一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的疫苗組合物及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的疫苗組合物，該疫苗組合物包括：免疫量的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原；免疫量的多殺性巴氏桿菌抗原；免疫量的支氣管敗血波氏桿菌抗原；以及佐劑。該疫苗組合物具有安全性能高、免疫原性好、免疫期長、成本低等優(yōu)點，并能降低成本，降低免疫勞動量，減少動物應(yīng)激。
【專利說明】一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的疫苗 組合物及制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的疫苗組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬傳染性胸膜肺炎、豬多殺性巴氏桿菌病和豬萎縮性鼻炎是常見的豬呼吸道系統(tǒng) 疾病。豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌（APP)引起的豬的一種高度致死性呼吸道 傳染病，世界各國均有發(fā)生。本病主要引起豬發(fā)生伴有胸膜炎的出血性、壞死性肺炎，多呈 最急性或急性病程而迅速致死。該病可發(fā)生于任何年齡的豬只，尤其在集約化養(yǎng)豬場，一旦 發(fā)生會造成重大的經(jīng)濟損失。
[0003] 豬巴氏桿菌?。╯wine pasteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌引起的一種傳染病， 又名豬肺疫、豬出血性敗血癥，俗稱"鎖喉風"。該病的最急性型其特征呈敗血癥變化，咽喉 部急性腫脹，呼吸高度困難。該病的急性型其特征呈纖維素性胸膜肺炎癥狀。慢性型癥狀 不明顯，多為慢性肺炎、胃腸炎以及逐漸消瘦，有時伴發(fā)關(guān)節(jié)炎，在國外又將該型稱為肺炎 巴氏桿菌病。該病廣泛分布于世界各地，是豬的一種常見傳染病。發(fā)病率達40%，死亡率在 5%左右。多殺性巴氏桿菌按莢膜可分為A、B、D、E和F五種莢膜抗原血清型。在美國及歐 洲一些國家，流行的豬多殺性巴氏桿菌病多以莢膜A型菌為主，其次是莢膜D型菌，B型菌 所占比例較少。而在我國，過去流行的菌株多以B型為主，由于長期用B型菌苗免疫，取得 較好的效果，B型菌株引起的多殺性巴氏桿菌病已較少發(fā)生。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)?；l(fā) 展，A型和D型菌株在我國也呈流行趨勢，并在一些地區(qū)已造成一定危害，并隨著我國集約 化養(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬群巴氏桿菌病的報道逐漸增多。
[0004] 豬萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis, AR)是豬群的一種重要的呼吸系統(tǒng)傳染病，它 會引起豬的慢性鼻炎、打噴嚏、流眼淚、顏部變性和鼻甲骨萎縮等癥狀，嚴重的還可以導致 鼻吻變形并影響全身骨骼發(fā)育，從而導致豬生長遲緩，使豬容易感染繼發(fā)性復合性肺炎，給 養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。該病可感染任何年齡階段的豬，其中4周齡以內(nèi)的豬感染率最高， 癥狀一般出現(xiàn)在8-12周齡。
[0005] 豬萎縮性鼻炎可分為進行性豬萎縮性鼻炎（progressive atrophic rhinitis, PAR)和非進行性豬萎縮性鼻炎（nonprogressive atrophic rhinitis, NPAR)。進 行性豬萎縮性鼻炎主要由產(chǎn)毒素多殺性巴士桿菌（toxigenic Pasteurella multocida)引 起，病原通常為莢膜D型或A型，或與波氏桿菌共同感染引起。非進行性豬萎縮性鼻炎則單 純由支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica)引起，其通常只引起輕微的鼻甲 骨萎縮，往往觀察不到鼻吻部的典型病變。進行性豬萎縮性鼻炎給養(yǎng)豬業(yè)帶來的危害十分 巨大。
[0006] 采用疫苗進行免疫預防是國內(nèi)外控制豬傳染性胸膜肺炎、豬多殺性巴氏桿菌病和 豬萎縮性鼻炎的根本手段，而市場銷售的商品疫苗只有豬傳染性胸膜肺炎滅活疫苗單苗， 豬多殺性巴氏桿菌單苗和活苗，豬萎縮性鼻炎滅活疫苗單苗。這些疫苗的應(yīng)用起到了一定 的預防作用，但疫苗的免疫效果不太理想并且保護期較短，同時弱毒苗有不易保存和存在 散毒的風險等問題。
[0007] 豬傳染性胸膜肺炎疫苗免疫程序為仔豬35?40日齡進行第1次免疫接種，首免 后4周加強免疫1次，豬多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗免疫程序為豬30日齡內(nèi)一次免疫4ml ; 而豬萎縮性鼻炎滅活苗的免疫程序為在7?10日齡進行第1次免疫接種，首免后2周加強 免疫1次，市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應(yīng)激較大；隨著病原流行株和混 合感染已經(jīng)使現(xiàn)有疫苗很難達到預期的免疫效果，另外同時針對控制豬傳染性胸膜肺炎、 豬多殺性巴氏桿菌病和豬萎縮性鼻炎的疫苗，國內(nèi)外也還是空白。并且，發(fā)明人在重現(xiàn)一種 豬的繼發(fā)感染豬傳染性胸膜肺炎的非進行性豬萎縮性鼻炎試驗時發(fā)現(xiàn)，存在檢測不到支 氣管敗血波氏桿菌病原的情況，但是仍然偶爾有輕微的非進行性豬萎縮性鼻炎的癥狀；而 當有外源產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌莢膜A型或D型病原侵入時，常常會引起嚴重的繼發(fā)感染 豬傳染性胸膜肺炎混合進行性萎縮性鼻炎的綜合呼吸系統(tǒng)疾病，而發(fā)明人在檢測時，依然 沒有檢測到支氣管敗血波氏桿菌病原。
