-4076bp)的片段作為模板，利用Hexamers的隨機引物(random primers)以及Klenow片段(Klenow fragment)來進行32P-DNA探針的合成。雜交反應(yīng)簡述如下將以限制酶切割的DNA電泳后，膠片先以0.5NNaCl及0.5N Tris-HCl各處理15分鐘，再以轉(zhuǎn)漬緩沖液(blotting buffer，10XSSC)將DNA轉(zhuǎn)漬至NC膜上，并以紫外線進行交叉連結(jié)反應(yīng)后陰干。在NC膜經(jīng)預雜交處理(pre-hybridization treatment)后予以加入32P-DNA探針，并于42℃下進行雜交反應(yīng)至隔夜，之后以水清洗多次，再以X光底片壓片顯影。
J、隨機擴增的多態(tài)性DNA分析(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)
利用OPERON公司合成的10聚體引物(10-mer primers)來進行聚合酶鏈反應(yīng)，操作方式如上述G項中所述，但是將引物改用一隨機引物10pmol、反應(yīng)總體積改為50μL以及將反應(yīng)條件改為在95℃ 40秒、42℃ 30秒、72℃ 1分鐘的狀態(tài)下進行30次循環(huán)。
K、PMT基因自動化測序分析(Automatic sequencing)測序用DNA模板的制作選取D型產(chǎn)毒株及A型產(chǎn)毒株各3株(PMA 2、PMA 10、PMA 23、PMD 14、PMD 21、PMD 48)來進行PMT編碼基因測序。以所設(shè)計的引物來進行PCR反應(yīng)以制備測序分析用的DNA模板。PCR反應(yīng)條件如前述，惟獨反應(yīng)條件改為進行25次循環(huán)。被收集的PCR產(chǎn)物以PEG-8,000進行DNA沉淀，以100μL滅菌水來溶解被沉淀的DNA，并以吸光值A(chǔ)260測定DNA的濃度。
測序PCR反應(yīng)及自動化測序分析是依照ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Core Kit(PERKIN ELMER)的操作手冊來進行實驗。取5X測序緩沖液(sequencing buffer)160μL、dNTP mix 40μL、各20μL的dNTP染料終止劑(dyeterminator)(A--綠色、T--紅色、C--藍色、G--黑色)、AmpliTaqDNA聚合酶以及F.S 40μL來混合配制成反應(yīng)預混物(reaction premix)。取模板DNA(經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物)90ng、適當?shù)臏y序用引物(參見表1)10pmole以及8μL反應(yīng)預混物，最后加入滅菌水至總體積為20μL。以GeneAmp PCRSystem 9600 DNA Thermal Cycler(Applied Biosystems Prims)來進行PCR反應(yīng)，于96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃4分鐘的情況下進行25次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后立刻將所形成的產(chǎn)物置于冰上，并予以加入2μL 3M CH3COONa及50μL 95％乙醇，靜置于冰上歷時10分鐘以沉淀DNA，再于室溫下以13,500rpm來離心歷時15分鐘，將乙醇吸干凈，再用70％乙醇及95％乙醇各潤濕一次，最后于室溫中倒置待乙醇蒸干。以2.2μL EDTA/甲酰胺(formamide)來溶解沉淀丸(pellet)，于90℃加熱2分鐘后置于冰上備用。配制4％TBE-聚丙烯酰胺凝膠，并裝填以測序用的反應(yīng)產(chǎn)物，在2,500V、40mA、40W下進行電泳，使用自動化測序儀(automaticsequencer，Applied Biosystems 373 DNA sequencer，STRETCH)，并以鐳射感應(yīng)器掃瞄，以及通過ABI PRISMFactuare software來進行資料分析，而得到自動記錄的原始數(shù)據(jù)(raw data)，再將原始數(shù)據(jù)輸入MacVector software以進行分析比對。
II、結(jié)果A、Vero細胞的CPE試驗、天竺鼠皮膚壞死性試驗以及小鼠致死試驗的比較各試驗菌株對Vero細胞的最小毒性劑量(MTD)被顯示于表2，其中ATCC 707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33即使加入1mg/mL的粗制PMT，也無法造成結(jié)節(jié)樣的CPE，因此判定NCTC 12178、PMD 48、PMD 21、PMA2、PMA 10及PMA 59為產(chǎn)毒株，而ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33為非產(chǎn)毒株。
表2.A型與D型多殺巴斯德氏菌的產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株之間的小鼠致死試驗(MLT)、天竺鼠皮膚壞死性試驗、Vero細胞MTD試驗以及用于PMT編碼基因的檢測的Western印跡分析與PCR結(jié)果的比較

“+”陽性反應(yīng)；“-”陰性反應(yīng)；“ND”未測定；“H”出血(hemorrhage)。
比較Vero細胞的CPE試驗、天竺鼠皮膚壞死性試驗以及小鼠致死試驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PMD 20、PMA 2及PMD 21的檢驗結(jié)果不一致PMA 2及PMD 21依小鼠致死性試驗及天竺鼠皮膚壞死性試驗結(jié)果應(yīng)判定為非產(chǎn)毒株，而依Vero細胞的CPE驗則判定為產(chǎn)毒株；另外，PMD 20原本判定為產(chǎn)毒株，而依Vero細胞的CPE試驗則判定為非產(chǎn)毒株。
B、蛋白質(zhì)電泳及Western印跡分析參見圖1，NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD 21及PMD 48在146kDa處可看見有明顯的蛋白質(zhì)帶，而ATCC7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33等菌株在146kDa處并無蛋白質(zhì)帶，此結(jié)果與Vero細胞的CPE試驗的結(jié)果相符合。濃縮粗制PMT的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果也相同。另外，以抗-PMT單克隆抗體1B2A3進行西方雜交反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCTC12178、PMD 48、PMD 21、PMA 2及PMA 10在146kDa處的蛋白質(zhì)帶可明顯地被單克隆抗體1B2A3所辨識，而ATCC7707、ATCC 12945、PMD 20、PMA 33等在146kDa處并未出現(xiàn)有可被單克隆抗體1B2A3所辨識的蛋白質(zhì)帶(圖2)。C、染色體DNA酶切割圖譜分析選用BamHI、EcoRI、HindIII、ClaI及HhaI等限制酶來進行染色體DNA酶切割圖譜(圖3)比較時發(fā)現(xiàn)，以使用HhaI進行切割后的電泳圖譜具優(yōu)選區(qū)分性。在HhaI切割后的電泳圖上可見約于5kb以下的酶切割片段大致相同，而在6kb以上即可看到具鑒別性的片段，其中D型多殺巴斯德氏菌(NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)于7kb處較A型的菌株(ATCC 12945、PMA 2、PMA 10及PMA 33)多了一條酶切割片段；此外，D型及A型的產(chǎn)毒株(NCTC 12178、PMD 48、PMA 2及PMA 10)則于9kb處較非產(chǎn)毒株(ATCC12945、PMD 20、PMD 27及PMA 33)多了一條酶切割片段。而在使用BamHI等其它限制酶進行切割時，于電泳圖上則無法看到可明顯具鑒別性的酶切割片段。因此，使用HhaI進行多殺巴斯德氏菌的染色體DNA酶切割后的電泳圖譜可作為區(qū)別A型與D型及產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的依據(jù)。
D、Southern雜交反應(yīng)將以HhaI進行染色體DNA切割進行電泳后，轉(zhuǎn)漬到硝基纖維素膜(NC membrane)上，核酸探針的制作是以標準產(chǎn)毒株NCTC 12178的A3B2 PCR產(chǎn)物[包含整段PMT基因的開放閱讀框(open reading frame)]為模板，以32P標定后制作成32P-DNA探針(probe)，于42℃下進行雜交反應(yīng)。結(jié)果顯示D型及A型的產(chǎn)毒株(NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD48)皆有二個明顯的雜交反應(yīng)帶分別位于2kb及9kb處，而非產(chǎn)毒株(ATCC 12945、PMD 20、PMD 27、PMA 33)則無任何的雜交反應(yīng)(圖4)，這顯示只有產(chǎn)毒株才具有PMT基因。
E、PMT基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)根據(jù)Petersen發(fā)表的多殺巴斯德氏菌(NCTC 12178)PMT編碼基因核苷酸序列(S.K.Petersen(1990)，如前述)而合成的10個引物(表1)分別配對成A1B1、A1B4、A4B2、A2B3、A3B1、A3B2、J1J2等7組來進行PCR，其中A1B1的PCR產(chǎn)物為1587個堿基對(base pairs)、A1B4為2135個堿基對、A4B2為1768個堿基對、A2B3為1949個堿基對、A3B1為1588個堿基對、A3B2為3869個堿基對(包含整段PMT基因的開放閱讀框)、J1J2為1227個堿基對(圖5、圖7)，如下面表3所示表3.PMT的PCR產(chǎn)物大小

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒株NCTC 12178、PMA 2、PMA 10、PMD21及PMD 48在各組均有預期大小的PCR擴增產(chǎn)物被生成，而非產(chǎn)毒株(ATCC 7707、ATCC 12945、PMD 20、PMD 27和PMA 33)即使在引物的粘合溫度被降低至42℃下，也無預期大小的PCR擴增產(chǎn)物被生成(圖6)。
F、隨機擴增的多態(tài)性DNA(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)在利用隨機引物PCR來區(qū)分D型多殺巴斯德氏菌(NCTC 12178、PMD 20、PMD 27及PMD 48)以及A型多殺巴斯德氏菌(ATCC 12945、PMA 2、PMA 10及PMA 33)時，在篩選過大約200個隨機引物后發(fā)現(xiàn)，以J-20(aagcggcctc)(SEQ ID NO13)來進行RAPD-PCR時，各菌株大約在1kb、2kb以及2.5kb處均有近似大小的擴增產(chǎn)物，但是于2.8kb附近，D型菌株可產(chǎn)生一條與A型菌株具鑒別性的PCR擴增產(chǎn)物電泳帶(圖8)。
G、自動化測序分析將臺灣境內(nèi)分離的D型產(chǎn)毒株及A型產(chǎn)毒株各3株的PMT編碼基因直接以PCR產(chǎn)物進行自動化測序，結(jié)果PMA(多殺巴斯德氏菌A型)共定出4214個核苷酸序列(由核苷酸殘基106到4319，圖9)，而PMD(多殺巴斯德氏菌D型)共定出4206個核苷酸序列(由核苷酸殘基114到4319，圖9)。
就所定出的核苷酸序列，經(jīng)由網(wǎng)路搜尋并與Genbank中Petersen所發(fā)表的多殺巴斯德氏菌(NCTC 12178)的PMT編碼基因核苷酸序列相比較，結(jié)果臺灣本土所分離出的D型產(chǎn)毒株及A型產(chǎn)毒株與NCTC 12178的PMT編碼基因的核苷酸序列大致相同，只有在核苷酸殘基1128-1129處有不同(由cg改變?yōu)間c)，而氨基酸殘基由精氨酸(Arginine)改變?yōu)楸彼?Alanine)，而且PMA 10在核苷酸殘基108處[在起始密碼子(start coden)前的第111個核苷酸殘基]尚多了一個胞嘧啶(cytosine)。
在分析PMT基因上的HhaI切割位時，發(fā)現(xiàn)PMT基因上有3個HhaI的切割位(分別位在2219、2393、4331核苷酸殘基處)，所以PMT基因經(jīng)切割后應(yīng)會出現(xiàn)有174bp、1938bp(2kb處的雜交反應(yīng)帶)及另一未知長度的片段，而由多殺巴斯德氏菌分離株的染色體DNA的Southern雜交反應(yīng)結(jié)果得知該未知長度的片段大小為9kb。由此推論在PMT基因的上游約7kb處應(yīng)該還有另一個HhaI切割位，故會形成約9kb與2kb的基因反應(yīng)片段，這與實驗結(jié)果相符。
于本實施例中，申請人嘗試利用RFLP及RAPD-PCR方法來建立A與D型多殺巴斯德氏菌的不同基因型別的分子級差異性比對，俾供用于未來快速診斷鑒定多殺巴斯德氏菌分離株。而在RFLP實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，當以HhaI對所提取的多殺巴斯德氏菌染色體DNA進行RFLP分析后，可利用所呈現(xiàn)的主要7kb的切割片段來區(qū)分D型與A型菌株，并可利用所呈現(xiàn)的主要9kb的切割片段來區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株。此外，當以DNA探針進雜交反應(yīng)，更發(fā)現(xiàn)所有PMT產(chǎn)毒株經(jīng)HhaI作用后在2kb及9kb處也會呈現(xiàn)專一性的切割片段，也可進一步正確區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株。
