專利名稱：腺病毒介導(dǎo)的腫瘤內(nèi)投送血管生成拮抗劑用于腫瘤的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤治療的基因療法。本發(fā)明更特別涉及向腫瘤的細(xì)胞內(nèi)引入編碼一種抗血管生成因子的基因，例如利用一種腺病毒載體，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，或者兩者均有。
本發(fā)明的背景細(xì)胞遷移是一種橋聯(lián)細(xì)胞活化和粘附而細(xì)胞周蛋白水解和其抑制之間的平衡被打破(如，由纖溶酶原激活劑抑制劑以及金屬蛋白酶的組織抑制劑引發(fā))的協(xié)調(diào)過(guò)程(1-3)。尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)因通過(guò)結(jié)合至其細(xì)胞表面受體(uPAR)而在遷移細(xì)胞的表面啟動(dòng)一個(gè)蛋白水解的級(jí)聯(lián)放大過(guò)程，因而在這一過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)者(4，5)。uPA對(duì)其受體的結(jié)合大大加強(qiáng)了細(xì)胞表面纖溶酶原/纖溶酶的轉(zhuǎn)化(6)。纖溶酶是一種能直接降解如纖連蛋白、玻連蛋白或?qū)诱尺B蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的廣泛特異的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶還通過(guò)將無(wú)活性的酶原轉(zhuǎn)化為有活性的金屬蛋白酶而間接促進(jìn)基質(zhì)的局部降解(7)。uPAR在遷移細(xì)胞(invadopodes)引導(dǎo)邊緣的選擇性分布明顯富集了由它們自身或附近基質(zhì)細(xì)胞分泌的uPA(8)。通過(guò)細(xì)胞uPA依賴的對(duì)玻連蛋白的結(jié)合(9)而且因?yàn)閡PAR調(diào)節(jié)幾種整聯(lián)蛋白分子的結(jié)合特性(10)表明uPAR還直接參與細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。最后，uPA和纖溶酶通過(guò)活化或誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)的釋放而在一定程度上參與細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生(11，12)。
綜上所述，這些觀察表明uPA/uPAR系統(tǒng)通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞活化、粘附和運(yùn)動(dòng)來(lái)控制細(xì)胞遷移。臨床觀察支持在腫瘤侵入邊緣存在增強(qiáng)的uPA活性這一觀點(diǎn)(13，14)。由DMBA和巴豆油誘導(dǎo)的黑色素瘤在uPA缺陷的小鼠中不能進(jìn)展為惡性階段也支持在腫瘤的建立和進(jìn)展中uPA的作用(15)。
uPA通過(guò)其輕鏈片段亦稱為氨基末端片段(ATF，氨基酸1-135)結(jié)合至uPAR。這種相互作用是種屬限制性的(16)而且涉及ATF的EGF樣結(jié)構(gòu)域(殘基1-46)，其中在小鼠和人之間非保守的氨基酸19-32是關(guān)鍵的(17，18)。在體外ATF介導(dǎo)的uPA/uPAR復(fù)合體的破壞抑制腫瘤細(xì)胞遷移以及侵入(19)。腹膜內(nèi)團(tuán)狀注射一種嵌合的基于人ATF的拮抗劑已被用來(lái)抑制植入無(wú)胸腺小鼠的人腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，而對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)顯著影響(20)。進(jìn)一步的一項(xiàng)研究報(bào)道腹膜內(nèi)注射衍生自小鼠ATF的合成肽對(duì)于抑制原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移均有效(21)。這些結(jié)果同uPA/uPAR復(fù)合物在控制腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性中的作用是一致的(22)。一種嵌合的基于小鼠ATF的拮抗劑在一人工的富含bFGF的細(xì)胞外基質(zhì)中能夠抑制血管生長(zhǎng)(23)進(jìn)一步支持uPA/uPAR參與控制體內(nèi)血管生成。
血管的形成，或血管生成，是已存在血管的毛細(xì)血管生長(zhǎng)的結(jié)果。血管生成對(duì)于許多生理過(guò)程是至關(guān)重要的，如胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合以及組織或器官再生。在病理情況下發(fā)生異常的新生血管生長(zhǎng)如糖尿病性視網(wǎng)膜病和腫瘤生長(zhǎng)，以及腫瘤播散至遠(yuǎn)隔位點(diǎn)〔38，24〕。實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已表明由于平衡的增殖和凋亡率，原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移仍然是靜止的，除非血管生成過(guò)程被啟動(dòng)(39)。
內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)是由正性和副性因子共同緊密調(diào)節(jié)的。腫瘤血管生成的開始可以由腫瘤釋放的血管生成因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和酸性或/和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGFs)的上調(diào)或由血管抑制因子如血小板反應(yīng)蛋白和制管張素的下調(diào)啟動(dòng)(39)。因而血管抑制因子的重建和血管生成刺激因子的清除都是抑制腫瘤血管生成的合理的臨床策略〔40，41〕。因?yàn)椴煌[瘤類型間內(nèi)皮細(xì)胞并無(wú)改變，所以基于血管抑制的治療也可用于所有實(shí)體瘤，進(jìn)一步突出了這種抗腫瘤方法的臨床適用性。因此，針對(duì)血管生成的療法對(duì)于臨床實(shí)踐似乎是非常適用的。
許多生理性血管抑制因子衍生于循環(huán)蛋白的蛋白水解。制管張素〔32〕、內(nèi)皮抑素〔42〕、催乳素的16kDa片段〔43〕或血小板因子4〔44〕均是如此。制管張素最初是從荷有劉易斯肺癌(LLC)的小鼠中分離出來(lái)的，并被鑒定為纖溶酶原(Plg)的一個(gè)38kDa的內(nèi)部片段(aa98-440)，其包括該分子的前4個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)〔32；WO95/29242；US 5,639,725〕。已證明制管張素是由GM-CSF刺激的腫瘤浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞分泌的一種金屬?gòu)椥缘鞍酌杆釶lg而產(chǎn)生的〔45〕。在6個(gè)不同的腫瘤模型中腹膜內(nèi)團(tuán)狀注射純化的制管張素已證實(shí)對(duì)抑制原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)是非常有效的，而沒有明顯的毒性〔46〕。制管張素介導(dǎo)的腫瘤血管生成抑制明顯地使腫瘤細(xì)胞具有一種較高的凋亡率，抵消了它們的增殖率。在此研究中，在去除制管張素分子后腫瘤生長(zhǎng)通?；謴?fù)，這強(qiáng)調(diào)了為獲最佳的臨床收益實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期投送的重要性〔46〕。利用重組蛋白的體外研究提示制管張素的血管抑制活性主要是由鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1-3介導(dǎo)的，而鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)4僅余有很小的活性〔47〕。至于大多數(shù)血管抑制因子，關(guān)于制管張素發(fā)揮效應(yīng)的分子途徑還知之甚少。
由于血管抑制療法需要體內(nèi)長(zhǎng)期維持治療水平，所以重組蛋白的不斷輸入將是昂貴而麻煩的。利用病毒載體直接體內(nèi)投送相應(yīng)的基因是解決這一問(wèn)題令人關(guān)注的辦法。因?yàn)槟壳按蟛糠帜[瘤基因治療依賴于針對(duì)腫瘤細(xì)胞的破壞策略〔48〕，所以病毒介導(dǎo)的一種血管抑制因子的基因投送代表一個(gè)對(duì)抗腫瘤的概念上不同而且可能協(xié)同的方法。
盡管有這些結(jié)果，但仍需要發(fā)展對(duì)腫瘤，特別是化療抗性腫瘤的有效治療方法。
本發(fā)明通過(guò)建立一種治療腫瘤的有效方式了滿足這一需要。
在本說(shuō)明書中通過(guò)數(shù)字注明各參考文獻(xiàn)，其全部羅列在實(shí)施例后。此中引用的參考文獻(xiàn)均不能被解釋為描述或暗示此中所公布的發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明有利地提供一種非常有效的腫瘤基因療法。實(shí)際上，在本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案中在一無(wú)胸腺小鼠模型中由人腫瘤細(xì)胞表達(dá)的小鼠尿激酶ATF意外地有效抑制腫瘤發(fā)生。在另一實(shí)施方案中，在一小鼠模型中腫瘤細(xì)胞表達(dá)的制管張素除阻斷血管生成外還抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)生，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
廣義上，本發(fā)明提供一種通過(guò)向腫瘤細(xì)胞中引入含有可操作地同一提供抗血管生成因子表達(dá)的表達(dá)控制序列相聯(lián)的編碼一抗血管生成因子之基因的載體來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移或者兩者均有的方法。載體優(yōu)選為一病毒載體；病毒載體更優(yōu)選為一種腺病毒載體。在下文舉例的一特定實(shí)施方案中，腺病毒載體為一種缺陷型腺病毒載體。
如此中所詳細(xì)陳述的，本發(fā)明的方法在許多腫瘤的治療中是有用的。例如，在特定的實(shí)施方案中，腫瘤為一種肺癌或一種乳腺癌。
另外，本發(fā)明首次證明由轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗血管生成因子的優(yōu)點(diǎn)。相應(yīng)地，編碼任何抗血管生成因子的基因，如一種血管生成蛋白的可溶性受體或一種血管生成拮抗劑的基因，均可用來(lái)在本發(fā)明的實(shí)施中進(jìn)行投送。在一特定的實(shí)施方案中，以該因子不是尿激酶為條件，抗血管生成因子含有尿激酶的具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的氨基末端片段的一段序列。例如，抗血管生成因子可以是一種包括ATF-免疫球蛋白或ATF-人血清白蛋白的嵌合蛋白。在下文舉例的一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管生成因子為具有尿激酶從大約氨基酸殘基1至大約殘基135的氨基酸序列的尿激酶氨基末端片段。在一特定的方面，尿激酶為小鼠的尿激酶。在一更優(yōu)選的方面，尿激酶為人的尿激酶。
在另一實(shí)施方案中，抗血管生成因子是制管張素，特別是制管張素的鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管生成因子是具有纖溶酶原中大約氨基酸殘基1至約殘基333氨基酸序列的纖溶酶原(plg)氨基末端片段。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，抗血管生成因子是人纖溶酶原的氨基末端片段(制管張素)。