[0008] 此外，因疫苗的生產(chǎn)、運輸、儲存、銷售等環(huán)節(jié)均需在較低溫度下進行，使用聯(lián)合疫 苗可以使成本降低。因此，本領(lǐng)域需要能產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答以同時抵抗豬傳染性胸膜肺 炎和多殺性巴氏桿菌及支氣管波氏桿菌感染的疫苗，減少所述感染的發(fā)生率和/或減輕所 述感染的嚴重性，或預防與所述感染有關(guān)的臨床表現(xiàn)。聯(lián)合疫苗不僅方便、多效、低成本， 與單一疫苗相比，還可以減少疫苗接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗 大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、存貯、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的 "冷鏈"，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可 以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物可以很好 地預防由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾??；本發(fā)明疫苗具有安全性能高、免疫原性好、免疫 期長、成本低等優(yōu)點，并能降低成本，降低免疫勞動量，減少動物應(yīng)激。
[0010] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病 的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括：
[0011] 免疫量的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原；免疫量的多殺性巴氏桿菌抗原；免疫 量的支氣管敗血波氏桿菌抗原；以及佐劑。
[0012] 所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原是指含有至少一種豬傳染性胸膜肺炎放線 桿菌抗原形式的任何組合物，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原接種豬可誘導、刺激或 增強抵抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染的免疫應(yīng)答。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌包括 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的生物I型1?12個血清型。
[0013] 所述豬巴氏桿菌抗原是指含有至少一種豬巴氏桿菌抗原形式的任何組合物，所述 豬巴氏桿菌抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗豬巴氏桿菌感染的免疫應(yīng)答。豬巴氏桿菌 包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前按莢膜區(qū)分已鑒定的A、B、D、E四 種莢膜血清型。
[0014] 本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌抗原和D型豬巴氏桿菌抗原聯(lián)合可以預防進行性 豬萎縮性鼻炎，所述支氣管敗血波氏桿菌抗原是指含有至少一種支氣管敗血波氏桿菌抗原 形式的任何組合物，所述支氣管敗血波氏桿菌抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗支氣管 敗血波氏桿菌感染的免疫應(yīng)答。支氣管敗血波氏桿菌包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離 的野毒株。
[0015] 優(yōu)選地，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原包括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1 型全菌抗原、5型全菌抗原、7型全菌抗原；所述多殺性巴氏桿菌抗原包括A型全菌抗原、B 型全菌抗原、D型全菌抗原；以及所述支氣管敗血波氏桿菌抗原包括支氣管敗血波氏桿菌 全菌抗原。
[0016] 更優(yōu)選地，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型全菌抗原為豬傳染性胸膜肺炎放 線桿菌1型LC株滅活株，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型全菌抗原為豬傳染性胸膜肺 炎放線桿菌5型YC株滅活株，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7型全菌抗原為豬傳染性胸 膜肺炎放線桿菌7型YS株滅活株；所述多殺性巴氏桿菌A型全菌抗原為HN5株滅活株，所述 多殺性巴氏桿菌B型全病毒抗原為C44-1株滅活株，所述多殺性巴氏桿菌D型全菌抗原為 HB4株滅活株；所述支氣管敗血波氏桿菌全菌抗原為支氣管敗血波氏桿菌HN8株滅活株。