為更客觀防止基因組DNA(genomic DNA)常因提取純度不一而有酶切割不全的困擾，進而影響到RFLP的呈現(xiàn)與判讀結(jié)果，于實驗中再應(yīng)用8-10聚體的隨機引物來進行RAPD篩檢，并且相同的DNA提取物同時以RFLP進行雙重驗證，此目的旨在能更客觀地評估區(qū)分D型與A型菌株比對的準確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以隨機引物J-20(aagcggcctc)(SEQ ID NO13)進行RAPD后，D型菌株可于2.8kb大小處產(chǎn)生一段與A型菌株具明顯鑒別性的擴增產(chǎn)物(amplicon)。
綜合以上分子鑒別結(jié)果，當從豬鼻腔分離出疑似多殺巴斯德氏菌菌落后，可應(yīng)用此快速又簡便的方法取代傳統(tǒng)鑒別A型及D型的生化試驗，且更可利用J-20隨機引物來進行RAPD-PCR以再次確定其血清型別。此外，一旦再配合PMT編碼基因的專一性引物(諸如J1J2等)來進行檢測毒素基因的PCR反應(yīng)后，將可同時在極短時間內(nèi)快速鑒別分離菌株的血清型以及是否為PMT的產(chǎn)毒株。而日后若再配合抗-PMT單克隆抗體即可以進一步開發(fā)出ELISA檢測方式，而將可大幅提高診斷精確性與縮短診斷所需的時間，也可做為未來研究多殺巴斯德氏菌上的準確分析方法。
從以上結(jié)果也歸納出在能導致Vero細胞產(chǎn)生特異性細胞病變的分離株中，不論A型或D型的分離株皆具有完整的PMT基因，但不會造成細胞病變的菌株則不具有PMT基因，也不會導致實驗BALB/c小鼠死亡及豬的臨床病征。而A型及D型PMT的基因序列的比較進一步顯示出臺灣本土的這兩種血清型的產(chǎn)毒株所具PMT核酸序列完全相同，而當與Genbank登錄的D型PMT基因相比較也僅出現(xiàn)一個氨基酸的差異，這顯示PMT編碼基因是一穩(wěn)定而不易變異的毒素基因，而于分析過程中所提取的這兩型PMT毒素在細胞與動物實驗上的性狀也相當一致，而且在測試方法上以Vero細胞毒素測定最為敏感，而可做為判定豬中和抗體效價的依據(jù)。
因PMT為單一毒素的細胞作用機制且PMT編碼基因的同源性高，在目前的PAR防治上，養(yǎng)豬業(yè)者可經(jīng)由以PMT的類毒素蛋白來進行免疫而在豬體內(nèi)激發(fā)具良好保護性的中和抗體的生成，并可通過母豬移行抗體而保護小豬在出生2-4周間的易感染期。但實際上，因PMT在自然多殺巴斯德氏菌菌體內(nèi)的產(chǎn)量極低，例如在液態(tài)培養(yǎng)液中PMT約僅占多殺巴斯德氏菌本身所產(chǎn)生的總蛋白量的0.05-0.1％，實不敷成本以制造有效的高濃度類毒素蛋白來供疫苗的制造使用。因此，若能克隆PMT基因并進行大量表達后，將可作為日后研究PMT的致病機轉(zhuǎn)與進行亞基疫苗防治上的應(yīng)用。
于下面實施例中，本發(fā)明使用所鑒定出的D型多殺巴斯德氏菌分離株P(guān)MD-48來進行編碼PMT亞基的DNA克隆株的建立以及各項試驗與檢測。
實施例2.編碼PMT亞基的DNA克隆株的建立A、PMT編碼基因的克隆PMT編碼基因的PCR反應(yīng)依照實施例1中的I、材料與方法中的F項、染色體DNA的提取及濃度測定，而從D型多殺巴斯德氏菌PMD-48菌株培養(yǎng)物中得到DNA總提取物，并以吸光值A(chǔ)260/280測定DNA的濃度與純度。
在進行PMT編碼基因的克隆時，以上述所得的DNA總提取物作為模板，并使用一組示于表1中的引物對A1B2來進行PCR正向引物A15′-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO3)BamHI反向引物B25′-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ IDNO10)NheI由于PMT編碼基因序列內(nèi)不具BamHI與NheI限制酶切割位，在設(shè)計正向引物A1(對應(yīng)于toxA的核苷酸殘基206～236)與反向引物B2(對應(yīng)于toxA的核苷酸殘基4068～4036)時，乃分別引入BamHI與NheI的限制酶切割位，即為以底線標記的部分。利用A1B2引物對可得到一長度約為3.8kb的PCR擴增產(chǎn)物。
PMT編碼基因的PCR反應(yīng)條件如下在100μL反應(yīng)溶液中，以取自上述所提取得到的DNA做為模板(0.2ug)，其中加入以2UTaq聚合酶、1倍反應(yīng)緩沖液、2.5mM MgCl2、0.25mM dNTPs以及各20pmoles的引物(A1B2)。反應(yīng)溶液被置入于聚合酶鏈反應(yīng)儀(Omnigene Temperature Cycler；Hybaid)中，反應(yīng)條件設(shè)定為95℃，40秒；55℃，30秒；以及72℃，1分鐘，并作30次循環(huán)。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物的回收取上述PCR擴增產(chǎn)物10μL并加入2μL DNA染劑予以混合均勻后，再使用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳后將兩側(cè)含標記的凝膠切下，先經(jīng)溴化乙啶(0.5μg/ml)染色10秒鐘，再予以水洗脫色歷時5分鐘。之后，將未染色的膠片與已呈色的標記(marker)共置于紫外線照明箱上對齊，利用刀片將分子量對應(yīng)于3.8kb的PCR擴增產(chǎn)物切下，并置于干凈的微量離心管中以回收瓊脂糖凝膠中的DNA片段。首先將膠片稱重，以1g當作1mL的方式加入3倍體積的QG溶液，再加入1倍體積的異丙醇(isopropanol)；將此溶液加入QIAquick spin column(QIAquickTM凝膠提取試劑盒，Qiagen公司)中，以10,000rpm來離心歷時1分鐘，丟棄濾液；將750μl PE緩沖液加入至管柱中并進行清洗，于室溫下靜置5分鐘；以10,000rpm來離心歷時1分鐘，丟棄濾液，再次離心2分鐘以避免乙醇殘留，之后將管柱置于新的微量離心管上，加入30μl洗脫緩沖液(elution buffer)并靜置1分鐘，再以12,000rpm離心歷時1分鐘。收集濾液并保存于-20℃中備用。之后進行限制酶切割及接合反應(yīng)。
限制酶切割經(jīng)回收的PCR產(chǎn)物(25μL)，加入5μL的10倍BamHI反應(yīng)緩沖液，加滅菌去離子水(DDW)至48μL，再加入BamHI20U(10U/μL)，于37℃水浴進行限制 剪切反應(yīng)至隔夜。待限制 剪切作用完成后，回收DNA片段的步驟同前述，最后將其溶于25μL DDW內(nèi)。另外加入5μL的10倍NheI反應(yīng)緩沖液，加DDW至46μL，再加入NheI 20U(5U/μL)，于37℃水浴進行反應(yīng)2小時至隔夜。而如此所回收得到的分子量約為3.8kb的DNA片段最后被溶于DDW內(nèi)。
克隆載體的切割與接合反應(yīng)取1μg表達載體pET25b(+)(5574bp，Novagen)以BamHI及NheI(New England Biolabs)來分別剪切，并從瓊脂糖凝膠中回收呈線形的載體pET25b(+)DNA。將回收的載體DNA(100ng)及3.8kb的PMT編碼DNA克隆片段(300ng)予以混合后，加入2μL的10倍的接合緩沖液及0.8μL T4DNA接合(400U/μL)，最后補滅菌去離子水至總體積為20μL，于16℃水浴中進行反應(yīng)，作用時間約16小時。
轉(zhuǎn)化作用取已培養(yǎng)好的大腸桿菌勝任細胞(NovaBlue strain，Novagen)，經(jīng)低溫離心使菌塊沉淀，再加入轉(zhuǎn)化溶液(60mMCaCl2；15％甘油；10mM HEPES，pH7.0)并置于冰上15分鐘。取5μL已完成接合的接合產(chǎn)物加入至100μL已處理過的大腸桿菌勝任細胞均勻混合，再于冰上靜置30分鐘。之后利用42℃、2分鐘的熱休克(heat shock)方式，將所形成的重組型載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。于冰上靜置5分鐘后，加入0.8ml LB肉湯培養(yǎng)基來作混合，并于37℃下以250rpm震蕩培養(yǎng)歷時1小時。之后，取出150μL培養(yǎng)菌液，并使用滅菌玻棒將菌液涂布于含氨芐青霉素(ampicillin，100μg/ml)的LB肉湯培養(yǎng)基上，于37℃中培養(yǎng)歷時12～16小時，之后挑選單一菌落進行篩選。
重組型載體的篩選挑選單一菌落接種至2mlLB肉湯培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)，于37℃下以250rpm震蕩培養(yǎng)隔夜。菌液離心后去除上清液，以QIAprepMiniprep kit進行重組型載體的提取。首先將細菌以250μL P1緩沖液懸浮，然后以250μLP2緩沖液將細菌溶解，再以350μL N3緩沖液進行中和，以10,000rpm離心歷時10分鐘，取上清液加入至QIAprep管柱中，以10,000rpm離心歷時1分鐘，丟棄濾液，加入750μL PE緩沖液至管柱中進行清洗，以10,000rpm離心歷時1分鐘，丟棄濾液，再次離心2分鐘以避免乙醇殘留。之后，將管柱置于新的微量離心管上，加入50μL EB緩沖液并靜置1分鐘，再以10,000rpm離心歷時1分鐘，收集濾液即為重組型載體DNA溶液。
取一部分的重組型載體(1μg)以BamHI的限制酶切割成線狀，并以瓊脂糖凝膠電泳來分析其分子量是否與所預期者相符合。
核酸測序?qū)⒔?jīng)限制酶及PCR確認后的轉(zhuǎn)型載體進行核酸測序，取得的序列以DNA star軟體進行序列比對及開放閱讀框(openreading frame)分析，經(jīng)上述方式確認后的重組型載體被命名為Tox6，并做為進行下面克隆編碼PMT亞基的DNA片段時的基礎(chǔ)DNA模板克隆株。重組型載體Tox6攜帶有一編碼PMT的3844bp的DNA片段。
編碼PMT基的DNA片段的克隆取上面所得的重組型載體Tox6 2μg，分別以BamHI、HindIII于37℃水浴進行反應(yīng)至隔夜后，對所得到的反應(yīng)溶液(10μL)予以加入2μL的裝填染料(loading dye)，混合均勻后以0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳后，將兩側(cè)含標記片段的凝膠切下，先經(jīng)溴化乙啶(0.5μg/ml)染色10秒鐘，再水洗脫色5分鐘。將未染色的膠片與已染色的標記共置于紫外線照明箱上對齊，盡快用刀片分別將內(nèi)有對應(yīng)于分子量1456bp及1502bp的DNA片段的凝膠區(qū)切下，置于干凈的微量離心管中稱重并回收瓊脂糖凝膠中的DNA片段，回收方式如上所所述。取回收的1456bp及1502bp的DNA片段300ng，分別與100ng表達載體pET32b與pET32aDNA進行接合反應(yīng)后，并進行載體的轉(zhuǎn)化、篩選及測序等確認，方法如上所述。于此所得到的重組型載體經(jīng)確認后分別被命名為Tox1與Tox2。
另外取重組型載體Tox6，分別以HindIII及NheI于37℃水浴進行反應(yīng)至隔夜后，回收883bp kb的DNA片段并與pET32b表達載體DNA進行接合反應(yīng)，經(jīng)載體的轉(zhuǎn)化、篩選及測序后所得到的重組型載體被命名為Tox7。
上述所得到的重組型載體Tox6、Tox1、Tox2與Tox7所攜帶的多殺巴斯德氏菌PMT編碼DNA片段對應(yīng)于PMT編碼基因的所在位置被示意地顯示于圖10中。而且，在與D型產(chǎn)毒株NCTC 12178的PMT編碼基因作一比對后，上述所得到的3844bp、1456bp、1502bp以及883bpDNA片段被推算出分別編碼基本上由對應(yīng)于NCTC 12178的PMT蛋白質(zhì)的2-1281、2-486、486-986以及986-1281氨基酸殘基所構(gòu)成的勝 于是，于后文中，由上述重組型載體Tox6、Tox1、Tox2、Tox7所攜帶的多殺巴斯德氏菌PMT編碼DNA片段所表達出來的重組型蛋白質(zhì)即依各載體的名稱而予以稱為Tox6、Tox1、Tox2、Tox7重組型蛋白質(zhì)。
另外，上面所得到的重組型載體Tox6、Tox1、Tox2與Tox7被進行線狀重組型載體瓊脂糖凝膠電泳分析，所得結(jié)果被示于圖11中。
重組型載體克隆株的表達將上面所得到的重組型載體Tox6、Tox1、Tox2與Tox7克隆株的單一菌落分別接種至10mL LB肉湯培養(yǎng)基(含有100ug/mL氨芐青霉素)，分別于37℃、250rpm/min培養(yǎng)至隔夜，取2mL隔夜培養(yǎng)的菌液加入100mL新鮮的LB肉湯培養(yǎng)基，于37℃、250rpm/min培養(yǎng)至吸光值(波長600nm)為大約0.6時，再加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside，IPTG)使其濃度達1mM，于同樣溫度下培養(yǎng)歷時6小時，收集菌體并懸浮于10mL的PBS中，以供后續(xù)的分析所用。
另將多殺巴斯德氏菌PMD48的單一菌落接種至10mLBHI肉湯培養(yǎng)基，分別于37℃，250rpm/min培養(yǎng)一夜，取2mL隔夜培養(yǎng)的菌液加入100mL新鮮的BHI肉湯培養(yǎng)基，于37℃、250rpm/min培養(yǎng)歷時26小時，收集菌體并懸浮于10mL的PBS中，以供作為后面進行毒性及免疫原性分析的陽性對照組。
多克隆抗體的制備取粗制PMT以0.1％福爾馬林不活化之后，加入等量的弗氏完全佐劑，以肌肉注射方式給于豬，每14天免疫一次，經(jīng)多次免疫后采其血清進行中和抗體的測試，確定其具有高中和抗體效價，此即為多克隆抗體的來源。