在一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如下載體在制造用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移或兩者的藥物中的應(yīng)用，該載體含有編碼一種抗血管生成因子的基因，該基因有效地與支持該抗血管生成因子表達(dá)的表達(dá)控制序列連接。更具體地，本發(fā)明提供本發(fā)明的病毒載體(如下所述)在制造用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移或兩者的藥物中的應(yīng)用。
當(dāng)然除上述方法和應(yīng)用外，本發(fā)明提供一種新的病毒載體，其含有與表達(dá)控制序列有效相連的編碼一種抗血管生成因子的基因。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述病毒載體是一種腺病毒載體。在另一實(shí)施方案中，病毒載體是一種缺陷型腺病毒載體。本發(fā)明的病毒載體可提供如上所述的編碼任何抗血管生成因子的基因。例如，抗血管生成因子可含有具EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶氨基末端片段的序列，條件是該因子不是尿激酶。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，抗血管生成因子是具有尿激酶中氨基酸殘基1至約殘基135的氨基序列的尿激酶氨基末端片段。在該實(shí)施方案中，尿激酶可以是鼠尿激酶或優(yōu)選地是人尿激酶。
本發(fā)明進(jìn)而提供一種含本發(fā)明的任何病毒載體以及一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
因而，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)投送抗血管生成因子用于治療腫瘤提供基因療法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于投送一抗腫瘤發(fā)生因子的病毒載體。
本發(fā)明還有另一目的是通過(guò)基因療法提供尿激酶的一個(gè)氨基末端片段(ATF)用于腫瘤治療。
此外，本發(fā)明的另一目的是通過(guò)基因療法提供制管張素用于治療腫瘤。
本發(fā)明還有另一目的是通過(guò)基因療法提供制管張素，特別是制管張素的鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3用于腫瘤治療。
本發(fā)明的這些和其它目的在下面的詳細(xì)描述和實(shí)施例以及附圖中作進(jìn)一步詳盡闡述。
圖的描述

圖1.病毒AdmATF的分子鑒定。圖案AAdmATF和AdCO1的結(jié)構(gòu)。Ad5染色體36kb長(zhǎng)并以倒置末端重復(fù)序列為界。Y指包裝信號(hào)。由于缺少Ad5 E1基因所以病毒均是生長(zhǎng)缺陷的。它們?cè)贓3區(qū)內(nèi)還載有一1.9kbXbaI缺失。在Ad5染色體下標(biāo)出病毒AdmATF的mATF表達(dá)框的圖示(未按比例繪制)。對(duì)于腺病毒載體的綜述見(38)。圖案BmATF表達(dá)的分析。MDA-MB-231細(xì)胞被AdCO1(泳道2)或AdmATF(泳道3)、或模擬感染(泳道1)24小時(shí)，并將總多聚(A+)RNA用于RNA印跡分析。編碼ATF的RNA(0.5kb)被標(biāo)示出(箭頭)。還檢測(cè)出一1.7kb的分子(星號(hào))，其大小同利用來(lái)自腺病毒pIX基因的多聚腺苷酸信號(hào)一致。圖案C293感染細(xì)胞ATF分泌的分析。用一多克隆抗小鼠uPA抗體對(duì)模擬感染細(xì)胞的(泳道)、或者AdCO1(泳道2)或AdmATF(泳道3)感染細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
圖2.病毒AdmATF的功能鑒定。圖案AAdmATF感染細(xì)胞的培養(yǎng)基抑制LLC細(xì)胞表面的纖維蛋白溶酶轉(zhuǎn)化(見實(shí)施例的方法部分)。293指非感染細(xì)胞的上清。圖案B同AdCO1感染的LLC細(xì)胞(左側(cè)圖案)相比，用AdmATF感染LLC細(xì)胞(右側(cè)圖案)特異性抑制細(xì)胞侵入。膜的1.2mm孔是可見的。
圖3.AdmATF的腫瘤內(nèi)注射抑制在同系小鼠中LLC腫瘤的生長(zhǎng)。將腫瘤細(xì)胞(2×106細(xì)胞)皮下注射到C57BL/6小鼠中。6天后，動(dòng)物接受一次腫瘤內(nèi)注射PBS、或者109PFU的AdCO1或AdmATF，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。用它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差描述平均值(n＝10)。利用學(xué)生檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
圖4.AdmATF的腫瘤內(nèi)注射抑制LLC腫瘤的血管化。圖案A展示在注射后第10天取自AdCO1處理組(左)和AdmATF處理組的一個(gè)代表性腫瘤。在圖案B(注射AdCO1)和圖案C(注射AdmATF)中展示于注射后第20天取出的代表性腫瘤。所有照片均在相同放大下拍攝。注意AdmATF注射腫瘤比它們注射AdCO1的對(duì)照小得多，特別是在最后一次注射后(比較圖案B和C)。
圖5.AdmATF的腫瘤內(nèi)注射抑制在裸鼠體內(nèi)MDA-MB-231腫瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)皮下注射3×106個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞植入腫瘤。在植入后11天，小鼠接受腫瘤內(nèi)注射PBS、或者109PFU的AdCO1或AdmATF，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。用它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差描述平均值。
圖6.AdmATF的腫瘤內(nèi)注射抑制腫瘤內(nèi)和腫瘤周圍的血管生成。圖案A和B腫瘤切片的vWF免疫染色。在注射后52天，用一多克隆抗vWF血清顯示由AdCO1(A)和AdmATF處理組(B)制備的石蠟包埋MDA-MB-231腫瘤切片。圖案C和D顯微鏡下評(píng)價(jià)在注射后20天時(shí)注射AdCO1(C)或AdmATF(D)腫瘤的皮膚內(nèi)腫瘤周圍的血管化。
圖7.(A)重組腺病毒。Ad5基因組是一36kb長(zhǎng)的染色體。通過(guò)致死性缺失E1基因(核苷酸位點(diǎn)382至3446)而獲得病毒AdK3和AdCO1；它們還載有一非致死性的E3區(qū)內(nèi)1.9kb XbaI缺失(綜述見〔37〕)。在Ad5染色體下標(biāo)出制管張素的表達(dá)框。纖溶酶原分泌信號(hào)由一黑盒代表；+1指CMV驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄起始；AATAAA指SV40的晚期多聚腺苷酸信號(hào)。(B)感染細(xì)胞制管張素分泌的分析。將100ng人Plg(泳道1)、來(lái)自感染AdK3(泳道2)或AdCO1(泳道3)的HMEC-1、感染AdK3(泳道4)或AdCO1(泳道5)的C6、以及來(lái)自感染AdK3(泳道6)或AdCO1(泳道7)的MDA-MB-231的培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。(C)C6腫瘤抽提物中制管張素的免疫檢測(cè)；在裸鼠中建立腫瘤并給予109PFU的AdCO1(泳道1)或AdK3(泳道2)，在注射后第10天是進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。同制管張素(36-38kDa)和Plg(92kDa)相對(duì)應(yīng)的信號(hào)被標(biāo)明(分別為箭頭和星號(hào))。
圖8.(A)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制。將AdK3(◆)或Ad-CO1(□)注入C6(圖案1)、MDA-MB-231(圖案2)和HMEC-1(圖案3)中。用來(lái)自AdK3(◆)或Ad-CO1(□)感染的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清培養(yǎng)HMEC-1細(xì)胞(圖案4)。(B)HMEC-1細(xì)胞中MPM-2磷酸表位的檢測(cè)。模擬感染的細(xì)胞(泳道1)、AdCO1感染的細(xì)胞(泳道2)和AdK3感染的細(xì)胞(泳道3)。(C)通過(guò)間接免疫染色在感染AdCO1(圖案1)或AdK3(圖案2)的HMEC-1細(xì)胞中檢測(cè)到MPM-2表位，并通過(guò)碘化丙錠染色檢測(cè)DNA含量并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量(見方法)。學(xué)生t檢驗(yàn)用于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
圖9.AdK3抑制腫瘤生長(zhǎng)。將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤(圖案A)和MDA-MB-231腫瘤(圖案B)皮下植入無(wú)胸腺小鼠(見方法)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到20mm3(0天)時(shí)，小鼠接受一次腫瘤內(nèi)注射PBS(□)、或者109PFU的AdK3(●)或AdCO1(◆)。用它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差描述平均值。
圖10.AdK3抑制C6腫瘤生長(zhǎng)和血管生成。展示了注射后10天取自AdCO1處理組(圖案A)和AdK3處理組(圖案B)的腫瘤。展示了注射后第5天在注射AdCO1(圖案C)或AdK3(圖案D)的代表性腫瘤周邊血管化的程度。在注射后第10天將取自注射AdCO1(圖案E)或AdK3(圖案F)腫瘤的石蠟包埋C6切片進(jìn)行vWF免疫染色。通過(guò)TUNEL方法檢測(cè)在取自AdCO1注射(圖案G)或AdK3(圖案H)注射腫瘤的切片內(nèi)凋亡細(xì)胞的比例。AdCO1和AdK3注射的腫瘤使用同等放大。
圖11.AdK3的劑量依賴效應(yīng)。在C6細(xì)胞植入無(wú)胸腺小鼠前，體外用AdCO1(圖案A)或AdK3(圖案B)感染C6細(xì)胞24小時(shí)，并以1(□)、1∶2(◆)和1∶4(●)的比例同未感染的C6細(xì)胞混合。在20天內(nèi)測(cè)定腫瘤體積。用它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差描述平均值。
本發(fā)明的詳細(xì)如上所述，本發(fā)明針對(duì)用于腫瘤基因治療的方法和載體。本發(fā)明的方法和載體抑制腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤轉(zhuǎn)移，或者兩者均有。這些方法和載體在一種出人意料地有利的程度上通過(guò)抑制腫瘤的血管生成發(fā)揮作用。
本發(fā)明部分基于尿激酶氨基末端片段(ATF)和制管張素基因治療性轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)。ATF是一種尿激酶(uPA)的拮抗劑，結(jié)合至其細(xì)胞表面受體(uPAR)，還是一種內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制劑。為評(píng)價(jià)uPA/uPAR相互作用對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和播散的重要性，構(gòu)建了一種由CMV啟動(dòng)子表達(dá)小鼠ATF的缺陷型腺病毒(AdmATF)。在兩個(gè)不同小鼠模型中，單次腫瘤內(nèi)注射AdmATF抑制已建立腫瘤的生長(zhǎng)，并延遲腫瘤播散。這些效應(yīng)同在注射部位內(nèi)以及其緊密鄰近部位新生血管化的顯著抑制相關(guān)。這種效應(yīng)的程度在小鼠ATF抑制一源于人的腫瘤的血管生成的能力中特別顯著。在一特定的實(shí)例中，構(gòu)建了一表達(dá)人Plg的N末端片段(aa1-333)-其中包括預(yù)活化肽和鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3〔47〕-的缺陷型腺病毒(AdK3)，并評(píng)價(jià)其在不同小鼠腫瘤模型中的體外和體內(nèi)活性。AdK3載體抑制腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)生，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