[0017] 胸膜肺炎放線桿菌血清 1 型 LC 株（Actinobacillus Pleuropneumoniae SerotypelStrain LC，APP-1)保藏號為：CCTCC N0:M2011458;豬胸膜肺炎放線桿菌血 清 5 型 YC 株（Actinobacillus Pleuropneumoniae Serotype5Strain YC, APP-5)保 藏號為：CCTCC N0:M2011459;豬胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株（Actinobacillus Pleuropneumoniae Serotype7Strain YS,APP_7)保藏號為：CCTCC N0:M2011460;保藏日期 均為2011年12月09日，保藏地址為：中國武漢，武漢大學；保藏單位均為中國典型培養(yǎng)物 保藏中心(簡稱CCTCC)。
[0018] 多殺性巴氏桿菌 A 型 HN5 株（Pasteurella multocida A type HN5)保藏號為： CCTCC N0.M2011222,多殺性巴氏桿菌 D 型 HB4 株（Pasteurella multocida D type HB4) 保藏號為：CCTCC NO. M2011221，保藏日期均為2011年06月28日，保藏地址為：中國武漢， 武漢大學；保藏單位均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC);多殺性巴氏桿菌血清B型 C44-1株來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0019] 支氣管敗血波氏桿菌 HN8 株（Bordetella bronchiseptica HN8)保藏號為：CCTCC NO. M2011223,保藏日期為2011年06月28日，保藏地址為：中國武漢，武漢大學；保藏單位 均為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)。
[0020]
[0021] 本發(fā)明的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原還可以包含以下抗原組合物：武漢科前 動物生物制品有限責任公司的豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗(血清1型、2型和7型)。
[0022] 本發(fā)明的豬巴氏桿菌抗原還可以包含以下抗原組合物：中牧股份的豬多殺性巴氏 桿菌滅活疫苗（C44-1株)。
[0023] 本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌抗原和D型豬巴氏桿菌還可以包含以下抗原組合 物：武漢科前動物生物制品有限責任公司的豬萎縮性鼻炎滅活疫苗(波氏桿菌JB5株)，英 特威公司的豬萎縮性鼻炎滅活疫苗"AR-T"，海博萊公司的豬萎縮性鼻炎滅活疫苗"喜畢安" (支氣管敗血波氏桿菌833株和D型多殺性巴氏桿菌637株壞死毒素的類毒素)，勃林格殷 格翰公司的豬萎縮性鼻炎滅活疫苗"茵格發(fā)"，美國輝瑞動物保健品有限公司的豬萎縮性鼻 炎滅活疫苗"克偉"以及上海海利的豬傳染性萎縮性鼻炎滅活疫苗。
[0024] 優(yōu)選地，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原為108?101(lCFU/ml，所述多殺性巴 氏桿菌抗原為1〇 8?l〇1(lCFU/ml，所述支氣管敗血波氏桿菌抗原為108?101(lCFU/ml。
[0025] 更優(yōu)選地，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原為109CFU/ml，所述多殺性巴氏桿 菌抗原為l〇 9CFU/ml，所述支氣管敗血波氏桿菌抗原為109CFU/ml。
[0026] 優(yōu)選地，所述佐劑包括氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、Montanide? Gel、蜂膠、 ISA206、ISA760VG、氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸）丙二醇酯、 三(辛酸/癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘 油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙 烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交 聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種。
[0027] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：
[0028] (1)培養(yǎng)增殖所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型、5型和7型菌液，滅活；
[0029] (2)培養(yǎng)增殖所述多殺性巴氏桿菌A型、B型和D型菌液，滅活；