蛋白質(zhì)電泳分析及Western印跡反應(yīng)配制10％的SDS-PAGE，將待分析樣品加入等量的2X樣品緩沖液(sample buffer)，以100℃煮沸15分鐘后進行裝填(loading)；并以Tris-甘氨酸(glycine)緩沖液(pH8.3)為電泳液，以100伏特進行電泳。當指示染劑至膠片末端時，關(guān)掉電源并取出膠片，以固定液(45％甲醇，10％乙酸)固定10分鐘；繼而以含0.1％考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue)R-250的染色液染色歷時10分鐘，隨后再用脫色液(10％乙酸)脫色，直到各蛋白質(zhì)帶清楚可見為止，利用AlphaImagerTM2200(Alpha Innotech Corporation)估計各個重組型亞基毒素蛋白質(zhì)克隆株的表達量。重組型亞基毒素蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果被示于圖12。
另外進行相同的凝膠電泳處理但不予染色，所得到的電泳膠片利用轉(zhuǎn)漬半干式電泳槽(TRANS-BLOT SD，semi-drytransfer cell；Bio-Rad)，以120mA轉(zhuǎn)漬到硝基纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)上。加入含5％脫脂乳的封阻緩沖溶液(blocking buffer)，于室溫下作用30分鐘后，加入抗PMT的單克隆抗體(7-10A，申請人的實驗室所自行制備者)或豬抗PMT多克隆抗體，于室溫下作用1小時，經(jīng)PBST(0.05％Tween 20 in PBS)清洗后，再加入結(jié)合有堿性磷酸酶的第二抗體(兔抗-豬IgG以及山羊抗-小鼠IgG)，最后加入底物(NBT/BCIP，Tris buffer)來進行呈色。Western印跡分析結(jié)果被示于圖13與圖14，而各個重組型亞基毒素蛋白質(zhì)克隆株的表達量分析結(jié)果被示于表4。
表4.以AlphaImagerTM2200影像系統(tǒng)分析各個重組型亞基

實施例3.PMT重組型亞基(rsPMT)的毒力試驗Vero細胞毒力試驗將以IPTG誘導表達后的rsPMT克隆菌株以5,000xg離心歷時10分鐘以收集細菌，再以無菌PBS來反復沖洗以使細菌懸浮，以超聲波(輸出功率20％，作用30分鐘；MisonixXL2020，Heat Systems Inc.)將細菌擊碎，繼而以10,000xg高速離心歷時30分鐘。取上清液，經(jīng)孔徑0.45μm及0.22μm過濾膜過濾，此過濾兩次的過濾液即為表達產(chǎn)物粗制可溶性蛋白質(zhì)，以此來進行Vero細胞毒力試驗，實驗方式為依照實施例1中的I、材料與方法中的D項、PMT蛋白質(zhì)對于非洲綠猿腎臟細胞株(Vero cell)的細胞致病效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)的測定。Vero細胞毒性分析結(jié)果被示于圖15-17中。
本實驗是以多殺巴斯德氏菌PMD48所表達的粗制PMT毒素蛋白質(zhì)作為對照組，并以僅含2％胎牛血清的DMEM作為空白試驗。所有實驗組、對照組以及空白試驗在培養(yǎng)七日后進行細胞致病效應(yīng)(CPE)的觀察，其中將最高稀釋倍數(shù)但仍可造成所有四孔中的細胞皆呈現(xiàn)病變的毒素濃度訂定為最小毒性劑量(minimum toxin dose，MTD)。
于此實驗中，由重組型載體Tox1、Tox2、Tox6以及Tox7所表達的各個重組型蛋白質(zhì)所測得的MTD值分別為1.21mg/ml、1.00mg/ml、2.81mg/ml以及2.36mg/ml，且皆不會誘導Vero細胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象。相對地，粗制PMT蛋白質(zhì)對照組即使在低至140ng/ml的濃度下仍會誘導Vero細胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象。
當以顯微鏡觀察細胞型態(tài)時發(fā)現(xiàn)，以粗制PMT蛋白質(zhì)(140ng/ml)處理Vero細胞時會造成節(jié)結(jié)樣的病變(圖15)，而以rsPMT(Tox1)處理時，即使所加入的重組型蛋白質(zhì)的濃度高于1mg/ml時，也不會造成典型節(jié)結(jié)樣的病變(圖17)。
小鼠半致死劑量(50％Lethal Dose；LD50)試驗以上述所制備的可溶性重組型蛋白質(zhì)與天然PMT蛋白(PMD-48所產(chǎn)生的)來進行小鼠LD50的測定。所用的小鼠為無特定病原(sepcific pathogen free，SPF)的BALB/c小鼠，每實驗組各有6只小鼠，于4周齡時每只鼠以0.5mL的劑量行腹腔注射。注射后觀察10天并記錄是否有死亡或臨床癥狀，并以Behrens-Karber方程式來計算各組的LD50。
Behrens-Karber方程式差距＝(次高于累計死亡50％的劑量-次低于累計死亡50％的劑量)×[(50％-次低于50％的累計死亡)/(次高于50％的累計死亡-次低于50％的累計死亡)]LD50＝(次低于累計死亡50％的劑量)+差距10天內(nèi)死亡或第10天仍未死亡者于安樂死后進行解剖，以肉眼檢查并將各臟器組織的采樣標本以10％中性福爾馬林溶液固定，各標本再以石蠟包埋，以石蠟切片機制成5毫米切片，經(jīng)蘇木紫-伊紅(Hematoxylin-Eosin，H&E)染色后進行組織病理學檢查。
結(jié)果
由上述公式所計算出的粗制PMT蛋白質(zhì)與PMT亞基的重組型蛋白質(zhì)對小鼠的半致死劑量(LD50)結(jié)果被示于表5。
表5.粗制PMT蛋白質(zhì)與PMT重組型亞基對于小鼠的半致死劑量

在試驗進行第10天后，將仍未死亡的小鼠進行安樂死犧牲，并與10日內(nèi)已先行死亡的小鼠一起進行解剖。除了以肉眼檢查各臟器組織外，并以10％中性福爾馬林溶液來固定所采樣的標本。
實施例4.小鼠抗-PMT重組型亞基抗體的制備與測試小鼠的兔疫及其脾臟單核細胞(mononuclear cells，MNCs)的分離將上述所制備的可溶性rsPMT蛋白質(zhì)進行小鼠免疫。所用的小鼠為SPF BALB/c小鼠，于6及8周齡時進行各免疫一次，每只小鼠免疫的劑量為100μg/0.5mL，第1次免疫所使用的佐劑為弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，Gibco，Grand Island，NY，USA)，而進行第2次免疫(100μg/0.5ml)時則改用為弗氏不完全佐劑(Freund’s incompleteadjuvant)。第2次免疫后以致死劑量(2μg)的天然PMT毒素行腹腔注射攻擊。每組小鼠于第2次免疫后及攻擊后14天取其脾臟以分離MNCs。脾臟分離MNCs后以紅血球溶解緩沖溶液(RBC lysis buffer；0.17M NH4Cl、0.01M KHCO3)來溶解紅血球，并以無菌PBS清洗細胞3次，最后將MNCs懸浮于含10％胎牛血清的RPMI1640(Gibco，Grand Island，NY，USA)中備用。
抗體分泌細胞分析(antibody-secreting cells；ASCs)以酶斑點分析法(enzyme-linked immunospot；ELISPOT)來進行抗體分泌細胞的檢測。首先，將上述所制備的可溶性rsPMT蛋白質(zhì)(20μg/ml，50μl/孔)涂覆至96孔的微量硝基纖維素平板(96-well nitrocellulose bottomed plates，MillititerHA，Millipore Corp，Bedford，Mass，USA)上，于4℃下靜置過夜后，以PBST水洗三次，然后加入封阻緩沖液(1％BSA)并于37℃下反應(yīng)歷時1小時。以PBST水洗二次后，加入不同稀釋濃度的待測單核細胞細胞液100μL，并于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時。以PBST水洗三次后，加入100μL以封阻緩沖液稀釋1000倍的堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(goat anti-mouse IgG antibody)(Sigma)，并于37℃下反應(yīng)歷時1小時。以PBST水洗五次后，加入100μL底物(NBT/BCIP，Tris緩沖液)并于37℃下反應(yīng)歷時15分鐘以便產(chǎn)生呈色，以解剖顯微鏡計數(shù)ASCs的數(shù)目。小鼠的抗體分泌細胞分析結(jié)果如表6所示。
于小鼠第二次免疫后以及以粗制PMT毒素攻擊后14天，由各組小鼠取其脾臟，并且分離脾臟中的單核細胞進行ASCs的分析，在2次免疫后各組小鼠的脾臟呈顯明顯腫大，但在攻擊后，以Tox1及Tox2免疫組的小鼠脾臟則有明顯萎縮的現(xiàn)象，但各組小鼠均無死亡。在免疫2次后，由Tox2免疫組的小鼠脾臟脾臟單核細胞中所測得的ASCs最高(在106個單核細胞中有2993.33±200.33個細胞為專一性的ASCs)，而以傳統(tǒng)類毒素免疫組的ASCs最低(在106個單核細胞中有1386.67±477.21個細胞為專一性的ASCs)。
在粗制PMT毒素攻擊后各免疫組小鼠的ASCs也呈明顯揚升的現(xiàn)象，其中以Tox1免疫組的小鼠最為明顯，其攻擊后的ASCs數(shù)目為10233.33±850.49/106單核細胞。此等結(jié)果顯示，依據(jù)本發(fā)明的rsPMT蛋白質(zhì)能在小鼠體內(nèi)激發(fā)有效的保護力，使小鼠能承受高量粗制PMT毒素的攻擊。雖然部分免疫組小鼠在攻擊后脾臟呈現(xiàn)明顯萎縮現(xiàn)象，仍無損于體液性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。
表6.小鼠抗體分泌細胞的酶斑點分析

表中所示為每1×106個單核細胞(MNCs)中對PMT具專一性的抗體分泌細胞數(shù)量。變方分析的組間差異性以a、b、c來表示。
細胞性免疫反應(yīng)于96孔平底組織培養(yǎng)盤上，每孔分別加入50μL(2×105細胞/孔)的經(jīng)分離的單核細胞，再以3個重復的方式加入50μL天然PMT(10X MTD)作為刺激原，并以RPMI 1640細胞培養(yǎng)液作為陰性對照，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。于培養(yǎng)的最后16小時，加入0.5μCi3H-胸腺嘧啶(3H-thymidine，Amersham Life science)以標記細胞，并以多重式細胞收獲器(multiple cell harvester，Minimash 200，Dynatech)分別將細胞收集于玻璃纖維濾紙上，于56℃烘箱干燥2小時，置入閃爍計數(shù)瓶中，加入2mL的閃爍計數(shù)液(EcoscintTMH，Pational diagnostics)，于液態(tài)閃爍計數(shù)儀(Beckman liquid scintillation system model LS8000)測其CPM(count per minute)以計算淋巴細胞增殖反應(yīng)情形。
淋巴細胞增殖反應(yīng)情形以刺激指數(shù)(stimulation index；SI)表示，其中SI＝PMT刺激組的CPM/PMT未刺激組的CPM。參照van Diemen等人的研究(Vet Immunol Immunopathol.，41307-321，1994)，當SI大于2時即判定淋巴細胞有增殖反應(yīng)情形產(chǎn)生。
小鼠的細胞性免疫反應(yīng)結(jié)果被示于表7。所有免疫組小鼠于第2次免疫后顯示出其脾臟單核細胞對粗制PMT毒素具有增殖反應(yīng)，Tox1免疫組的SI為2.11±0.27、Tox2免疫組的SI為3.31±0.95、Tox7免疫組的SI為2.31±0.26、類毒素免疫組的SI則為6.02±0.68，這顯示小鼠經(jīng)2次免疫后有明顯細胞性免疫反應(yīng)被活化的現(xiàn)象。但是，于攻擊后只有Tox7及PMT類毒素免疫組對粗制PMT毒素仍有增殖反應(yīng)，而Tox1及Tox2免疫組則對粗制PMT毒素的刺激增殖反應(yīng)明顯降低，這顯示粗制PMT毒素的攻擊有可能會部分地抑制細胞性免疫反應(yīng)的活化。
表7.小鼠的細胞性免疫反應(yīng)分析*

*于疫苗接種后14天以及攻擊后14天進行分析，所用的刺激原為PMT粗制毒素(10X MTD，220ng)。
血清中和抗體效價試驗(Serum Neutralization AntibodyTiter Test，SN Test)于96孔組織培養(yǎng)盤內(nèi)，將所有實驗小鼠的血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續(xù)稀釋。在每孔內(nèi)加入50μL經(jīng)稀釋的待測血清，繼而于各孔中加入50μL含5倍MTD的天然PMT蛋白質(zhì)(5X MTD，100ng)，然后將培養(yǎng)盤置于37℃下歷時1小時。之后，于各孔中加入2×104細胞/孔的Vero細胞，然后將培養(yǎng)盤置于含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)至7天后，觀察能夠抑制CPE出現(xiàn)的血清最高稀釋倍數(shù)，該稀釋倍數(shù)為血清的中和抗體效價。小鼠的血清中和抗體效價試驗結(jié)果被示于表8。
表8.小鼠的中和抗體效價分析*

*于疫苗接種后14天以及攻擊后14天進行分析，表中所示數(shù)值即為所測得的SN值。
由上述結(jié)果得知，經(jīng)Tox1、Tox2及Tox7重組型蛋白質(zhì)對豬進行免疫后，可有效誘導小鼠對粗制PMT蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有保護性的中和抗體，且在攻擊后于小鼠體內(nèi)所激起的抗體具有一定有效效價，其中使用Tox1作為疫苗時，所測SN值至少有32，Tox7作為疫苗時，所測SN值至少有256。
小鼠抗-PMT單克隆抗體的制備有關(guān)小鼠抗-PMT單克隆抗體的制備為參考Antibodies，Cold Spring Harbar Laboratory，1988中所描述的一般操作技術(shù)來進行。