腺病毒介導(dǎo)的拮抗劑腫瘤內(nèi)投送通過(guò)靶向血管生成表現(xiàn)出有效的抗腫瘤特性。
定義在本說(shuō)明書中使用下面定義的術(shù)語(yǔ)，并且可能對(duì)理解本發(fā)明的范圍和實(shí)踐有幫助。
在一特定的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意指在給定值或范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選10％以內(nèi)，而更優(yōu)選5％以內(nèi)。
“抗血管生成”因子是一種抑制血管生成，特別是通過(guò)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞遷移來(lái)抑制的分子。這種因子包括抑制性的血管生成蛋白的片段(如尿激酶的ATF)、血管生成抑制因子，如制管張素和內(nèi)皮抑素；以及血管生成因子的可溶性受體，如尿激酶受體或FGF/VEGF受體。術(shù)語(yǔ)“制管張素”，其衍生自纖溶酶原的氨基末端片段，包括具有鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3的制管張素的抗血管生成片段。通常，在本發(fā)明中所用的抗血管生成因子為一種由利用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)入腫瘤的一種基因所編碼的蛋白或多肽。
一種多肽或蛋白的“變體”是衍生自多肽或蛋白的并保留該多肽或蛋白至少一個(gè)生物學(xué)特性的任何類似物、片段、衍生物、或突變體。天然可能存在該多肽或蛋白的不同變體。這些變體可以是以編碼該蛋白的結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列中的不同為特征的等位基因變異，或者可以包括不同的剪接或翻譯后修飾。技術(shù)人員可以制備具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、插入或置換的變體。這些變體可以特別包括(a)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸取代的變體，(b)將一個(gè)或多個(gè)氨基酸加入到該多肽或蛋白中的變體，(c)一個(gè)或多個(gè)氨基酸包括一個(gè)取代基團(tuán)的變體，以及(d)多肽或蛋白同另一多肽如血清白蛋白融合的變體。獲得這些變體的技術(shù)，包括遺傳學(xué)(抑制、刪除、突變等)、化學(xué)和酶學(xué)的技術(shù)，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是已知的。
如果這種等位基因變異、類似物、片段、衍生物、突變體和包括不同的mRNA剪接形式和不同的翻譯后修飾形式的修飾產(chǎn)生的多肽衍生物保留有該多肽的任何生物學(xué)特性，則應(yīng)將它們包括于本發(fā)明的范圍之中。
普通分子生物學(xué)依據(jù)本發(fā)明，在本領(lǐng)域的技術(shù)中應(yīng)包括傳統(tǒng)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、以及重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)的解釋。見，例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(此中稱為“Sambrook等，1989”)；DNA克隆一種操作方法(DNA CloningA Practical Approach)，I和II卷(D.N.Glover編，1985)；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait編，1984)；核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)〔B.D.Hames和S.J.Higgins編，(1985)〕；轉(zhuǎn)錄和翻譯(Transcription And Translation)〔B.D.Hames和S.J.Higgins編，(1984)〕；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)〔R.I.Freshney編(1986)〕；固定化細(xì)胞和酶(Immobilized Cells AndEnzymes)〔IRL出版社，(1986)〕；B.Perbal，分子克隆實(shí)用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(編)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley和Sons公司(1994)。
因此，如果此中出現(xiàn)，隨后的術(shù)語(yǔ)應(yīng)該具有下面給出的定義。
“載體”是用于將根據(jù)本發(fā)明的一種核酸轉(zhuǎn)移入一宿主細(xì)胞的任何工具。術(shù)語(yǔ)“載體”包括用于體外、離體或體內(nèi)將核酸引入一細(xì)胞中的病毒和非病毒工具。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電荷脂質(zhì)(cytofectins)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物多聚體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、EB病毒和腺病毒載體，這在下面更加詳細(xì)地列出。除了根據(jù)本發(fā)明的核酸外，載體還可以含有一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域，和/或便于篩選、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移至何種組織，表達(dá)持續(xù)時(shí)間等)的篩選標(biāo)志。
“調(diào)節(jié)區(qū)域”意指調(diào)節(jié)另一核酸序列表達(dá)的一種核酸序列。一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域可以包括天然負(fù)責(zé)一特殊核酸表達(dá)的序列(同源區(qū)域)或者可以包括不同來(lái)源的序列(負(fù)責(zé)表達(dá)不同蛋白或者甚至為合成蛋白)。特別地，序列可以是真核或病毒基因的序列或衍生序列，其以一種特定或非特定的方式以及一種誘導(dǎo)性或非誘導(dǎo)性方式刺激或抑制基因轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)區(qū)域包括復(fù)制起點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、指導(dǎo)多肽進(jìn)入靶細(xì)胞分泌路徑的信號(hào)序列以及啟動(dòng)子。
來(lái)自“異源”的調(diào)節(jié)區(qū)域是一個(gè)同所表達(dá)的核酸并非天然相聯(lián)的調(diào)節(jié)區(qū)域。異源調(diào)節(jié)區(qū)域中包括來(lái)自不同物種的調(diào)節(jié)區(qū)域、來(lái)自不同基因的調(diào)節(jié)區(qū)域、雜合的調(diào)節(jié)序列以及天然中不存在但由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計(jì)的調(diào)節(jié)序列。
“盒”指能在特定限制性位點(diǎn)被插入一載體的DNA片段。該DNA片段編碼一種目的多肽，而且設(shè)計(jì)該盒和限制性位點(diǎn)以保證該盒插入在對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯適當(dāng)?shù)拈喿x框中。
當(dāng)外源或異源DNA被引入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，這個(gè)細(xì)胞被這種DNA“轉(zhuǎn)染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)表型改變時(shí)，這個(gè)細(xì)胞被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。
“異源”DNA指天然并非位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞的一個(gè)染色體位點(diǎn)上的DNA。異源DNA優(yōu)選包括一種對(duì)細(xì)胞為外來(lái)的基因。
“核酸”是一種由稱為核苷酸的亞單位共價(jià)連接組成的多聚化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脫氧核糖核酸(DNA)，它們均可以是單鏈或雙鏈。DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA以及半合成DNA。編碼蛋白的核苷酸序列或核酸序列被稱為有義序列?！爸亟M的DNA分子”是一種經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)操作的DNA分子。
DNA“編碼序列”是一種當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制下時(shí)，在體內(nèi)或體外于細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯為一多肽的雙鏈DNA序列。由一在5’(氨基)末端的起始密碼子和一在3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定編碼序列的邊界。多聚腺苷酸信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于該編碼序列的3′。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列為保證編碼序列在一宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等等。在真核細(xì)胞中，多聚腺苷酸信號(hào)為控制序列。
“啟動(dòng)子序列”為在細(xì)胞中能夠結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的一種DNA調(diào)節(jié)區(qū)域。出于定義本發(fā)明的目的，將啟動(dòng)子序列界定為其3’末端在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處，向上游(5’方向)延伸包括在高于背景可檢出水平啟始轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動(dòng)子序列內(nèi)可發(fā)現(xiàn)一轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(例如，通過(guò)核酸酶S1作圖方便地確定)、以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(保守序列)。
在細(xì)胞中當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA時(shí)，編碼序列是由轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“控制”的，然后mRNA任選性地被轉(zhuǎn)運(yùn)RNA剪接并翻譯為由編碼序列編碼的蛋白。
“信號(hào)序列”被包括在一種將表達(dá)在細(xì)胞表面的蛋白的編碼序列的開始處。該序列編碼一信號(hào)肽，處于成熟多肽的N末端，其引導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)位該多肽。此中術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)位信號(hào)序列”用來(lái)指這類信號(hào)序列?？砂l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)位信號(hào)序列同多種真核和原核細(xì)胞的固有蛋白相關(guān)，并且通常在這兩類生物中均有功能。