[0030] (3)培養(yǎng)增殖所述支氣管敗血波氏桿菌液，滅活；
[0031] (4)將已滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌種1型、5型和7型、多殺性巴氏桿 菌A型、B型和D型以及支氣管敗血波氏桿菌按比例混合，輔以佐劑制備成疫苗。
[0032] 優(yōu)選地，所述滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌種1型、5型和7型、多殺性巴氏 桿菌A型、B型和D型以及支氣管敗血波氏桿菌混合后濃度為10 8?101(lCFU/ml。
[0033] 優(yōu)選地，所述各滅活菌抗原混合比例為1:1:1:1:1:1:1。
[0034] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和治療由萎縮性鼻炎 繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0035] 本發(fā)明解決了豬傳染性胸膜肺炎、豬多殺性巴氏桿菌病和豬萎縮性鼻炎各單苗免 疫程序不同且需多次免疫的問題，并且發(fā)現(xiàn)三者在免疫效果上具有相互促進的作用，本疫 苗一次單劑量免疫可以產(chǎn)生很好的保護效果。
[0036] 本發(fā)明通過大量的篩選研究，發(fā)現(xiàn)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬巴氏桿菌和支 氣管敗血波氏桿菌的抗原制備的疫苗組合物，三種抗原相互并不會相互干擾或影響；相反 地，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的疫苗組合物不僅能 夠產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答，還具有相互增強的免疫效果，可以很好的預防由萎縮性鼻炎繼發(fā) 的呼吸系統(tǒng)疾病。

【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0038] 本發(fā)明實施例中以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株、5型YC株、7型YS株、 多殺性巴氏桿菌A型HN5株、D型HB4株、B型C44-1株、支氣管敗血波氏桿菌HN8株為例說 明本發(fā)明。
[0039] 實施1預防豬傳染性胸膜肺炎、豬多殺性巴氏桿菌病和豬萎縮性鼻炎滅活疫苗的 制備方法：
[0040] 1.菌種
[0041] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株，保藏號為：CCTCC Μ 2011458。
[0042] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型YC株，保藏號為：CCTCC Μ 2011459。
[0043] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7型YS株，保藏號為：CCTCC Μ 2011460。
[0044] 多殺性巴氏桿菌Α型ΗΝ5株，保藏號為：CCTCC Μ 2011222。
[0045] 多殺性巴氏桿菌D型ΗΒ4株，保藏號為：CCTCC Μ 2011221。
[0046] 多殺性巴氏桿菌Β型為莢膜Β型(群）多殺性巴氏桿菌C44-1株，為中國獸醫(yī)藥品 監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
[0047] 支氣管敗血波氏桿菌ΗΝ8株，保藏號為：CCTCC Μ 2011223。
[0048] 2.疫苗的配制
[0049] 2. 1生產(chǎn)用種子的制備
[0050] 2. 1. 1 -級種子的繁殖
[0051] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株、5型YC株和7型YS株凍干菌種，分別劃線 接種于TSA/NAD (TSA為BD公司生產(chǎn)，NAD為Roche公司生產(chǎn)）平板上，置37°C培養(yǎng)18? 24小時，選取符合要求的菌落，接種于TSB/NAD (NAD含量為0. 05%) (TSB為BD公司生產(chǎn)， NAD為Roche公司生產(chǎn))液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16小時，作為一級種子；多殺性巴氏 桿菌A型HN5株、多殺性巴氏桿菌B型C44-1株、多殺性巴氏桿菌D型HB4株和支氣管敗血 波氏桿菌HN8株凍干菌種，劃線接種于含10%雞血清TSA(雞血清為鄭州佰安生物工程有限 公司生產(chǎn))平板上，置37°C培養(yǎng)18?24小時后挑取單克隆接種于BHI肉湯培養(yǎng)基中，37°C 震蕩培養(yǎng)16?18小時，經(jīng)純粹檢驗合格后作為一級種子。
[0052] 2. 1. 2二級種子的繁殖
[0053] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株、5型YC株和7型YS株取一級種子的培養(yǎng) 物，按1%的量加入TSB/NAD (NAD含量為0. 05%)液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16小時，經(jīng) 檢驗純粹后作為二級種子；多殺性巴氏桿菌A型HN5株、多殺性巴氏桿菌B型C44-1株、多 殺性巴氏桿菌D型HB4株和支氣管敗血波氏桿菌HN8株選取符合要求的一級種子的培養(yǎng) 物，按1%的量接種于BHI肉湯培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)12?16小時，經(jīng)純粹檢驗合格后作 為二級種子。