取Tox7重組型蛋白70μg以及等量的弗氏完全佐劑相混合，并以0.5ml的數(shù)量經(jīng)腹腔免疫注射至BALB/cByJ小鼠體內(nèi)。之后，每隔14日予以補強一次。第一次補強是再取Tox7重組型蛋白質(zhì)70μg加入等量的弗氏不完全佐劑。第二次補強則以不加佐劑的Tox7重組型蛋白經(jīng)靜脈注射至小鼠體內(nèi)。在確定小鼠已有抗體產(chǎn)生時，取出小鼠脾臟，并進行漿細胞(Plasma cell)的分離。
接著進行漿細胞與小白鼠骨髓癌細胞NS-1的融合，培養(yǎng)并觀察經(jīng)融合的細胞的生長，待細胞長成細胞團塊時，以ELISA來進行抗體分泌的篩選。所選出能分泌抗體的細胞團塊再進一步供以后續(xù)的融合瘤單克隆化篩選。經(jīng)反復篩選后所得的單克隆化融合瘤，是以Western印跡法來確定抗體的專一性。
將所得到的融合瘤細胞大量培養(yǎng)于含2％胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液內(nèi)，并收取被分泌至培養(yǎng)基上清液中的單克隆抗體以供實驗所用。于是，一針對Tox7重組型蛋白質(zhì)的單克隆抗體被得到，其被命名為“7-10A”。
實施例5.PMT重組型亞基對于豬的免疫效力以PMT重組型亞基來免疫豬的中和抗體效價分析以上述所制備的可溶性rsPMT蛋白質(zhì)來進行豬免疫。所使用的豬為購自一無PAR病例的一貫作業(yè)豬場，豬于5周齡及7周齡時分別以每劑量含1mg rsPMT蛋白質(zhì)混合等體積的弗氏佐劑來進行免疫，每次于頸部接種一劑量，并于每次免疫后2周采其血清進行中和抗體分析，中和抗體效價測定方式如下面實施例5中的血清中和抗體效價試驗所述。結(jié)果被示于表9。
表9.PMT重組型亞基對于豬的中和抗體效價分析

經(jīng)由上述結(jié)果得知，以Tox1、Tox2及Tox7重組型蛋白質(zhì)對豬進行免疫后，可有效誘導豬對rsPMT蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有保護性的中和抗體，且在攻擊后于豬體內(nèi)所激起的抗體具有一定有效效價，其中使用Tox1作為疫苗時，所測SN值至少為256，Tox7作為疫苗時，所測SN值至少有128，而Tox2作為疫苗時，所測SN值至少為32。
保護性試驗自無嚴重AR臨床癥狀一貫作業(yè)豬場采其懷孕母豬血清進行中和抗體效價測定，選取中和抗體效價低于4倍的懷孕母豬50頭，依照下表所示的疫苗成份，隨機分成rsPMT細菌疫苗(bacterin)[Tox1、Tox2、Tox7、多殺巴斯德氏菌A型與D型以及支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]、rsPMT疫苗(Tox1、Tox2、Tox7)、市售AR疫苗及類毒素細菌疫苗[類毒素、多殺巴斯德氏菌A型與D型以及支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]與陰性對照組等5組，分別與氫氧化鋁膠混合后于母豬分娩前5周及3周時各進行一次免疫，母豬于分娩時收集初乳及3日齡新生仔豬血清，測定其中和抗體效價。
表10.用于保護性試驗的疫苗的組成成份

*所使用的多殺巴斯德氏菌A與D型細菌是以BHI肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)26小時后，于37℃下以0.3％中性福爾馬林予以滅活歷時2天。
**市售疫苗的用量為每劑量2ml。
待母豬生產(chǎn)后，隨機從各組挑出5頭仔豬，于仔豬21日齡時以致死劑量的PMT毒素(1mg)，以肌肉注射方式進行攻擊，并且觀察其臨床癥狀及存活率。此外，于每次免疫及攻擊前采血，測定其血清中和抗體效價，實驗期間采取任食。保護性試驗結(jié)果被示于表11。
表11.具PMT亞基疫苗保護的仔豬經(jīng)PMT毒素攻擊后的存活率

*對照組為一未以任何疫苗免疫的母豬所生的仔豬。
仔豬增重試驗本試驗是在母豬生產(chǎn)后隨機從上述保護性試驗的各組分別挑選出10頭仔豬來進行。試驗時，是將所選出的仔豬分成攻擊組和未攻擊組，攻擊組是在仔豬18日齡時以肌肉注射方式將低劑量的PMT毒素(0.2mg)投予仔豬來進行攻擊，于攻擊前及攻擊后3周測其體重，并且觀察其臨床癥狀及增重情形和抗體的變化，實驗期間采取任食。仔豬增重的結(jié)果如下列表12所示表12.抗PAR的仔豬的增重試驗結(jié)果

注實驗結(jié)果以t-試驗(t-test)來進行分析，*表示具有顯著性差異(p＜0.05)田間試驗先選定有發(fā)生PAR臨床病例及無發(fā)生PAR臨床病例的一貫作業(yè)豬場各一場，作為實驗豬場，于實驗開始時所有母豬群以rsPMT細菌疫苗[Tox1、Tox2、Tox7、多殺巴斯德氏菌A型與D型以及支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]統(tǒng)一進行免疫一次，并于母豬分娩前5周及3周時各進行一次免疫。在無發(fā)生PAR臨床病例的一貫作業(yè)豬部分于疫苗使用12個月后，進行母豬分娩時的血清與初乳中和抗體的分析，結(jié)果如圖18所示。在有發(fā)生PAR臨床病例的豬場部分則進行母豬分娩時的血清中和抗體的分析，結(jié)果如圖19所示。
此外，所有仔豬分別于4及6周齡時也以rsPMT細菌疫苗[Tox1、Tox2、Tox7、多殺巴斯德氏菌A型與D型以及支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)]來進行免疫，于疫苗使用12及18個月后，于肉豬出售時自屠宰場取回豬頭，進行鼻甲介骨肉眼檢查，以評估疫苗的效力，鼻甲介骨萎縮程度的判定標準如圖20所示。鼻甲介骨的萎縮程度等級的評分(Score)是依據(jù)病變程度的輕重分為-、+/-、+、++、+++、++++等六級，其中-表示正常的鼻甲介骨，是以鼻甲的背側(cè)窩卷由外側(cè)旋轉(zhuǎn)卷曲約1.5圈以及其腹側(cè)窩卷由外側(cè)旋轉(zhuǎn)卷曲約1.25圈來判定，評分時為得10分；+/-是以鼻甲的背側(cè)窩卷正常以及其腹側(cè)窩卷萎縮達1/4以下來判定，評分時為得8分；+是以鼻甲的背側(cè)窩卷輕微萎縮以及其腹側(cè)窩卷萎縮達1/4以下來判定，評分時為得6分；++是以鼻甲的背側(cè)窩卷萎縮1/4以下以及其腹側(cè)窩卷萎縮達1/2以下來判定，評分時為得4分；+++是以鼻甲介骨的背側(cè)窩卷顯著萎縮以及鼻中膈已受波及來判定，評分時為得2分；++++是指鼻甲介骨已完全萎縮，評分時為得0分。
該養(yǎng)豬場于疫苗使用之前其臨床發(fā)生比例為60％，及評分之后其得分為57，其中有30％以上的鼻甲介骨為+++與++++，于免疫后12及18個月后其鼻甲介骨萎縮程度主要為-、+/-，經(jīng)評分后的得分分別為94及90，二次的得分與免疫前呈現(xiàn)顯著的差異(p＜0.005)，這顯示依據(jù)本發(fā)明的rsPMT細菌疫苗在現(xiàn)場具有極良好的保護效力。
申請人應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行全段與亞基PMT毒素基因的克隆，并以核酸測序等方式確認并比對基因序列后，進行各克隆株重組型亞基PMT毒素蛋白的表達，且其表達量可達轉(zhuǎn)殖細菌總蛋白量濃度的20％以上，相較于天然PMT只占細菌總蛋白量的0.5-1％以下，顯示可大幅提升抗原蛋白制備的效率。
其次，表達蛋白以Western印跡法(Western blotting)來確認其抗原性，而結(jié)果顯示所有克隆表達的重組型亞基PMT毒素蛋白皆能被小鼠抗PMT單克隆抗體或豬抗PMT多克隆抗體所辨識，這顯示依據(jù)本發(fā)明的rsPMT蛋白能涵蓋與天然PMT相類似的抗原表位(epitopes)。
此外，經(jīng)利用Vero細胞、小鼠及實驗豬等進行rsPMT蛋白的毒性比較試驗，結(jié)果顯示天然PMT于140ng/ml的濃度下即可導致Vero細胞產(chǎn)生典型的結(jié)節(jié)樣(knot)細胞病變(CPE)，但所有重組型亞基毒素蛋白即使在＞1mg/ml的高濃度下，Vero細胞仍不會產(chǎn)生典型的結(jié)節(jié)樣細胞病變，這證實依據(jù)本發(fā)明的rsPMT蛋白不具有任何細胞毒性，且于動物毒性試驗中也顯示這些重組型亞基毒素蛋白即使在高濃度下對小鼠及實驗豬皆不具任何生物毒性，也即依據(jù)本發(fā)明的rsPMT蛋白皆具有高度的安全性。除此以外，經(jīng)以小鼠及豬進行免疫原性的測試中，通過檢測免疫動物所產(chǎn)生的中和抗體效價與其脾臟內(nèi)所產(chǎn)生的專一性抗-PMT抗體分泌細胞的數(shù)量，并進行實驗動物體液性與細胞性免疫反應(yīng)的分析，以及以攻擊試驗評估疫苗保護效力的測試，結(jié)果顯示，涵蓋部分PMT氨基端或羧基端亞基(amino or carboxyl terminalsubunit)的本發(fā)明rsPMT蛋白，皆能在小鼠及豬身上產(chǎn)生良好的免疫保護效益。
由上述結(jié)果得知，依據(jù)本發(fā)明的rsPMT蛋白具有生產(chǎn)時間短、效率高、生產(chǎn)成本低廉、無毒性、高安全性及高免疫保護效力的特點，必能有效取代傳統(tǒng)PMT類毒素成為新一代PAR疫苗的主要抗原成分。
實施例6.對抗進行性萎縮鼻炎與假性狂犬病(PAR-PR)的雙價疫苗(Bivalent vaccine)的制備及其免疫效力試驗基于進行性萎縮鼻炎(PAR)與假性狂犬病(PR)皆為豬的高傳染性與致死性疾病，申請人進一步嘗試將由實施例2所建立的克隆菌株所表達出的Tox1、Tox2、Tox7重組型蛋白來與gE-刪除的滅活假性狂犬病病毒(pseudorabies virus)組合，由此制造能對進行性萎縮鼻炎(PAR)與假性狂犬病(PR)產(chǎn)生良好保護效用的雙價疫苗。
A、多殺巴斯德氏菌毒素(PMT)的制備本實施例中所用的多殺巴斯德氏菌毒素(PMT)是參照實施例1的實驗操作程序“B、PMT蛋白質(zhì)的制備”中所述而被制得。在依照實施例1中所述以Vero細胞檢測最小毒性劑量(MTD)后，將粗制PMT分裝并保存于-20℃冰箱內(nèi)備用。于本實驗中所用的粗制PMT，經(jīng)Vero細胞的CPE試驗所測得的MTD為1024倍。
B、含PMT重組型亞基與PMT類毒素的PAR疫苗的制備將實施例2中所建立的克隆株Tox1、Tox2及Tox7，分別取單一菌落接種至含100μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下振蕩隔夜培養(yǎng)。經(jīng)兩次繼代后，再取2ml的菌液加入至98ml的LB肉湯培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中，置37℃下振蕩培養(yǎng)歷時約3小時。之后，加入1ml IPTG(100mM)至最終濃度為1mM。在誘導表達6小時后，收集菌液并以12,000rpm離心以去除上清液。以PBS(pH7.2)反復沖洗以使細菌懸浮，并以超聲波(Misonix XL2020，Heat Systems Inc.，輸出功率20％，作用30分鐘)將細菌擊碎。之后，以10,000xg高速離心30分鐘，將收取的上清液經(jīng)孔徑0.45μm及0.22μm過濾膜來過濾，此經(jīng)兩次過濾的過濾液即為表達產(chǎn)物粗制可溶性蛋白質(zhì)。利用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析來測定蛋白質(zhì)濃度，并以AlphaImagerTM來估計表達數(shù)量以調(diào)整蛋白質(zhì)濃度。
另外，將D型多殺巴斯德氏菌PMD-48與A型多殺巴斯德氏菌PMA-8的單一菌落分別接種于BHI肉湯培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱中振蕩培養(yǎng)歷時18～24小時。之后，取1ml菌液進行細菌數(shù)的計數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)來表示。其余菌液加入福爾馬林(formalin)至最終濃度為0.2％(v/v)，并于37℃恒溫箱中作振蕩滅活(inactivation with shaking)歷時24～36小時。
將上述所得到的包含Tox1、Tox2及Tox7重組型蛋白的產(chǎn)物(各取0.7mg)以及滅活的A與D型多殺巴斯德氏菌(各取1×109CFU的數(shù)量)混合(占疫苗總量的70％)，再加入已滅菌的鋁膠(占疫苗總量的30％)(抗原與佐劑的用量比例為70∶30，v/v)，予以混和均勻以形成每劑量2ml的含PMT重組型亞基與PMT類毒素的PAR疫苗，于下文中簡稱為“PAR疫苗”。
C、多殺巴斯德氏菌半致死劑量(LD50)的測定自野外臨床病例所分離的多殺巴斯德氏菌PMD-48以不同細菌濃度對BABL/c小鼠進行LD50測定。實驗共分為4組，每組各有10只小鼠，第1組至第4組分別以每0.5ml含1.44×106、1.44×105、1.44×104以及1.44×103CFU來進行腹腔注射。注射后連續(xù)觀察10天，并記錄小鼠的死亡時間，最后再以Behrens-Karber方程式來計算LD50。所測得的LD50結(jié)果為2.1×103CFU/0.5ml。
D、假性狂犬病毒(Pseudorabies virus)的制備將兔腎細胞株(Rabbit kidney cell line，RK-13細胞)[購自于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)，臺灣省300新竹市食品路331號，寄存編號為CCRC 60010]培養(yǎng)于含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM內(nèi)，當生長成單層細胞后，予以加入0.05MOI[傳染的多重性(multiplicity of infection)]的PR病毒(TNL株)(由高生制藥股份有限公司所提供)以感染RK-13細胞，并置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培育歷時1小時。之后，將細胞培養(yǎng)于含2％FBS的DMEM中，當細胞致病效應(yīng)(CPE)達80～90％時，將細胞連同細胞培養(yǎng)液進行兩次的冷凍-解凍過程(freeze-thawing process)，接而于1,000rpm與4℃下離心歷時20分鐘。收集上層液，即為PR病毒原液，將PR病毒原液再以上述方式進行2次增殖后，收取病毒液并依下面所述方法來檢測病毒效價，而后予以分裝并保存于-70℃冰箱內(nèi)備用。