術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)”此中用來(lái)指相似或同源序列，無(wú)論精確的位置同測(cè)定相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列排列可能包括間隔。因而，術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)”指序列相似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的各個(gè)方面將在隨后的部分中針對(duì)合適的基因治療載體和啟動(dòng)子、抗血管生成蛋白以及治療策略更加詳細(xì)地提出。這種分為各個(gè)部分的描述意在便于理解本發(fā)明，因而決非意在局限之。
基因治療載體如上所述，“載體”是用于將根據(jù)本發(fā)明的一種核酸轉(zhuǎn)移入一宿主細(xì)胞的任何工具。優(yōu)選的載體為病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。因而，利用病毒載體或通過(guò)DNA的直接引入便將編碼一抗血管生成蛋白或多肽結(jié)構(gòu)域片段的基因或核酸序列在體內(nèi)、離體或體外引入。通過(guò)將轉(zhuǎn)基因載體靶向于特定的細(xì)胞，例如利用病毒載體或受體配體，或者通過(guò)利用一組織特異性啟動(dòng)子或者兩者皆有，可以實(shí)現(xiàn)在靶向組織中的表達(dá)。
通常用于體內(nèi)或離體靶向和治療程序的病毒載體是基于DNA的載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。構(gòu)建和利用病毒載體的方法在本領(lǐng)域是已知的〔見，如Miller和Rosman，生物技術(shù)(BioTechniques)7980-990(1992)〕。優(yōu)選病毒載體為復(fù)制缺陷的，即它們?cè)诎屑?xì)胞中不能自主復(fù)制。大體上，在本發(fā)明范圍內(nèi)所用的復(fù)制缺陷病毒載體的基因組缺少至少一個(gè)對(duì)于病毒在所感染的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是必需的區(qū)域。這些區(qū)域或者被清除(全部或部分)，或者通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的任何技術(shù)使之無(wú)功能。這些技術(shù)包括全部去除、取代(被其它序列，特別由插入的核酸)、部分缺失或在一關(guān)鍵區(qū)域(對(duì)于復(fù)制)加入一個(gè)或多個(gè)堿基。利用遺傳學(xué)操作技術(shù)或通過(guò)誘變劑處理可以在體外(在分離的DNA上)或原位進(jìn)行這些技術(shù)。優(yōu)選復(fù)制缺陷病毒保留有其對(duì)于病毒顆粒的包裝是必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒的或缺陷的DNA病毒，例如但并不限于單純皰疹病毒(HSV)、人乳頭狀瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)等等。優(yōu)選缺陷病毒，其完全或幾乎完全缺少病毒基因。缺陷病毒在引入細(xì)胞后無(wú)感染性。利用缺陷病毒載體允許施予特定的局部區(qū)域中的細(xì)胞，而不用擔(dān)心載體能夠感染其它細(xì)胞。因此，可以特異性地靶向特定的組織。特殊載體的例子包括但并不限于缺陷的皰疹病毒1(HSV1)載體〔Kaplitt等，分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330(1991)〕、缺少糖蛋白L基因的缺陷的皰疹病毒載體〔專利公開RD 371005 A〕、或其它缺陷的皰疹病毒載體〔國(guó)際專利公開WO 94/21807號(hào)，1994年9月29日出版；國(guó)際專利公開WO 92/05263號(hào)，1994年4月2日出版〕；減毒腺病毒載體，例如由Stratford-Perricaudet等描述的載體〔臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)90626-630(1992)；還見La Salle等，科學(xué)(Science)259988-990(1993)〕；以及缺陷的腺相關(guān)病毒載體〔Samulski等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)613096-3101(1987)；Samulski等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)633822-3828(1989)；Lebkowski等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)83988-3996(1988)〕。
對(duì)于體內(nèi)給藥，優(yōu)選同病毒載體例如腺病毒載體一起使用一種適當(dāng)?shù)拿庖咭种浦委?，以避免病毒載體和所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫滅活。例如，免疫抑制細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)或抗CD4抗體可以用來(lái)阻斷對(duì)病毒載體的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)〔見，例如Wilson，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medcine)(1995)〕。另外，利用表達(dá)最小數(shù)量抗原的工程病毒載體是有益的。
腺病毒載體。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體為一種腺病毒載體。如在實(shí)施例中所示，缺陷的腺病毒載體已經(jīng)表明它們對(duì)于血管生成抑制劑ATF和制管張素的投送特別有效，這表現(xiàn)為出人意料地高效抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤發(fā)生。腺病毒為真核DNA病毒，其可以被修飾來(lái)將本發(fā)明的一種核酸有效地轉(zhuǎn)移入多種類型的細(xì)胞中。存在腺病毒的多種血清型。在這些血清型中，在本發(fā)明的范圍中優(yōu)選的是利用2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或者動(dòng)物來(lái)源的腺病毒(見WO94/26914)。那些在本發(fā)明的范圍內(nèi)可用的動(dòng)物來(lái)源的腺病毒包括犬、牛、小鼠(例Mavl、Beard等，病毒學(xué)(Virology)75(1990)81)、綿羊、豬、禽和猿(例SAV)來(lái)源的腺病毒。優(yōu)選動(dòng)物來(lái)源的腺病毒為犬腺病毒，更優(yōu)選為CAV2腺病毒(例如，Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
優(yōu)選本發(fā)明的復(fù)制缺陷腺病毒載體包括ITR、包裝序列以及目的核酸。更優(yōu)選至少腺病毒載體的E1區(qū)是無(wú)功能的。F1區(qū)中的缺失優(yōu)選在Ad5腺病毒的序列中從455擴(kuò)展至3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或382至3446位(HinfII-Sau3A片段)。其它區(qū)域也可以被修飾，特別是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)，或者在晚期基因L1-L5的任何一個(gè)中。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)具有一缺失(Ad1.0)。E1缺失腺病毒的例子公布在EP 185,573中，其內(nèi)容并入此中作為參考。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)具有一缺失(Ad3.0)。E1/E4缺失腺病毒的例子公布在WO95/02697和WO96/22378中，其內(nèi)容并入此中作為參考。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有一缺失，而E4區(qū)和核酸序列插入其中(見FR94 13355，其內(nèi)容并入此中作為參考)。
根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷重組腺病毒可通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的任何技術(shù)制備(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195，EP 185573；Graham，歐洲分子生物學(xué)組織雜志(EMBO J.)3(1984)2917)。特別是，可以通過(guò)在一腺病毒和一其中載有目的DNA序列的質(zhì)粒間的同源重組制備它們。在所說(shuō)的腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入一合適的細(xì)胞系后發(fā)生同源重組。所用的細(xì)胞系優(yōu)選(i)可為所說(shuō)元件轉(zhuǎn)化的，并(ii)含有能夠補(bǔ)償復(fù)制缺陷腺病毒基因組部分的序列，為避免重組的風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)選以整合形式存在?？梢岳玫募?xì)胞系的例子是含有Ad5腺病毒基因組的左臂部分(12％)并整合在其基因組中的人胚腎細(xì)胞系293(Graham等，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)36(1977)59)，以及如在專利申請(qǐng)WO94/26914和WO95/02697中所描述的，能夠補(bǔ)償E1和E4功能的細(xì)胞系。利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)回收和純化重組腺病毒，這對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是眾所周知的。
腺相關(guān)病毒。腺相關(guān)病毒(AAV)是相對(duì)較小的DNA病毒，其能夠以一種穩(wěn)定且位點(diǎn)特異性的方式整合在它們感染細(xì)胞的基因組中。它們能夠感染廣泛的細(xì)胞而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)學(xué)或分化不引起任何效應(yīng)，而且它們似乎不參與人類疾病。AAV基因組已經(jīng)被克隆、測(cè)序和鑒定。其包括大約4700個(gè)堿基并在兩端各含有一大約145個(gè)堿基的倒置重復(fù)序列(ITR)區(qū)，其用作病毒復(fù)制的起點(diǎn)?；蚪M的其余部分被分為兩個(gè)具有包裝功能的基本區(qū)域基因組的左臂部分，其含有參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；以及基因組的右臂部分，其含有編碼病毒包殼蛋白的cap基因。
在體外和體內(nèi)應(yīng)用衍生自AAV的載體來(lái)轉(zhuǎn)移基因已有描述(見WO91/18088；WO 93/09239；US 4,797,368，US 5,139,941，EP 488 528)。這些出版物描述了各種AAV衍生的構(gòu)建物，其中rep和/或cap基因被刪除并由目的基因取代，以及這些構(gòu)建用于體外(轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的細(xì)胞)或體內(nèi)(直接轉(zhuǎn)入生物體)轉(zhuǎn)移所說(shuō)目的基因的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制缺陷重組AAV可以通過(guò)將一含有由AAV的倒置重復(fù)序列(ITR)區(qū)域作為側(cè)翼的目的核酸序列的質(zhì)粒和一載有AAV包裝基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入一被人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細(xì)胞系。然后利用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)純化所產(chǎn)生的AAV重組體。