[0054] 2. 2菌液的培養(yǎng)
[0055] 2. 2. 1在TSB培養(yǎng)基中，加入0· 01%?0· 05%NAD、5%?10%的小牛血清(浙江天杭 生物科技有限公司），將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株、5型YC株和7型YS株菌液 分別按1%的量加進培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37°C培養(yǎng)16?18小時時停止培養(yǎng)。
[0056] 2. 2. 2在腦心浸液（BHI，BD公司生產(chǎn)）培養(yǎng)基中，將多殺性巴氏桿菌A型HN5株、 多殺性巴氏桿菌B型C44-1株、多殺性巴氏桿菌D型HB4株和支氣管敗血波氏桿菌HN8株 菌液按1%的量加進培養(yǎng)基中培養(yǎng)，混勻后置37°C培養(yǎng)16?18小時，收獲菌液。
[0057] 2. 2. 3純粹檢驗
[0058] 培養(yǎng)結(jié)束后，分別從制苗的菌液中取樣，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(二〇一〇 年版)》附錄進行純粹檢驗，應(yīng)純粹。
[0059] 2· 2· 4活菌計數(shù)
[0060] 分別從制苗菌液中取樣，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌用TSA/NAD (NAD含量為 0. 05%)平板培養(yǎng)進行活菌計數(shù)；多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌用含10%雞血清 TSA (雞血清，鄭州佰安生物工程有限公司）進行活菌計數(shù)，以確定培養(yǎng)的菌數(shù)。
[0061] 2. 2. 5 滅活
[0062] 向上述培養(yǎng)好的菌液中，按總量的0. 2% (V/V)加入37%的甲醛溶液(煙臺市雙雙 化工有限公司），放置于37°C滅活24h，期間攪拌3?5次。
[0063] 2. 2. 6滅活檢驗
[0064] 取已經(jīng)滅活的3種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌液分別5ml接種于100ml含 0. 01%?0. 05%NAD、5%?10%的血清的TSB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24小時，再移植于上述 100ml含0. 01%?0. 05%NAD、5%?10%的血清的TSB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24小時；取滅活的 3種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌液0. 5ml劃線接種于TSA/NAD平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24 小時。兩種方法培養(yǎng)后，均應(yīng)無菌生長。
[0065] 取5ml已經(jīng)滅活的3種多殺性巴氏桿菌菌液和支氣管敗血波氏桿菌菌液分別接種 于lOOmlBHI中，37°C培養(yǎng)24小時，再移植于lOOmlBHI培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)24小時；分別取 已經(jīng)滅活的多殺性巴氏桿菌A型、多殺性巴氏桿菌B型、多殺性巴氏桿菌D型和支氣管敗血 波氏桿菌〇. 5ml劃線接種于TSA (10%雞血清）平板，37°C培養(yǎng)24小時。兩種方法培養(yǎng)后， 均應(yīng)無菌生長。
[0066] 2. 2. 7 安檢
[0067] 取上述已滅活的菌液分別靜脈注射18?22g的Balb/C小鼠5只，每只0. 2ml，三 天內(nèi)5/5健活，方為滅活徹底。
[0068] 2. 2. 8菌液的濃縮
[0069] 將滅活后的菌液離心濃縮，棄上清，用PBS懸浮稀釋菌體，使細菌含量相當于滅活 前活菌數(shù)為lXl〇nCFU/ml。
[0070] 2. 3疫苗配制
[0071] 將上述已滅活、濃縮的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型、5型和7型菌液，多殺性巴 氏桿菌A型、多殺性巴氏桿菌B型和多殺性巴氏桿菌D型菌液以及支氣管敗血波氏桿菌菌 液按表1提供的配比比例混合，并加入疫苗總量〇. 01%的硫柳汞(北京市慶盛達化工技術(shù)有 限公司），然后和Montanide MS1313 VG佐劑(法國賽比克公司)混合進行乳化，佐劑含量為 10%?50% (按每頭份用量為2ml計）;成品豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬巴氏桿菌病和豬 萎縮性鼻炎滅活疫苗抗原含量為滅活前豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型、5型和7型、多殺 性巴氏桿菌A型、多殺性巴氏桿菌B型、多殺性巴氏桿菌D型和支氣管敗血波氏桿菌活菌數(shù) 為10 8?101(ICFU /頭份。除上述五種抗原和佐劑外，還補充PBS使得本發(fā)明中疫苗成品劑 量(每頭份用量）為2ml。