E、假性狂犬病毒效價測定50％組織培養(yǎng)物感染效價(50％tissue culture infectiondose，TCID50)取1.5ml試管12支，每管加入0.9ml不含胎牛血清的DMEM，取待測病毒液0.1ml，加入第1管后充份混合均勻，再由第1管混合均勻的病毒液吸取0.1ml至第2管，再次混合均勻，依上述方法連續(xù)稀釋至第12管。在96孔平底細胞培養(yǎng)盤中，將每個稀釋倍數(shù)的病毒液以每孔100μl的數(shù)量各接種8孔，接而加入100μl的兔腎細胞RK-13(以含5％胎牛血清的DMEM予以稀釋至2×105細胞/ml)，并置于37℃、5％CO2恒溫箱中反應(yīng)歷時72小時。之后，判讀細胞病變(CPE)的產(chǎn)生情形，并以李德-穆克方法(Reed-Muench Method)來計算TCID50病毒效價，俾供后續(xù)實驗的使用。
F、假性狂犬病gE缺損病毒的制備本實施例中所用的PR疫苗病毒是由高生制藥廠所提供，病毒來源是于民國七十八年(公元1989年)由桃園某養(yǎng)豬場罹患PR的病豬所分離出的強毒株(LC株)，該病毒經(jīng)DNA雜交、兔子接種試驗、抗體染色以及gE、gB糖蛋白分析后，被確定為PR病毒，然后再以遺傳工程方式將此PR病毒構(gòu)筑成gE糖蛋白基因缺損的PR病毒株，并以gE單克隆抗體作免疫染色而證明不具有g(shù)E糖蛋白，接而再以細胞培養(yǎng)來增殖病毒，而使每ml病毒液中所含病毒效價約為108TCID50以上，再加入0.1M二元次乙亞胺(Binary ethylenimine，BEI)至最終濃度為0.2％，并于37℃下進行滅活作用歷時10小時。
高生藥廠使用此病毒所制造的PRgE缺損滅活油劑(W/O/W)疫苗(病毒數(shù)量為≥108TCID50)，經(jīng)免疫于無PR抗體的兔子或豬后，均可產(chǎn)生抗PR野外株的中和抗體，但不會產(chǎn)生抗gE糖蛋白抗體。
G、PAR-PR雙價疫苗的制備將前述所制備的PAR疫苗抗原(含2.1m PMT重組型亞基蛋白質(zhì)、1×109CFU的滅活A型多殺巴斯德氏菌以及1×109CFU的滅活D型多殺巴斯德氏菌)以及gE缺損滅活PR病毒株(108TCID50)依等比例混和均勻，再加入已滅菌的油質(zhì)佐劑(W/O/W型)(由高生制藥股份有限公司提供)，制成每劑量2ml的油劑PAR-PR雙價疫苗。
H、血清中和試驗(serum neutralization test，SN test)PMT血清中和試驗于96孔平底細胞培養(yǎng)盤內(nèi)，將已滅活(56℃，30分鐘)的待測血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續(xù)稀釋。在每孔內(nèi)加入50μL經(jīng)稀釋的待測血清，繼而于各孔內(nèi)加入50μl的PMT(5X MTD)，然后將培養(yǎng)盤置于37℃、5％CO2恒溫箱中反應(yīng)歷時1小時。每個待測血清均作二個重復試驗。之后，于各孔中加入100μl Vero細胞(以含2％胎牛血清的DMEM調(diào)成3×105細胞/ml)，并將培養(yǎng)盤置于37℃、5％CO2恒溫箱中反應(yīng)歷時7天，而后以倒立顯微鏡來作觀察。能夠抑制節(jié)結(jié)樣細胞病變(CPE)出現(xiàn)的最高血清稀釋倍數(shù)，即為該血清的中和抗體效價。
PR血清中和試驗于96孔平底細胞培養(yǎng)盤內(nèi)，將已滅活的待測血清以不含胎牛血清的DMEM作2倍連續(xù)稀釋。在每孔內(nèi)加入50μL經(jīng)稀釋的待測血清，繼而于各孔中加入50μl含100TCID50(即2×103TCID50/ml)濃度的病毒液，并將培養(yǎng)盤置于37℃的恒溫箱中反應(yīng)歷時1小時。每個待測血清均作二個重復試驗。之后，于各孔內(nèi)加入100μl豬腎細胞PK-15[購自于食品工業(yè)發(fā)展研究所(FIRDI)，寄存編號為BCRC60057](以含5％胎牛血清的DMEM調(diào)成2×105細胞/ml)，并將培養(yǎng)盤置于37℃、5％CO2恒溫箱中反應(yīng)歷時3天。之后，以倒立顯微鏡來作觀察。能夠抑制融合樣細胞病變(CPE)出現(xiàn)的最高血清稀釋倍數(shù)，即為該血清的中和抗體效價。
除了豬腎細胞PK-15以外，本試驗也可使用兔腎細胞RK-13來進行。
I、PAR-PR雙價疫苗對小鼠的效力試驗PAR-PR雙價疫苗對抗多殺巴斯德氏菌的保護效力試驗對小鼠(BALB/c)皮下注射以0.2ml上面所制備的含油質(zhì)佐劑的PAR-PR雙價疫苗，進行兩次免疫且當中間隔20天，并于第2次免疫后20天進行攻擊試驗。免疫組于兩次免疫后分別被腹腔注射以2×106或2×107CFU/0.2ml的多殺巴斯德氏菌PMD-48活菌液，而對照組則分別被腹腔注射以2×102、2×102與2×104CFU/ml的多殺巴斯德氏菌PMD-48活菌液。在攻菌后連續(xù)觀察14天，并記錄小鼠的死亡時間，最后再以Behrens-Karber方程式來計算LD50，并換算成免疫組的防御指數(shù)。
PAR-PR雙價疫苗對抗PR的保護效力試驗對小鼠(BALB/c)皮下注射以0.2ml上面所制備的含油質(zhì)佐劑的PAR-PR雙價疫苗，進行兩次免疫且當中間隔20天，并于第2次免疫后20天進行攻擊試驗。免疫組與對照組都腹腔注射以10倍LD50PR病毒(TNL株)。在攻菌后連續(xù)觀察14天，并記錄小鼠的死亡時間。
J、PAR-PR雙價疫苗對兔子的免疫效力試驗選取平均體重二公斤的紐西蘭兔(New Zealand rabbit)共5只，3只以含有油劑的雙價疫苗來作免疫，而剩余的2只不做任何處理以作為對照組。以肌肉注射來施行免疫兩次而當中次間隔10天，注射部位為左后大腿肌肉，免疫劑量為2ml。兔子于免疫前以及兩次免疫后的第10天分別予以采血，以檢測兔血清對于PMT及PR的中和抗體效價。
上述6只已接受雙價疫苗免疫的兔子以及2只對照組兔子接著在兩次免疫后第17天以100倍LD50PR病毒(TNL株)來進行攻擊試驗，接種部位為右后大腿肌肉。攻擊后連續(xù)觀察10天，并記錄臨床癥狀以及死亡時間。整個實驗期間采任食飼養(yǎng)。10天后仍存活者予以安樂死，全部實驗兔子皆進行組織病理學檢查。
K、PAR-PR雙價疫苗的田間試驗PAR-PR雙價疫苗對懷孕母豬的免疫效力試驗于一個無發(fā)生PAR臨床病例的一貫養(yǎng)豬場(位于花蓮縣)進行PAR-PR雙價疫苗田間試驗。
自豬場選取懷孕約85天母豬共40頭，分成4組，第1組免疫2ml含有鋁膠佐劑雙價疫苗，第2組免疫4ml含有鋁膠佐劑雙價疫苗，第3組免疫2mI含有油質(zhì)佐劑雙價疫苗，第4組免疫4ml含有油質(zhì)佐劑雙價疫苗，四組皆以肌肉注射方式進行一次免疫，并于免疫后3周采血以檢測PMT及PR的中和抗體效價。
結(jié)果PAR-PR雙價疫苗對抗多殺巴斯德氏菌的保護效用試驗小鼠經(jīng)皮下注射本實施例所制備的PAR-PR雙價疫苗來作兩次免疫后14天，以7×107、7×106與7×105CFU/0.5ml的多殺巴斯德氏菌活菌液來作攻擊試驗，而對照組則是使用1.44×105、1.44×104與1.44×103CFU/0.5ml的多殺巴斯德氏菌活菌液。結(jié)果對照組小鼠的LD50為2.1×103CFU。至于免疫組的LD50為3.2×106CFU。因此，依據(jù)免疫組與對照組的LD50結(jié)果，免疫組的防御指數(shù)為1524[防御指數(shù)＝(3.2×106CFU/2.1×103CFU)]。表13顯示依據(jù)本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗對于小鼠的抗多殺巴斯德氏菌效力。
表13.PAR-PR雙價疫苗對于小鼠的多殺巴斯德氏菌效力試驗結(jié)果

*以Behrens-Karber方程式來計算對照組的LD50。
PAR-PR雙價疫苗對抗假性狂犬病毒的保護效用試驗小鼠經(jīng)皮下注射本實施例所制備的PAR-PR雙價疫苗來作兩次免疫，免疫后第14天，以5×105、5×104與5×103TCID50/0.5ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液來作攻擊試驗，而對照組則是使用1×104、1×103與1×102TCID50/0.5ml的假性狂犬病病毒TNL株病毒液。結(jié)果對照組小鼠的LD50為429TCID50。至于免疫組的LD50為＞5×105TCID50。因此，依據(jù)免疫組與對照組的LD50結(jié)果，免疫組的防御指數(shù)為大于1166[防御指數(shù)＝(＞5×105TCID50/429TCID50)]。表14顯示依據(jù)本發(fā)明的PAR-PR雙價疫苗對于小鼠的抗假性狂犬病病毒效力。
表14.PAR-PR雙價疫苗對于小鼠的假性狂犬病病毒效力試驗結(jié)果

*以Behrens-Karber方程式來計算對照組的LD50。
PAR-PR雙價疫苗對于兔子的免疫效用對照組的兔子于攻擊前的PMT中和抗體效價平均值為32倍，而PR中和抗體呈陰性反應(yīng)(＜2倍)。以含油質(zhì)佐劑的雙價疫苗予以免疫的兔子在免疫前的PMT中和抗體效價平均值為86倍，而PR中和抗體為5.33倍；而經(jīng)兩次免疫后，PMT中和抗體效價的平均升高為130.67倍，而PR中和抗體為74.6倍(圖21和22)。
經(jīng)兩次免疫的兔子連同對照組以100倍LD50PR病毒(TNL株)進行攻擊，結(jié)果以含油質(zhì)佐劑的雙價疫苗予以免疫的兔子于攻擊后第8天有1只死亡，而對照組的2只兔子在攻擊后第4天皆出現(xiàn)劇癢癥狀并死亡(表15)。
表15.PAR-PR雙價疫苗對于兔子的PR保護效用試驗結(jié)果

死亡的兔子在組織病變中可見劇癢部位的大腿肌肉出血、氣管粘膜層出血、肺泡腔內(nèi)充滿粉紅均質(zhì)的水腫液，其中以含鋁膠佐劑的雙價疫苗予以免疫并在攻擊后第5天死亡的兔子其肝臟呈多發(fā)局部性壞死灶。
PAR-PR雙價疫苗對懷孕母豬的免疫效力將含鋁膠佐劑與油質(zhì)佐劑的雙價疫苗分成2ml及4ml兩種劑量且以肌肉注射來免疫懷孕母豬，并于免疫后3周采血以檢測PMT及PR中和抗體效價。在含鋁膠佐劑的雙價疫苗方面，以2ml劑量予以免疫的母豬所測得的PMT中和抗體效價平均為88.4倍，而PR中和抗體效價平均為90.4倍；以4ml劑量予以免疫的母豬所測得的PMT中和抗體平均效價為75.2倍，而PR中和抗體平均效價為99.2倍。在含油質(zhì)佐劑的雙價疫苗方面，以2ml劑量予以免疫的母豬所測得的PMT中和抗體平均效價為88.8倍，而PR中和抗體平均效價為92.8倍；以4ml劑量予以免疫的母豬所測得的PMT中和抗體平均效價為101.2倍，而PR中和抗體平均效價為110.5倍(圖23和24)。
在本實施例中所使用的PAR疫苗組份與PR疫苗組份，以小鼠來分別進行安全性與免疫效力試驗，結(jié)果證實這兩個疫苗組份皆具有良好的保護效力。將兩種疫苗組份以鋁佐劑膠或油質(zhì)佐劑混合成PAR-PR雙價疫苗再進一步檢測其對小鼠的免疫效用，結(jié)果證實PAR-PR雙價疫苗對PR病毒的攻擊也可產(chǎn)生良好保護性。
進一步在分析不同佐劑對抗體揚升的比較上，兔子經(jīng)含油質(zhì)佐劑的雙價疫苗予以免疫時所測得的抗PMT和PR中和抗體效價平均值則分別為130.67倍和74.6倍。
此外，在豬場的田間試驗中，懷孕母豬經(jīng)以含鋁膠佐劑或油質(zhì)佐劑的雙價疫苗免疫后，所產(chǎn)生的PAR與PR抗體效價均可揚升至64倍以上(圖23與24)，這顯示雙價疫苗能使母豬產(chǎn)生良好免疫保護的中和抗體效價，且由經(jīng)免疫的母豬所分娩的新生仔豬也能通過移行抗體而避免PAR與PR的早期感染。
于本說明書中被引述的所有文獻資料與專利案以其整體被并入本案作為參考資料。若有所沖突時，本案的詳細說明(包含界定在內(nèi))將占上風。
雖然本發(fā)明已參考上述特定的實施方案被描述，明顯地在不背離本發(fā)明的范圍和精神的下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發(fā)明僅受如隨文檢附的權(quán)利要求書中所示者的限制。
序列表<110>簡茂盛<120>豬進行性萎縮性鼻炎的預防、治療與檢測<130>PE-27009-CM<160>13<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>4380<212>DNA<213>多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)<220>