因而本發(fā)明還涉及一種AAV衍生的重組病毒，其基因組含有由AAV的ITR作為側(cè)翼的編碼一種抗血管生成因子的核酸編碼序列。本發(fā)明還涉及一種含有由AAV的ITR作為側(cè)翼的編碼一種抗血管生成因子的核酸編碼序列的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒本身可用于轉(zhuǎn)移核酸序列，適當(dāng)時(shí)可將質(zhì)粒摻入一脂質(zhì)體載體(假病毒)中。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在另一實(shí)施方案中，基因可被引入一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如在Anderson等，美國(guó)專利5,399,346號(hào)；Mann等，1983，細(xì)胞(Cell)33153；Temin等，美國(guó)專利4,650,764號(hào)；Temin等，美國(guó)專利4,980,289號(hào)；Markowitz等，1988，病毒學(xué)雜志621120；Temin等，美國(guó)專利5,124,263號(hào)；EP 453242，EP178220；Bernstein等，遺傳學(xué)工程(Genet.Eng.)7(1985)235；McCormick，生物技術(shù)(BioTechnology)3(1985)689；國(guó)際專利公開第WO 95/07358號(hào)，1995年3月16日出版，Dougherty等；以及Kuo等，1993，血液(Blood)82845中所描述的。逆轉(zhuǎn)錄病毒為整合病毒，其感染分裂細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括兩個(gè)LTR、一種包裝序列和3個(gè)編碼區(qū)域(gag、pol和env)。在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，通常全部或部分刪除gag、pol和env基因，并用并源的目的核酸序列置換。這些載體可由不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建，例如HIV、MoMuLV(“小鼠莫洛尼白血病病毒”)、MSV(“小鼠莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(“哈維肉瘤病毒”)、SNV(“脾壞死病毒”)、RSV(“勞斯肉瘤病毒”)以及弗蘭德病毒。缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體公布于WO95/02697中。
總體上，為了構(gòu)建含有一核酸序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，先構(gòu)建一含有LTR、包裝序列和編碼序列的質(zhì)粒。將該構(gòu)建用于轉(zhuǎn)染一包裝細(xì)胞系，其能夠反式提供在質(zhì)粒中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒的功能。通常，于是包裝細(xì)胞系能夠表達(dá)gag、pol和env基因。此類包裝細(xì)胞系在本領(lǐng)域中已有描述，特別是細(xì)胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP細(xì)胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO89/07150)。此外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在LTR內(nèi)可以含有修飾以抑制轉(zhuǎn)錄活性以及可能包括部分gag基因的廣泛的包裝序列(Bender等，病毒學(xué)雜志61(1987)1639)。利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
可以構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體發(fā)揮感染顆粒的功能或進(jìn)行單輪轉(zhuǎn)染。在前例中，將病毒修飾為保留除那些負(fù)責(zé)致瘤轉(zhuǎn)化特性基因外的所有基因，并表達(dá)外源基因。制備非感染性病毒載體以破壞病毒包裝信號(hào)，但保留包裝共同引入的經(jīng)改造含有外源基因的病毒所需的結(jié)構(gòu)基因以及包裝信號(hào)。因此，所制備的病毒顆粒不能產(chǎn)生另外的病毒。
在1995年10月出版的國(guó)際專利公開WO95/28494中描述了靶向基因轉(zhuǎn)移。
非病毒載體。載體也可以以無(wú)轉(zhuǎn)染輔劑的核酸形式或同轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑如脂質(zhì)體一起體內(nèi)引入。在過(guò)去的十年越來(lái)越多地利用脂質(zhì)體體外包裝和轉(zhuǎn)染核酸。設(shè)計(jì)來(lái)限制脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中所遇到的困難和危險(xiǎn)的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)可被用來(lái)制備用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)志物基因的脂質(zhì)體〔Felgner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)847413-7417(1987)；見Mackey等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)858027-8031(1988)；Ulmer等，科學(xué)2591745-1748(1993)〕。陽(yáng)離子脂質(zhì)的應(yīng)用可以促進(jìn)帶負(fù)電荷核酸的包裝，并促進(jìn)其同帶負(fù)電荷細(xì)胞膜的融合〔Felgner和Ringold，科學(xué)337387-388(1989)〕。在國(guó)際專利公開WO95/18863和WO96/17823以及在美國(guó)專利5,459,127號(hào)中描述了用于核酸轉(zhuǎn)移的特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。體內(nèi)利用脂質(zhì)體將外源基因引入特定的器官具有某些實(shí)際優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體對(duì)特定細(xì)胞的分子靶向代表一方面益處。很明顯，對(duì)特殊細(xì)胞類型的針對(duì)性轉(zhuǎn)染在一具有細(xì)胞異質(zhì)性的組織中特別有利，例如胰腺、肝臟、腎臟以及腦。為了靶向的目的，可以將脂質(zhì)化學(xué)偶聯(lián)至其它分子上〔見Mackey等，同前〕。靶向肽，例如激素或神經(jīng)遞質(zhì)，以及蛋白如抗體，或非肽分子可以化學(xué)偶聯(lián)至脂質(zhì)體上。
其它分子對(duì)便于體內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)染也是有用的，如一種陽(yáng)離子寡肽(例如，國(guó)際專利公開WO95/21931)、衍生自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如，國(guó)際專利公開WO96/25508)、或一種陽(yáng)離子多聚體(例如，國(guó)際專利公開WO95/21931)。
體內(nèi)以一種裸DNA質(zhì)粒引入載體也是可能的。用于基因治療的裸DNA載體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法引入目的宿主細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍的使用、或者DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)劑的使用〔見，例如Wu等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267963-967(1992)；Wu和Wu，生物化學(xué)雜志26314621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大專利申請(qǐng)2,012,311號(hào)，1990年3月15日提交；Williams等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)882726-2730(1991)〕。受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移方法也可以使用〔Curiel等，人類基因治療(Hum.Gene Ther.)3147-154(1992)；Wu和Wu，生物化學(xué)雜志2624429-4432(1987)〕。
核酸也可以以裸DNA形式給藥。在美國(guó)專利5,580,859和5,589,466中公布了向哺乳動(dòng)物肌肉組織給予裸DNA的方法，其內(nèi)容并入此中作為參考。
調(diào)節(jié)區(qū)域。本發(fā)明載體對(duì)抗血管生成因子的表達(dá)可以由任何調(diào)節(jié)區(qū)域控制，即本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件，但這些調(diào)節(jié)元件必需在選擇用來(lái)表達(dá)的宿主靶腫瘤中有功能。
調(diào)節(jié)區(qū)域可以包括一用于在腫瘤中功能性轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域、一位于目的基因3’端顯示轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的區(qū)域，以及一多聚腺苷酸位點(diǎn)。所有這些元件組成表達(dá)盒。
在本發(fā)明中可以利用的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是天然負(fù)責(zé)核酸的表達(dá)。也可以是來(lái)自不同來(lái)源的。特別是，其可以為真核或病毒基因的啟動(dòng)子序列。例如，其可能是衍生自預(yù)期感染的細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子序列。類似地，其可能是來(lái)自病毒(包括所用的腺病毒)的基因組啟動(dòng)子序列。在這點(diǎn)上，應(yīng)該提到例如E1A、MLP、CMV和RSV基因等的啟動(dòng)子。
另外，可以通過(guò)添加活化或調(diào)節(jié)序列或允許組織特異性或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的序列來(lái)修飾啟動(dòng)子(烯醇酶和GFAP啟動(dòng)子等)。此外，當(dāng)核酸不含有啟動(dòng)子序列時(shí)，其可以插入在這類基因下游的病毒基因組中。
一些對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施有用的啟動(dòng)子是普遍存在的啟動(dòng)子(例如HPRT、波形蛋白、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白)、中間纖維啟動(dòng)子(例如肌纖維蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP)、治療性基因啟動(dòng)子(例如MDR型、CFTR、因子VIII)、組織特異性啟動(dòng)子(例如在平滑肌細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、優(yōu)選在分裂細(xì)胞中活化的啟動(dòng)子、對(duì)某種刺激有反應(yīng)的啟動(dòng)子(例如類固醇激素受體、視黃酸受體)、四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、巨細(xì)胞病毒立即早期蛋白、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR、金屬硫蛋白、SV-40、Ela和MLP啟動(dòng)子。在WO96/01313、US5,168,062和5,385,839中描述了四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和CMV啟動(dòng)子，其內(nèi)容并入此中作為參考。