[0072] 各疫苗具體成分配比如表1，配制三種疫苗A、疫苗B和疫苗C ;疫苗A每種病原抗 原含量(滅活前）為1X l〇8CFU/頭份，疫苗B每種病原抗原含量(滅活前）為1X 109CFU/頭 份，疫苗C每種病原抗原含量(滅活前）為1 X 101(ICFU/頭份。
[0073] 表1疫苗配比具體實施案例
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病的疫苗組合物，所述疫苗組合物 包括： 免疫量的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原； 免疫量的多殺性巴氏桿菌抗原； 免疫量的支氣管敗血波氏桿菌抗原；以及佐劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原包 括豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型全菌抗原、5型全菌抗原、7型全菌抗原；所述多殺性巴氏 桿菌抗原包括A型全菌抗原、B型全菌抗原、D型全菌抗原；以及所述支氣管敗血波氏桿菌 抗原包括支氣管敗血波氏桿菌全菌抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型全 菌抗原為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型LC株滅活株，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5 型全菌抗原為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型YC株滅活株，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿 菌7型全菌抗原為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌7型YS株滅活株； 所述多殺性巴氏桿菌A型全菌抗原為HN5株滅活株，所述多殺性巴氏桿菌B型全菌抗 原為C44-1株滅活株，所述多殺性巴氏桿菌D型全菌抗原為HB4株滅活株； 所述支氣管敗血波氏桿菌全菌抗原為支氣管敗血波氏桿菌HN8株滅活株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原為 108?101(lCFU/ml，所述多殺性巴氏桿菌抗原為10 8?101(lCFU/ml，所述支氣管敗血波氏桿菌 抗原為 1〇8 ?l〇1QCFU/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原 為109CFU/ml，所述多殺性巴氏桿菌抗原為10 9CFU/ml，所述支氣管敗血波氏桿菌抗原為 109CFU/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述佐劑包括氫氧化鋁膠、礦物油、卡波 姆、Montanide?Ge 1、蜂膠、ISA206、ISA760VG、氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸）丙二醇酯、三(辛酸/癸酸）甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、 二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚 氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或 多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種。
7. -種制備權(quán)利要求2所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： (1)培養(yǎng)增殖所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1型、5型和7型菌液，滅活； (2 )培養(yǎng)增殖所述多殺性巴氏桿菌A型、B型和D型菌液，滅活； (3) 培養(yǎng)增殖所述支氣管敗血波氏桿菌液，滅活； (4) 將已滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌種1型、5型和7型、多殺性巴氏桿菌A 型、B型和D型以及支氣管敗血波氏桿菌按比例混合，輔以佐劑制備成疫苗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，所述滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌 種1型、5型和7型、多殺性巴氏桿菌A型、B型和D型以及支氣管敗血波氏桿菌混合后濃度 為 108 ?1010CFU/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，所述各滅活菌抗原混合比例為
10.根據(jù)權(quán)利要求1?6所述的疫苗組合物在制備預防和治療由萎縮性鼻炎繼發(fā)的呼 吸系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK104056263SQ201310095338
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月22日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司