<221>CDS<222>(219)..(4076)<400>1aacaagggaa aatagctaga ttagacgata tcgataatat cataaataat atttaaaaat60tacgcccctt gacctagagg ggctttttta ttacatcaaa aaaataaacc caaacactgc120gaatgtttgg ggttttattt ataaccaaaa tacattaata tgtttattaa gtaagcatta180tcttacttta ggaataaact aacatagagg ttatggat atg aaa aca aaa cat ttt236Met Lys Thr Lys His Phe1 5ttt aac tca gat ttt act gta aaa gga aaa agt gcc gat gaa att ttt 284Phe Asn Ser Asp Phe Thr Val Lys Gly Lys Ser Ala Asp Glu Ile Phe10 15 20aga aga ttg tgt act gat cat cct gac aag caa tta aac aat gta aaa 332Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Pro Asp Lys Gln Leu Asn Asn Val Lys25 30 35tgg aaa gaa gtt ttt att aat cgt ttt ggt cag atg atg cta gat act 380Trp Lys Glu Val Phe Ile Asn Arg Phe Gly Gln Met Met Leu Asp Thr40 45 50cct aat ccg aga aag att gta gaa aaa att att aat gaa ggg ctt gaa 428Pro Asn Pro Arg Lys Ile Val Glu Lys Ile Ile Asn Glu Gly Leu Glu55 60 65 70aaa caa ggc ctg aaa aat ata gat cct gaa act aca tat ttc aac att 476Lys Gln Gly Leu Lys Asn Ile Asp Pro Glu Thr Thr Tyr Phe Asn Ile75 80 85ttt tca tct tct gac agc tcc gat ggg aac gtt ttt cat tat aac tct 524Phe Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Asn Val Phe His Tyr Asn Ser90 95 100tta tca gaa tcc tat cga gtt act gat gcc tgc cta atg aat att ttt 572Leu Ser Glu Ser Tyr Arg Val Thr Asp Ala Cys Leu Met Asn Ile Phe105 110 115gtg gag cgt tat ttt gat gat tgg gac ttg cta aat agc tta gcc agt 620Val Glu Arg Tyr Phe Asp Asp Trp Asp Leu Leu Asn Ser Leu Ala Ser
120 125 130aat gga ata tat tca gta gga aaa gaa gga gct tat tat cct gat cat 668Asn Gly Ile Tyr Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His135 140 145 150gat tat ggt cca gaa tat aac cct gtt tgg gga cca aac gaa caa att 716Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile155 160 165tac cat tct aga gtg att gca gat atc ctt tat gct cgc tcc gta tgg 764Tyr His Ser Arg Val Ile Ala Asp Ile Leu Tyr Ala Arg Ser Val Trp170 175 180gat gaa ttt aaa aaa tac ttc atg gag tat tgg caa aaa tat gct cag 812Asp Glu Phe Lys Lys Tyr Phe Met Glu Tyr Trp Gln Lys Tyr Ala Gln185 190 195ctt tat acc gaa atg tta tct gat aca ttt ctt gca atg gct att cag 860Leu Tyr Thr Glu Met Leu Ser Asp Thr Phe Leu Ala Met Ala Ile Gln200 205 210caa tat aca cga caa acg ctt act gat gaa ggc ttt ctt atg gtt tgt 908Gln Tyr Thr Arg Gln Thr Leu Thr Asp Glu Gly Phe Leu Met Val Cys215 220 225 230aac aca tat tat ggc aat aag gaa gaa gtt caa ata act cta cta gat 956Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Lys Glu Glu Val Gln Ile Thr Leu Leu Asp235 240 245atc tat gga tac cct tcc act gat ata att tgt ata gag caa aaa ggg 1004Ile Tyr Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Ile Ile Cys Ile Glu Gln Lys Gly250 255 260ctt cct act cct aaa gtg ata ctt tac att cct gga gga aca caa cca 1052Leu Pro Thr Pro Lys Val Ile Leu Tyr Ile Pro Gly Gly Thr Gln Pro265 270 275ttt gtt gaa ttt ctt aat aca gat gat ctg aaa caa tgg att gca tgg 1100Phe Val Glu Phe Leu Asn Thr Asp Asp Leu Lys Gln Trp Ile Ala Trp280 285 290cat tta aaa gat aac aaa cat atg gtc cga ttc cgc aaa cat ttc tcg 1148His Leu Lys Asp Asn Lys His Met Val Arg Phe Arg Lys His Phe Ser295 300 305 310cta aaa caa cgt cag gaa gga gaa acg ttt aca ggt ata gat aaa gca 1196Leu Lys Gln Arg Gln Glu Gly Glu Thr Phe Thr Gly Ile Asp Lys Ala315 320 325ctt caa tat att gca gaa gag tcc cct gaa tgg cct gcc aat aaa tac 1244Leu Gln Tyr Ile Ala Glu Glu Ser Pro Glu Trp Pro Ala Asn Lys Tyr330 335 340atc ctt tat aat ccg aca cat tta gaa aca gaa aat tta ttt aac atc 1292Ile Leu Tyr Asn Pro Thr His Leu Glu Thr Glu Asn Leu Phe Asn Ile345 350 355atg atg aag cga aca gaa cag cgg atg ctt gaa gat agt gat gta cag 1340
Met Met Lys Arg Thr Glu Gln Arg Met Leu Glu Asp Ser Asp Val Gln360 365 370att aga tca aat tca gaa gct acc cgt gac tat gct ctt tca tta ctc 1388Ile Arg Ser Asn Ser Glu Ala Thr Arg Asp Tyr Ala Leu Ser Leu Leu375 380 385 390gaa acc ttt att tca cag tta tct gca ata gat atg tta gta cca gca 1436Glu Thr Phe Ile Ser Gln Leu Ser Ala Ile Asp Met Leu Val Pro Ala395 400 405gta ggt atc cca att aat ttt gcc cta tca gct aca gca tta gga ctt 1484Val Gly Ile Pro Ile Asn Phe Ala Leu Ser Ala Thr Ala Leu Gly Leu410 415 420agc tcg gat att gta gtt aat gga gat tca tat gaa aag aga aaa tat 1532Ser Ser Asp Ile Val Val Asn Gly Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Lys Tyr425 430 435gga att ggg tcc tta gtg caa tct gca tta ttc aca gga att aat ctt 1580Gly Ile Gly Ser Leu Val Gln Ser Ala Leu Phe Thr Gly Ile Asn Leu440 445 450att cca gtt att tcg gaa acc gca gaa att tta tct tct ttc tct aga 1628Ile Pro Val Ile Ser Glu Thr Ala Glu Ile Leu Ser Ser Phe Ser Arg455 460 465 470aca gaa gaa gat att cca gct ttt ttc act gaa gaa caa gct tta gct 1676Thr Glu Glu Asp Ile Pro Ala Phe Phe Thr Glu Glu Gln Ala Leu Ala475 480 485caa cgc ttt gaa ata gta gaa gaa gaa tta cat tct atc tca cct gat 1724Gln Arg Phe Glu Ile Val Glu Glu Glu Leu His Ser Ile Ser Pro Asp490 495 500gat cct cct cga gaa att act gac gaa aat tta cat aaa att cgt ctg 1772Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Glu Asn Leu His Lys Ile Arg Leu505 510 515gta cgt ctt aac aat gaa aat caa cct tta gtt gtg tta cga aga tta 1820Val Arg Leu Asn Asn Glu Asn Gln Pro Leu Val Val Leu Arg Arg Leu520 525 530gga gga aat aaa ttt atc aga atc gag cct ata aca ttc cag gaa ata 1868Gly Gly Asn Lys Phe Ile Arg Ile Glu Pro Ile Thr Phe Gln Glu Ile535 540 545 550aaa ggt tct tta gta agt gaa gtt ata aat cca gtg act aat aaa acg 1916Lys Gly Ser Leu Val Ser Glu Val Ile Asn Pro Val Thr Asn Lys Thr555 560 565tac tac gta agc aat gct aaa cta tta ggg ggc tct cct tat agt cct 1964Tyr Tyr Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Ser Pro570 575 580ttc cgt att gga tta gaa ggt gtt tgg aca cca gag gta tta aaa gca 2012Phe Arg Ile Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr Pro Glu Val Leu Lys Ala585 590 595
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gca cta taa ctaattaaaa actgtattaa agccttatat tataaggctt 4116Ala Leu1285taattttctt tcaagaatta ttaagtagaa gaatcaaaat caatgagata gataaaatca4176aatgttatta ccaatacaac tttcttaagt atactttttg aattttttgc gttaataaat4236ttataatacc cttaactcaa taaaagaagt tattgagaag tttaaatctt gtgagcaaga4296tgaagatata atttcagcaa tcgatcttat tagcgcttca tatagaaggg ctgtggatgc4356agtggaacaa agattcggtt ctag 4380<210>2<211>1285<212>PRT<213>多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)<400>2Met Lys Thr Lys His Phe Phe Asn Ser Asp Phe Thr Val Lys Gly Lys1 5 10 15Ser Ala Asp Glu Ile Phe Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Pro Asp Lys20 25 30Gln Leu Asn Asn Val Lys Trp Lys Glu Val Phe Ile Asn Arg Phe Gly35 40 45Gln Met Met Leu Asp Thr Pro Asn Pro Arg Lys Ile Val Glu Lys Ile50 55 60Ile Asn Glu Gly Leu Glu Lys Gln Gly Leu Lys Asn Ile Asp Pro Glu65 70 75 80Thr Thr Tyr Phe Asn Ile Phe Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Asn85 90 95Val Phe His Tyr Asn Ser Leu Ser Glu Ser Tyr Arg Val Thr Asp Ala100 105 110Cys Leu Met Asn Ile Phe Val Glu Arg Tyr Phe Asp Asp Trp Asp Leu115 120 125Leu Asn Ser Leu Ala Ser Asn Gly Ile Tyr Ser Val Gly Lys Glu Gly130 135 140Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp145 150 155 160Gly Pro Asn Glu Gln Ile Tyr His Ser Arg Val Ile Ala Asp Ile Leu165 170 175Tyr Ala Arg Ser Val Trp Asp Glu Phe Lys Lys Tyr Phe Met Glu Tyr180 185 190Trp Gln Lys Tyr Ala Gln Leu Tyr Thr Glu Met Leu Ser Asp Thr Phe195 200 205Leu Ala Met Ala lle Gln Gln Tyr Thr Arg Gln Thr Leu Thr Asp Glu210 215 220Gly Phe Leu Met Val Cys Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Lys Glu Glu Val225 230 235 240