因此，可用來(lái)控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括但并不限于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、在勞斯肉瘤病毒的3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列中所含的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980，細(xì)胞(Cell)22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；原核表達(dá)載體如b-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kawaroff等，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)753727-3731)、或tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)8021-25)；還見“科學(xué)美國(guó)人”(Scientific American)，1980，245274-94中的“來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白”；來(lái)自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件如Gal4啟動(dòng)子、ADC(乙醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子；以及表現(xiàn)出組織特異性并已用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域在胰腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域(Swift等，1984，細(xì)胞38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1997，肝臟病學(xué)(Hepatology)7425-515)；在胰島β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，自然315115-122)、在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedle等，1984，細(xì)胞38647-658；Adames等，1985，自然318533-538；Alexander等，1987，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)71436-1444)、在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，1986，細(xì)胞45485-495)、在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，1987，基因和發(fā)育(Genes and Devel.)1268-276)、在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，1985，分子細(xì)胞生物學(xué)51639-1648；Hammer等，1987，科學(xué)23553-58)、在肝臟中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，1987，基因和發(fā)育1161-171)、在髓系細(xì)胞中有活性的β球蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，1985，自然315338-340；Kollias等，1986，細(xì)胞4689-94)、在腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，1987，細(xì)胞48703-712)，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，1985，自然314283-286)、以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，1986，科學(xué)2341372-1378)。
編碼抗血管生成蛋白的基因根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的載體可用來(lái)將一編碼抗血管生成蛋白的基因轉(zhuǎn)移入腫瘤中。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管生成因子為含有EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶氨基末端片段(ATF)。該片段對(duì)應(yīng)ATF的大約1至135位氨基酸殘基。
在另一實(shí)施方案中，可以一種融合蛋白的形式提供ATF，例如同免疫球蛋白或人血清白蛋白〔WO93/15199〕，其全部?jī)?nèi)容特別并入此中作為參考。
雖然優(yōu)選人尿激酶ATF，但在本發(fā)明中用的有效ATF可衍生自任何尿激酶，例如小鼠尿激酶。另外，本發(fā)明考慮給予一種通過(guò)用人ATF相應(yīng)的殘基置換特定氨基酸殘基來(lái)修飾的非人尿激酶ATF。例如，可以在以下一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選全部氨基酸殘基處修飾小鼠ATF23位酪氨酸改為天冬酰胺；28位精氨酸改為天冬酰胺；30位精氨酸改為組氨酸；以及31位精氨酸改為色氨酸。因此，來(lái)自任何來(lái)源的尿激酶ATF均可人源化。這利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)修飾編碼序列可以很容易完成。
根據(jù)本發(fā)明也可利用編碼其它抗血管生成蛋白的基因。這種基因包括但并不限于編碼包括含有1至3鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)的制管張素的基因〔O’Reilly等，細(xì)胞79315-328(1994)；WO97/29242；US5,639,725〕；金屬蛋白酶的組織抑素〔Johnson等，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell.Phvsiol.)160194-202(1994)〕；FGF或VEGF的抑制劑；以及內(nèi)皮抑素的基因〔WO97/15666〕。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管生成因子為制管張素，特別是制管張素的1至3鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗血管生成因子為具有從大約氨基酸殘基1至殘基333的纖溶酶原氨基酸序列的纖溶酶原(Plg)氨基末端片段。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，纖溶酶原/制管張素的氨基末端片段來(lái)自人纖溶酶原(制管張素)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明施予編碼血管生成因子受體的可溶形式-包括但并不限于可溶VGF/VEGF受體和可溶尿激酶受體〔Wilhem等，歐洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBS Letters)337131-134(1994)〕-的基因。
總之，任何參與血管生成的編碼一拮抗內(nèi)皮細(xì)胞活化或遷移的蛋白或可溶受體的基因可以用于本發(fā)明的基因治療載體和方法。但出于上面指出并在下面展示的原因，仍特別值得注意的是ATF或制管張素的基因治療轉(zhuǎn)移在這點(diǎn)上非常有效，可以從任何來(lái)源分離編碼抗血管生成因子的基因，不論是基因組DNA或cDNA，特別是從人cDNA或基因組文庫(kù)。如上所述〔見，例如Sambrook等，1989，同前〕，用于獲得此類基因的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
由于核苷酸編碼序列的簡(jiǎn)并性，編碼相同氨基酸序列的其它核酸序列作為抗血管生成因子的基因可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中，而且應(yīng)認(rèn)為它們屬于本發(fā)明的范圍。這些包括但并不限于等位基因、來(lái)自其它物種的同源基因，以及包括抗血管生成因子基因的全部或部分的核苷酸序列，其通過(guò)編碼該序列內(nèi)同一氨基酸殘基的不同密碼子的置換而改變，因而產(chǎn)生一沉默突變。類似的，本發(fā)明的抗血管生成因子衍生物包括但并不限于那些作為一級(jí)氨基酸序列，含有包括通過(guò)功能等價(jià)氨基酸殘基置換序列內(nèi)殘基導(dǎo)致保守氨基酸置換而改變的序列的抗血管生成因子蛋白的全部或部分氨基酸序列。例如，序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以由類似極性的作為一個(gè)功能等價(jià)體的另一氨基酸置換導(dǎo)致一沉默突變。序列內(nèi)一個(gè)氨基酸的置換物可以選自該氨基酸所屬類的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。此類變化預(yù)期不會(huì)影響通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的表觀分子量或等電點(diǎn)。
特別優(yōu)選的置換為-Lys對(duì)Arg和反之以便可以保持一正電荷；-Glu對(duì)Asp和反之以便可以保持一負(fù)電荷；-Ser對(duì)Thr以便可以保持一自由的-OH；以及-G1n對(duì)Asn以便可以保持一自由的CONH2。
本發(fā)明的編碼抗血管生成因子衍生物和類似物的基因可以通過(guò)本領(lǐng)域已知各種方法制備。導(dǎo)致它們制備的操作可以發(fā)生在基因或蛋白質(zhì)水平。例如，可以通過(guò)眾多本領(lǐng)域已知策略中的任何策略修飾所克隆的抗血管生成因子基因序列(Sambrook等，1989，同前)。序列可以在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)用限制性核酸內(nèi)切酶切開，隨后如果需要通過(guò)進(jìn)一步酶促修飾，分離并體外連接。在編碼一抗血管生成因子的衍生物或類似物的基因的制備中，應(yīng)小心以保證所修飾的基因在編碼預(yù)期活性的基因區(qū)域中仍然在同抗血管生成因子基因一樣的翻譯閱讀框中，且未被翻譯終止信號(hào)打斷。
此外，編碼抗血管生成因子的核酸序列可以在體外或體內(nèi)誘變來(lái)產(chǎn)生和/或破壞翻譯、啟動(dòng)、和/或終止序列，或者產(chǎn)生編碼區(qū)中的改變和/或形成新的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)或破壞已存在的位點(diǎn)，以便于進(jìn)一步體外修飾，如形成一嵌合基因。優(yōu)選這些突變提高突變的抗血管生成因子基因產(chǎn)物的功能活性?？梢岳萌魏伪绢I(lǐng)域已知的誘變技術(shù)，包括但并不限于體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson，C.等，1978，生物化學(xué)雜志2536551；Zoller和Smith，1984，DNA 3479-488；Oliphant等，1986，基因(Gene)44177；Hutchinson等，1986，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)83710)、TAB接頭(Pharmacia)的應(yīng)用等等。優(yōu)選PCR技術(shù)用于定點(diǎn)誘變(見Higuchi，1989，“利用PCR來(lái)加工DNA”，見PCR技術(shù)DNA擴(kuò)增的原則和應(yīng)用(PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification)，H.Erlich，編，Stockton出版社，第6章61-70頁(yè))。