Gln Ile Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Ile Ile245 250 255Cys Ile Glu Gln Lys Gly Leu Pro Thr Pro Lys Val Ile Leu Tyr Ile260 265 270Pro Gly Gly Thr Gln Pro Phe Val Glu Phe Leu Asn Thr Asp Asp Leu275 280 285Lys Gln Trp Ile Ala Trp His Leu Lys Asp Asn Lys His Met Val Arg290 295 300Phe Arg Lys His Phe Ser Leu Lys Gln Arg Gln Glu Gly GluThr Phe305 310 315320Thr Gly Ile Asp Lys Ala Leu Gln Tyr Ile Ala Glu Glu Ser Pro Glu325 330 335Trp Pro Ala Asn Lys Tyr Ile Leu Tyr Asn Pro Thr His Leu Glu Thr340 345 350Glu Asn Leu Phe Asn Ile Met Met Lys Arg Thr Glu Gln Arg Met Leu355 360 365Glu Asp Ser Asp Val Gln Ile Arg Ser Asn Ser Glu Ala Thr Arg Asp370 375 380Tyr Ala Leu Ser Leu Leu Glu Thr Phe Ile Ser Gln Leu Ser Ala Ile385 390 395 400Asp Met Leu Val Pro Ala Val Gly Ile Pro Ile Asn Phe Ala Leu Ser405 410 415Ala Thr Ala Leu Gly Leu Ser Ser Asp Ile Val Val Asn Gly Asp Ser420 425 430Tyr Glu Lys Arg Lys Tyr Gly Ile Gly Ser Leu Val Gln Ser Ala Leu435 440 445Phe Thr Gly Ile Asn Leu Ile Pro Val Ile Ser Glu Thr Ala Glu Ile450 455 460Leu Ser Ser Phe Ser Arg Thr Glu Glu Asp Ile Pro Ala Phe Phe Thr465 470 475 480Glu Glu Gln Ala Leu Ala Gln Arg Phe Glu Ile Val Glu Glu Glu Leu485 490 495His Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Glu Asn500 505 510Leu His Lys Ile Arg Leu Val Arg Leu Asn Asn Glu Asn Gln Pro Leu515 520 525Val Val Leu Arg Arg Leu Gly Gly Asn Lys Phe Ile Arg Ile Glu Pro530 535 540Ile Thr Phe Gln Glu Ile Lys Gly Ser Leu Val Ser Glu Val Ile Asn545 550 555 560Pro Val Thr Asn Lys Thr Tyr Tyr Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly565 570 575Gly Ser Pro Tyr Ser Pro Phe Arg Ile Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr580 585 590
Pro Glu Val Leu Lys Ala Arg Ala Ser Val Ile Gly Lys Pro Ile Gly595 600 605Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Leu Ala Lys Leu Gln Arg Ile His Asn Ser610 615 620Asn Ile Leu Asp Glu Arg Gln Gly Leu Met His Glu Leu Met Glu Leu625 630 635 640Ile Asp Leu Tyr Glu Glu Ser Gln Pro Ser Ser Glu Arg Leu Asn Ala645 650 655Phe Arg Glu Leu Arg Thr Gln Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Leu Pro Glu660 665 670Met Glu Ala Leu Lys Lys Gln Ile Leu Gln Ile Pro Asn Lys Gly Ser675 680 685Gly Ala Ala Arg Phe Leu Leu Arg Thr Ala Met Asn Glu Met Ala Gly690 695 700Lys Thr Ser Glu Ser Thr Ala Asp Leu Ile Arg Phe Ala Leu Gln Asp705 710 715 720Thr Val Ile Ser Ala Pro Phe Arg Gly Tyr Ala Gly Ala Ile Pro Glu725 730 735Ala Ile Asp Phe Pro Val Lys Tyr Val Ile Glu Asp Ile Ser Val Phe740 745 750Asp Lys Ile Gln Thr Asn Tyr Trp Glu Leu Pro Ala Tyr Glu Ser Trp755 760 765Asn Glu Gly Ser Asn Ser Arg Leu Leu Pro Gly Leu Leu Arg Glu Ser770 775 780Gln Ser Lys Gly Met Leu Ser Lys Cys Arg Ile Ile Glu Asn Ser Leu785 790 795 800Tyr Ile Gly His Ser Tyr Glu Glu Met Phe Tyr Ser Ile Ser Pro Tyr805 810 815Ser Asn Gln Val Gly Gly Pro Tyr Glu Leu Tyr Pro Phe Thr Phe Phe820 825 830Ser Met Leu Gln Glu Val Gln Gly Asp Leu Gly Phe Glu Gln Ala Phe835 840 845Ala Thr Arg Asn Phe Phe Asn Thr Leu Val Ser Asp Arg Leu Ser Leu850 855 860Met Glu Asn Thr Met Leu Leu Thr Glu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Trp865 870 875 880Asp Ala Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Tyr Asp Glu Gln Phe Ala Ala Met885 890 895Ser Ile Asn Glu Arg Ile Glu Lys Cys Met Asn Thr Tyr Arg Gly Val900 905 910Ala Phe Gln Asn Ser Ser Lys Ser Ile Asp Phe Phe Leu Asn Asn Leu915 920 925Thr Thr Phe Ile Asp Asn Gly Leu Thr Glu Ile Ala Ile Ser Asp Leu930 935 940
Pro Tyr Asp Ile Val Gln Gln Glu Ile Ser Gln Phe Leu Gln Gly Ser945 950 955 960Asn Glu Trp Lys Thr Leu Asp Ala Met Leu Phe Asn Leu Asp Lys Gly965 970 975Asp Ile Asn Gly Ala Phe Arg Lys Leu Leu Gln Ser Ala Lys Asp Asn980 985 990Asn Ile Lys Phe Arg Ala Ile Gly His Ser Asp Asn Ser Val Pro Pro995 1000 1005Phe Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile1010 1015 1020Ala Glu Ala Ile Glu Lys Leu Asp Arg Glu Gly Gln Lys Phe Val1025 1030 1035Val Phe Ala Asp Ser Ser Leu Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly1040 1045 1050Arg Pro Met Pro Gly Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ile Pro Ala Thr1055 1060 1065Val Val Asp Ser Asp Gly Ala Trp Gln Phe Leu Pro Asp Val Ala1070 1075 1080Ser Ser Arg Val Pro Ile Glu Val Thr Glu Leu Glu Asn Trp Gln1085 1090 1095Val Leu Thr Pro Pro Gln Gly Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gln Phe1100 1105 1110Lys Leu Thr Ala Gly Phe Pro Thr Glu Gln Ser Arg Leu Pro Leu1115 1120 1125Leu Glu Asn Ser Val Ser Glu Asp Leu Arg Glu Glu Leu Met Gln1130 1135 1140Lys Ile Asp Ala Ile Lys Asn Asp Val Lys Met Asn Ser Leu Val1145 1150 1155Cys Met Glu Ala Gly Ser Cys Asp Ser Val Ser Pro Lys Val Ala1160 1165 1170Ala Arg Leu Lys Asp Met Gly Leu Glu Ala Gly Met Gly Ala Ser1175 1180 1185Ile Thr Trp Trp Arg Arg Glu Gly Gly Met Glu Phe Ser His Gln1190 1195 1200Met His Thr Thr Ala Ser Phe Lys Phe Ala Gly Lys Glu Phe Ala1205 1210 1215Val Asp Ala Ser His Leu Gln Phe Val His Asp Gln Leu Asp Thr1220 1225 1230Thr Ile Leu Ile Leu Pro Val Asp Asp Trp Ala Leu Glu Ile Ala1235 1240 1245Gln Arg Asn Arg Ala Ile Asn Pro Phe Val Glu Tyr Val Ser Lys1250 1255 1260Thr Gly Asn Met Leu Ala Leu Phe Met Pro Pro Leu Phe Thr Lys1265 1270 1275
Pro Arg Leu Thr Arg Ala Leu1280 1285<210>3<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引物<400>3agaggttatg gatccgaaaa caaaacattt t31<210>4<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引物<400>4atagtagaag aagaattaca 20<210>5<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引物<400>5ctaacataga ggccatggat atgaaaacaa aaca 34<210>6<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引物<400>6acttcgtaca gccatgaatg aaatggctgg aaaa 34<210>7<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成前向引物<400>7actcaattag aaaaagcgct 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引物<400>8ctactacagt tgctggtatt 20<210>9<211>22<212>