治療靶和策略本發(fā)明的方法使人能夠治療腫瘤。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)可以通過(guò)各種注射、輸注、直接應(yīng)用等中的一個(gè)合理選擇來(lái)特異性并單方面感染大量的腫瘤細(xì)胞。
藥物組合物。對(duì)于本發(fā)明的應(yīng)用，載體，無(wú)論以病毒載體、核酸脂質(zhì)復(fù)合物的形式，或者裸DNA的形式，優(yōu)選同一種或多種藥學(xué)可用的載體聯(lián)合以形成可注射的配制品。短語(yǔ)“藥學(xué)可用”指分子和組合物是生理上可耐受的，并且用于人時(shí)不產(chǎn)生典型的過(guò)敏或類似的不適反應(yīng)，如反胃、眩暈等等。如此中所用的，優(yōu)選術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可用”意指由聯(lián)邦或一州政府的或者在美國(guó)藥典或其它用于動(dòng)物且特別是人的大眾公認(rèn)的藥典中所列的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。術(shù)語(yǔ)“載體”指同化合物共同施予的一種稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。此類藥學(xué)載體可以為無(wú)菌液體，例如水和油，包括來(lái)自石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似的。優(yōu)選使用水或鹽水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作為載體，特別是用于注射溶液。在E.W.Martin的“Remington藥劑科學(xué)”(Remington PharmaceuticalSciences)中描述了適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體。這些特別可以是等滲、無(wú)菌鹽溶液(磷酸一鈉或二鈉鹽、鈉、鉀、鈣、鎂的氯化物及類似的，或者這些鹽的混合物)，或者干的，特別是凍干的組合物，其根據(jù)情況通過(guò)加入無(wú)菌水或生理鹽水來(lái)形成可注射的溶液。
優(yōu)選的無(wú)菌可注射制劑可以為在無(wú)毒的非腸道可用的溶劑或稀釋劑中的溶液或懸液。藥學(xué)可用的載體的例子是鹽水、緩沖鹽水、等滲鹽水(例如，磷酸一鈉或二鈉鹽、鈉、鉀、鈣、鎂的氯化物及類似的，或者這些鹽的混合物)、林格氏液、葡萄糖、水、無(wú)菌水、甘油、乙醇以及它們的組合?？梢苑奖愕乩?，3-丁二醇和無(wú)菌脂肪油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。任何溫和的脂肪油均可利用，包括合成的甘油單酸或二酸酯。脂肪酸如油酸也可用于可注射制劑的制備。
短語(yǔ)“治療有效量”此中用來(lái)指足夠減少至少15％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少90％，而最優(yōu)選阻止在活性、功能和宿主的反應(yīng)方面的臨床重要缺陷的量?；蛘?，治療有效量是足夠引起宿主臨床重要條件改善的量。
用于給藥的病毒劑量可作為多種參數(shù)的一種函數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)，特別是作為所考慮的給藥位點(diǎn)(腫瘤)、注射次數(shù)、所表達(dá)基因或預(yù)期的治療時(shí)間的函數(shù)來(lái)調(diào)整。大體上，配制本發(fā)明的重組腺病毒并以在104和1014pfu之間，優(yōu)選106至1011pfu的劑量形式施予。術(shù)語(yǔ)pfu(噬斑形成單位)相當(dāng)于病毒溶液的感染性，其是通過(guò)感染合適的細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)定通常15天后感染細(xì)胞的噬斑數(shù)來(lái)確定。用于測(cè)定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)報(bào)道。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括濃度大約1×109pfu/100ul的含有抗血管生成因子基因，例如，ATF基因(AdATF)或制管張素(AdK3)的腺病毒。
根據(jù)本發(fā)明的組合物對(duì)于向腫瘤給藥非常有用。
腫瘤。本發(fā)明是針對(duì)腫瘤特別是實(shí)體瘤的治療。根據(jù)本發(fā)明可以治療的實(shí)體瘤的例子包括肉瘤和癌，例如但并不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管源性癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、Wilms癌、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。
在另一實(shí)施方案中，在如那些在宮頸、食管和肺中的上皮組織中治療或預(yù)防增生不良性變化(例如化生和發(fā)育不良)。因此，本發(fā)明提供用于已知或可疑進(jìn)展為瘤或癌的狀態(tài)的治療，特別是已發(fā)生由增生、化生或者最特別是增生不良組成的非增生細(xì)胞生長(zhǎng)的部位(對(duì)于此類異常生長(zhǎng)狀況的綜述，見Robbins和Angell，1976，基礎(chǔ)病理學(xué)(BasicPathology)，第二版，W.B.Saunders公司，費(fèi)城，68-79頁(yè))。增生是一種受控的細(xì)胞增殖形式，涉及組織或器官中細(xì)胞數(shù)目的增加，而在結(jié)構(gòu)或功能上卻無(wú)明顯改變。作為一個(gè)例子，子宮內(nèi)膜增生通常進(jìn)展為子宮內(nèi)膜癌?；且环N受控細(xì)胞生長(zhǎng)的形式，其中一種類型的成熟或完全分化細(xì)胞置換另一種類型的成熟細(xì)胞。化生可以發(fā)生在上皮或結(jié)締組織細(xì)胞中。不典型化生包括略微異常化生的上皮。增生不良常常是腫瘤的前兆，并且主要發(fā)生在上皮；其為非腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的最主要的異常形式，包括個(gè)體細(xì)胞一致性以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的喪失。增生不良細(xì)胞通常具有異常大的、深染的核，并表現(xiàn)出多形性。增生不良典型地發(fā)生在存在慢性刺激或炎癥的部位，且通常出現(xiàn)在宮頸、呼吸道、口腔和膽囊中。此類異常的綜述見Fishman等，1985，醫(yī)學(xué)(Medicine)，第2版，J.B.Lippincott公司，費(fèi)城。
本發(fā)明還涉及通過(guò)向不適當(dāng)生長(zhǎng)的組織給予治療有效劑量的本發(fā)明載體，對(duì)非惡性腫瘤以及其它涉及通過(guò)血管生成而擴(kuò)大的不適當(dāng)細(xì)胞或組織生長(zhǎng)的異常進(jìn)行治療。例如，考慮本發(fā)明對(duì)于動(dòng)靜脈畸形的治療是有用的，特別是在顱內(nèi)位置中的。本發(fā)明還可以用于治療銀屑病，一種以炎癥和血管增生為特征的皮膚疾??；以及良性前列腺增生，一種同炎癥和可能的血管增生相關(guān)的疾病。也考慮其它高度增殖性疾病的治療。
給藥方法。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)腫瘤的優(yōu)選給藥途徑為直接注射入腫瘤。例如，可以用任何本領(lǐng)域可用的技術(shù)顯示腫瘤，如磁共振成象或計(jì)算機(jī)輔助斷層攝影，并通過(guò)立體定位注射給予該治療組合物。
或者，如果通過(guò)一特殊抗原鑒定了腫瘤靶，則本發(fā)明的載體可以靶向于如上所述的抗原，并系統(tǒng)地或亞系統(tǒng)地適當(dāng)施予，例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)等。
聯(lián)合治療。雖然本發(fā)明的方法在抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中是有效的，但本發(fā)明的載體和方法可有利地同其它治療形式一同使用，包括但并不限于外科、輻射、化療以及其它基因治療。
例如，本發(fā)明的載體可以同具有收縮血管活性并減少腫瘤血流的一氧化氮抑制劑聯(lián)合給予。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體可以同化療藥一起給藥，例如但并不限于紫杉醇、泰索帝(taxotere)以及其它紫杉類化合物〔例如，如在美國(guó)專利4,857,653；4,814,470；4,924,011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493號(hào)中；歐洲專利0 253 738號(hào)中；以及國(guó)際專利公開號(hào)WO91/17976，WO93/00928，WO93/00929，和WO96/01815中公布的〕，或者其它化療藥，例如順鉑(和其它鉑嵌合化合物)、依托泊甙和磷酸依托泊甙、博來(lái)霉素、絲裂霉素C、CCNU、阿霉素、柔紅霉素、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺以及諸如此類。
在另一實(shí)施方案中，如上所述本發(fā)明的載體可以聯(lián)合其它腫瘤基因療法施予，例如但決不限于p53或其類似物如CTS-1〔WO97/04092〕、胸苷激酶(TK)、抗RAS單鏈抗體、α干擾素或γ干擾素等等。用于基因治療的任何載體均可聯(lián)合本發(fā)明使用，例如一種病毒載體或裸DNA。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，單一一種載體(病毒或DNA)用來(lái)轉(zhuǎn)移編碼抗血管生成因子的基因和另一腫瘤治療基因。
在另一方面，本發(fā)明在異源基因編碼一靶向標(biāo)志或提高宿主免疫系統(tǒng)機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子時(shí)，提供抗血管生成因子基因的調(diào)節(jié)表達(dá)，使其同用于增殖性異常如腫瘤和癌的治療中有用蛋白的表達(dá)一致。此類免疫調(diào)節(jié)分子(或免疫效應(yīng)劑)的異源性基因的例子包括，但并不限于，α干擾素、γ干擾素、β干擾素、ω干擾素、τ干擾素、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、白介素2、白介素7、白介素12、白介素15、B7-1 T細(xì)胞共刺激分子、B7-2 T細(xì)胞共刺激分子、免疫細(xì)胞粘附分子(ICAM)-1 T細(xì)胞共刺激分子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、及它們的聯(lián)合。
參考下面的實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明，提供這些實(shí)施例以求舉例說(shuō)明而并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1利用ATF的基因治療抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移實(shí)施例1表明uPA/uPAR拮抗劑ATF(尿激酶氨基末端片段)的表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。構(gòu)建了一由CMV啟動(dòng)子表達(dá)小鼠ATF的缺陷型腺病毒(AdmATF)。在兩個(gè)不同的小鼠模型中AdmATF的單次腫瘤內(nèi)注射抑制已建立腫瘤的生長(zhǎng)，并延遲了腫瘤的播散。這些效應(yīng)同在注射部位內(nèi)及其緊密鄰近處新生血管化的顯著抑制相關(guān)。該效應(yīng)的強(qiáng)度在小鼠ATF抑制人源腫瘤血管生成的能力中非常顯著。