<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引物<400>9attgttaaga cgtaccagac ga 22<210>10<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引物<400>10ctcttgttaa gctagccttt gtgaaaagag gag 33<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引物<400>11ttcttccctt aaatcttcag 20<210>12<211>32<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>多殺性巴氏桿菌毒素編碼基因的合成反向引物<400>12tcactggttt ttccagccatttcat tcatg gc 32<210>13<211>10<212>DNA<213>人工的<220>
<223>合成的隨機引物<400>13aagcggcctc10
權(quán)利要求
1.一種針對進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophicrhinitis，PAR)的動物用疫苗，其特征在于該疫苗包含(a)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)毒素蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗可供用于防治豬的進行性萎縮性鼻炎。
3.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT蛋白質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD 48的PMT蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是合成產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是重組型產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該多肽組份(a)為一第一DNA片段所編碼，該第一DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以下面正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶BamHI與HindIII切割后所形成的一個1456bp BamHI-HindIII片段所具有的核苷酸序列正向引物A15′agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO3)反向引物B25′-ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ ID NO10)。
9.如權(quán)利要求8的動物用疫苗，其特征在于該第一DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第一重組型載體。
10.如權(quán)利要求9的動物用疫苗，其特征在于該第一重組型載體是重組型載體Tox1。
11.如權(quán)利要求9的動物用疫苗，其特征在于該第一重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
12.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該多肽組份(b)為一第二DNA片段所編碼，該第二DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以如權(quán)利要求8中所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII切割后所形成的一個1502bp HindIII-HindIII片段所具有的核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求12的動物用疫苗，其特征在于該第二DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第二重組型載體。
14.如權(quán)利要求13的動物用疫苗，其特征在于其中該第二重組型載體是重組型載體Tox2。
15.如權(quán)利要求13的動物用疫苗，其特征在于該第二重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
16.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該多肽組份(c)為一第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以如權(quán)利要求8中所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII與NheI切割后所形成的一個883bp HindIII-NheI片段所具有的核苷酸序列。
17.如權(quán)利要求16的動物用疫苗，其特征在于該第三DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第三重組型載體。
18.如權(quán)利要求17的動物用疫苗，其特征在于該第三重組型載體是重組型載體Tox7。
19.如權(quán)利要求17的動物用疫苗，其特征在于該第三重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(c)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
20.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗進一步包含下列的至少一者多殺巴斯德氏菌毒素類毒素、A型多殺巴斯德氏菌細胞、D型多殺巴斯德氏菌細胞以及支氣管炎博德特氏菌細胞。
21.如權(quán)利要求1的動物用疫苗，其特征在于該疫苗進一步包含一選自于下列一組中的佐劑弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁膠、油質(zhì)佐劑(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳劑、水包油型(O/W)乳劑、刀豆素A、β-葡聚糖，以及此等的一個組合。
22.一種能防治至少進行性萎縮性鼻炎的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗包含(i)與進行性萎縮性鼻炎有關(guān)的抗原組份(a)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素蛋白質(zhì)的2-486氨基酸殘基；(b)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素蛋白質(zhì)的486-986氨基酸殘基；以及(c)一多肽，其具有的氨基酸序列大體上對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素蛋白質(zhì)的986-1281氨基酸殘基；以及(ii)至少一種與其它的動物疾病有關(guān)聯(lián)的病原性抗原或其抗原表位。
23.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗可供用于防治豬的進行性萎縮性鼻炎。
24.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌A型分離株的PMT蛋白質(zhì)。
25.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株的PMT蛋白質(zhì)。
26.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是衍生自多殺巴斯德氏菌D型分離株P(guān)MD 48的PMT蛋白質(zhì)。
27.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是合成產(chǎn)物。
28.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗所包含的三種多肽組份是重組型產(chǎn)物。
29.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該多肽組份(a)為一第一DNA片段所編碼，該第一DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以下面正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶BamHI與HindIII切割后所形成的一個1456bp BamHI-HindIII片段所具有的核苷酸序列正向引物A15′-agaggttatggatccgaaaacaaaacatttt-3′(SEQ ID NO3)反向引物B25′ctcttgttaagctagcctttgtgaaaagaggag-3′(SEQ ID NO10)。
30.如權(quán)利要求29的動物用多價疫苗，其特征在于該第一DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第一重組型載體。
31.如權(quán)利要求30的動物用多價疫苗，其特征在于該第一重組型載體是重組型載體Tox1。
32.如權(quán)利要求30的動物用多價疫苗，其特征在于該第一重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(a)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
33.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該多肽組份(b)為一第二DNA片段所編碼，該第二DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以如權(quán)利要求29中所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII切割后所形成的一個1502bp HindIII-HindIII片段所具有的核苷酸序列。
34.如權(quán)利要求33的動物用多價疫苗，其特征在于該第二DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第二重組型載體。
35.如權(quán)利要求34的動物用多價疫苗，其特征在于該第二重組型載體是重組型載體Tox2。
36.如權(quán)利要求34的動物用多價疫苗，其特征在于該第二重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
37.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該多肽組份(c)為一第三DNA片段所編碼，該第三DNA片段具有一核苷酸序列是實質(zhì)地對應(yīng)于以PMT編碼基因作為模板并以如權(quán)利要求29中所述的正向引物A1與反向引物B2來進行PCR后所得到的PCR擴增產(chǎn)物以限制酶HindIII與NheI切割后所形成的一個883bp HindIII-NheI片段所具有的核苷酸序列。
38.如權(quán)利要求37的動物用多價疫苗，其特征在于該第三DNA片段被插入于一載體內(nèi)而形成一第三重組型載體。
39.如權(quán)利要求38的動物用多價疫苗，其特征在于該第三重組型載體是重組型載體Tox7。
40.如權(quán)利要求38的動物用多價疫苗，其特征在于該第三重組型載體被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌細胞內(nèi)，因而形成能生成該多肽組份(c)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
41.如權(quán)利要求38的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗包含滅活的假性狂犬病gE缺損病毒作為組份(ii)，以供防治假性狂犬病。
42.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗進一步包含下列一組中的至少一員多殺巴斯德氏菌毒素類毒素、A型多殺巴斯德氏菌細胞、D型多殺巴斯德氏菌細胞以及支氣管炎博德特氏菌細胞。
43.如權(quán)利要求22的動物用多價疫苗，其特征在于該疫苗進一步包含一選自于下列一組中的佐劑弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鋁膠、油質(zhì)佐劑(W/O/W型)、油包水型(W/O)乳劑、水包油型(O/W)乳劑、刀豆素A、β-葡聚糖，以及此等的一個組合。
全文摘要
本發(fā)明揭示針對進行性萎縮性鼻炎(progressiveatrophic rhinitis，PAR)的動物用疫苗，其包含三種可激發(fā)對抗多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida，與進行性萎縮性鼻炎有關(guān)聯(lián))的抗體的生成的多肽以作為活性組份，這些多肽各自具有一氨基酸序列，其大體上分別對應(yīng)于多殺巴斯德氏菌毒素(PMT)蛋白質(zhì)的2－486、486－986或986－1281氨基酸殘基。本發(fā)明也揭示能防治至少PAR的動物用多價疫苗，其包含上述三種針對PAR的多肽以及至少一種與其它的動物疾病有關(guān)聯(lián)的病原性抗原或其抗原表位。
文檔編號A61P11/02GK1736479SQ200410057590
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者簡茂盛, 廖志明, 劉正義 申請人:簡茂盛