方法重組腺病毒。AdmATF為一種由CMV啟動(dòng)子表達(dá)小鼠ATF基因的E1缺陷型重組腺病毒。利用質(zhì)粒pDB1519 16作為起始材料來(lái)在成熟uPA的殘基135后引入一終止密碼子。簡(jiǎn)單地講，分離了uPA編碼序列(包括其信號(hào)肽)，用NsiI酶切，并將跟隨有一終止密碼子的殘基128至135作為一合成片段再次引入。然后將ATF開放閱讀框插在CMV啟動(dòng)子和SV40晚期多聚腺苷酸信號(hào)序列之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pEM8-mATF。該質(zhì)粒除了將ATF表達(dá)編碼框插在位點(diǎn)382和3446之間代替E1基因外，還帶有Ad5基因組的前6.3kb(圖1A)。在293細(xì)胞中通過(guò)在pEM8-mATF和ClaI酶切的AdRSVbGal DNA之間的同源重組構(gòu)建AdmATF 25。在生長(zhǎng)于軟瓊脂中的293來(lái)源的細(xì)胞單層上分離單個(gè)病毒噬斑，在新鮮293細(xì)胞上擴(kuò)增并抽提病毒DNA(26)。EcoRI、EcoRV和AvrII+NdeI限制性酶切分析證實(shí)重組腺病毒的同一性和克隆性。AdCO1為一缺陷型對(duì)照腺病毒，其除不攜帶任何轉(zhuǎn)基因表達(dá)編碼框代替E1外同AdmATF是相同的。兩種病毒均在組成性表達(dá)Ad5 E1基因的一種人胚腎細(xì)胞系293中放大(27)。按已描述方法制備病毒原種并測(cè)定滴度(25)。除非另外說(shuō)明，以300PFU/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染MDA-MB-231細(xì)胞和劉易斯肺癌(LLC)細(xì)胞。以前已表明當(dāng)使用病毒AdRSVbGal(25)時(shí)，這些感染條件分別翻譯為80和65％的b-半乳糖苷酶表達(dá)細(xì)胞。
RNA 印跡分析。用AdmATF或AdCO1感染中度匯合的MDA-MB-231細(xì)胞，并在感染后(p.i.)24hr通過(guò)RNAZOL步驟(Biogentex公司)抽提總RNA，并且純化多聚腺苷酸化的RNA。將樣品在1％的甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，并轉(zhuǎn)移至Hybond N膜(Amersham)上。在10ml 50％去離子甲酰胺、0.2％SDS、5×Denhardt液中將膜用變性的超聲處理的鮭魚精DNA(100ug/ml)于42℃預(yù)雜交1hr，并同一由小鼠uPA cDNA用隨機(jī)引物(32P)標(biāo)記的1.2kb XbaI-HindIII片段孵育過(guò)夜(16)。將膜在2×SSC/0.1％SDS中于50℃1hr洗兩次，于0.1×SSC中30min洗一次，并于室溫用柯達(dá)XAR-5底片曝光1hr。
蛋白質(zhì)印跡分析。收集感染后24hr的病毒感染細(xì)胞的上清，在轉(zhuǎn)移至一硝酸纖維素膜上之前，于一12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳(每個(gè)泳道400ug蛋白)(Schleicher & Schuell)。在封閉緩沖液中孵育1hr后，將膜用一抗小鼠uPA的多克隆抗血清孵育1hr(Pr.RLijnen，Leuven，比利時(shí))，隨后用一辣根過(guò)氧化物酶連接的山羊抗兔血清(Dako)再孵育1hr。將膜在PBS-Tween緩沖液中洗3次，并同3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)孵育5min。
細(xì)胞結(jié)合蛋白水解的抑制。首先通過(guò)將LLC細(xì)胞單層在甘氨酸-HCl(pH3)中酸化3min，使天然的uPA從其細(xì)胞表面受體上脫離，隨后在0.5M HEPES緩沖液中孵育。然后將細(xì)胞同AdCO1-和AdmATF-感染293細(xì)胞的上清于37℃孵育20min。在PBS/0.1％BSA中洗滌3次后，將細(xì)胞同1nM的小鼠uPA(Pr.R Lijnen，Leuven，比利時(shí))于37℃孵育20min。然后通過(guò)在PBS中洗滌去除未結(jié)合的uPA，并通過(guò)加入0.4uM的人纖溶酶原和纖溶酶底物S-2251(Kabi Vitrum，瑞典)對(duì)細(xì)胞結(jié)合的uPA定量。
體外侵入試驗(yàn)。注射后24hr，用1mM EDTA解離LLC細(xì)胞，PBS中洗滌，并重懸于補(bǔ)有0.1％BSA的無(wú)FCS DMEM培養(yǎng)基中。按照已描述的方法在一Transwell單元中進(jìn)行侵入試驗(yàn)(19)。簡(jiǎn)言之，用160ugMatrigel(Becton Dickinson)包被1.2um孔徑的多聚碳酸酯濾膜(Transwell，Costar)，并干燥。將Transwell單元的底層盒充滿含10ng/ml EGF的人成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液，并在上層盒中接種3×105感染細(xì)胞。37℃孵育24hr后，吉姆薩染色后在一光學(xué)顯微鏡下確定到達(dá)下層盒中的細(xì)胞數(shù)。
同系腫瘤模型。將劉易斯肺癌在C57BL/6同系小鼠中順序傳代。簡(jiǎn)言之，在腫瘤達(dá)到600-1200mm3的體積時(shí)，將皮下植入一LLC腫瘤的C57BL/6處死。在用一棉花篩濾過(guò)后將腫瘤細(xì)胞重懸在0.9％鹽溶液中，并將2×106細(xì)胞(0.5ml)皮下植入6-7周齡C57BL/6雌性小鼠的背部。5天后，腫瘤達(dá)到大約20mm3的大小，向它們注射0.2ml PBS(n＝8)、或109PFU(0.2ml)的AdCO1(n＝10)或AdmATF(n＝10)。在注射后第5、10和15天測(cè)定原發(fā)腫瘤的大小。在注射后第16天，腹膜內(nèi)注射65mg BrdU后3hr評(píng)價(jià)肺轉(zhuǎn)移癌的數(shù)量。取出肺組織，在乙酰甲醛酸(AFA)中固定過(guò)夜，并將石蠟切片在4N HCl中孵育15min，通過(guò)在PBS/0.5％BSA/0.1％Tween20中洗兩次15min中和并飽和，隨后于37℃同過(guò)氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗BrdU單克隆抗體(Boehringer)孵育45min，并同AEC孵育。在一光學(xué)顯微鏡下以25倍放大計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性灶。
無(wú)胸腺小鼠模型。將培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞(ATCC HTB 26)收集、洗滌、以1.5×107細(xì)胞/ml重懸在PBS中，并將3×106細(xì)胞皮下注入6-7周齡裸鼠的背部。當(dāng)腫瘤達(dá)到15-20mm3體積時(shí)(即11天后)，動(dòng)物接受一次腫瘤內(nèi)注射109PFU的AdmATF(n＝5)或AdCO1(n＝5)，或者PBS(n＝5)，監(jiān)測(cè)腫瘤的大小直至注射后52天，其后處死動(dòng)物并按照已描述的方法評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管化的程度(28)。簡(jiǎn)言之，將腫瘤組織在AFA中固定過(guò)夜，轉(zhuǎn)移至100％乙醇，石蠟包埋并制備5um厚切片。甲苯處理和再水化后，將切片于37℃用2ug/ml蛋白酶K浸透15min。用0.3％H2O2淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性15min。將切片用PBS洗滌，在7.5％BSA中孵育15min，并用一抗人vWF的兔多克隆血清(Dako)孵育30min。在PBS中洗滌兩次后，將切片用生物素化山羊抗兔IgG抗體孵育30min，洗滌并在加入AEC前用鏈親和素-過(guò)氧化物酶孵育15min。首先以低放大倍數(shù)鑒定新生血管熱點(diǎn)并對(duì)vWF陽(yáng)性微血管定量。按照已述方法用Meyer蘇木素復(fù)染(28)。
為了評(píng)價(jià)在腫瘤上AdmATF的感染，首先用AdmATF或AdCO1以50PFU/細(xì)胞的MOI感染匯合的MDA-MB-231細(xì)胞。感染后24hr洗滌細(xì)胞，重懸于120ul PBS中，用80ul冰冷的Matrigel固定，并將1.3×106細(xì)胞皮下植入裸鼠的背部。跟蹤腫瘤的建立和生長(zhǎng)直至植入后第51天。
結(jié)果AdmATF的分子和功能鑒定。AdmATF為一種由CMV啟動(dòng)子表達(dá)小鼠ATF的缺陷型重組腺病毒，而AdCO1為一“空”對(duì)照腺病毒(圖1A)。考慮其感染后表達(dá)功能性u(píng)PA拮抗劑的能力，首先進(jìn)行體外研究來(lái)鑒定AdmATF。通過(guò)對(duì)由AdmATF感染24hr的MDA-MB-231細(xì)胞抽提的poly(A+)RNA的RNA印跡分析證實(shí)了ATF基因的表達(dá)，但在AdCO1則沒有(圖1B)。在293、LLC和MDA-MB-231細(xì)胞中均通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了AdmATF感染細(xì)胞的ATF分泌。例如，僅在來(lái)自AdmATF感染后24hr的293細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測(cè)到與成熟肽(15.3kDa)分子量相應(yīng)的ATF特異性多肽(圖1C)。
ATF為一種有效的uPA拮抗劑，其結(jié)合至其細(xì)胞表面受體(uPAR)，而且已知該復(fù)合物的破壞大大抑制無(wú)活性的纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)變。因此測(cè)定LLC細(xì)胞相關(guān)纖溶酶轉(zhuǎn)變來(lái)評(píng)價(jià)由AdmATF感染細(xì)胞分泌的ATF的功能性。作為一前提條件，我們檢測(cè)到LLC細(xì)胞表現(xiàn)出顯著水平的細(xì)胞相關(guān)uPA活性(資料未示)，表明它們分泌uPA并表達(dá)uPAR。在同AdmATF感染293細(xì)胞上清孵育并加入1nM小鼠uPA前，通過(guò)一種溫和酸處理預(yù)先從細(xì)胞表面清除內(nèi)源性u(píng)PA，纖溶酶轉(zhuǎn)變/活性顯著降低(圖2A)。
uPA/uPAR復(fù)合物對(duì)于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性也是關(guān)鍵的。利用一體外細(xì)胞侵入試驗(yàn)證實(shí)AdmATF的功能性。將LLC細(xì)胞用AdmATF或AdCO1感染，并在24hr后確定遷移通過(guò)一基質(zhì)包被膜的細(xì)胞的數(shù)量(圖2B)。資料的定量證明同AdCO1對(duì)照感染相比，AdmATF感染抑制65％的LLC侵入性(n＝5)。
AdmATF的腫瘤內(nèi)注射抑制腫瘤生長(zhǎng)和播散。我們首先利用劉易斯肺癌-C57BL/6同系模型來(lái)評(píng)價(jià)同AdmATF的單次腫瘤內(nèi)給予相關(guān)的抗腫瘤效應(yīng)。皮下植入5天后，向腫瘤注射109PFU的AdmATF、109PFU的AdCO1或PBS，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)直至注射后15天。如在圖3中所示，在AdmATF處理組中特異性觀察到總體抑制。然后在注射后第16天處死動(dòng)物，并通過(guò)計(jì)數(shù)BrdU陽(yáng)性灶對(duì)肺轉(zhuǎn)移計(jì)數(shù)。雖然在注射PBS的所有動(dòng)物(n＝8)中轉(zhuǎn)移均很明顯，但在AdCO1和AdmATF處理組中在分別為9只中7只和9只中僅3只計(jì)數(shù)陽(yáng)性。同AdCO1處理(6.3)和PBS處理組(6.6)相比，在AdmATF處理組中每張肺切片BrdU陽(yáng)性灶的平均數(shù)也減少(2.7)。因而，AdmATF的單次腫瘤內(nèi)給予顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)以及在此高度進(jìn)展模型中的肺轉(zhuǎn)移。在另一獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用AdCO1或AdmATF感染荷瘤動(dòng)物，并在感染后第10和20天取出腫瘤進(jìn)行放大觀察。AdCO1注射的腫瘤在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的血管化，而來(lái)自AdmATF處理組的腫瘤僅表現(xiàn)出邊緣的血管化(圖4)。
AdmATF的抗腫瘤效應(yīng)發(fā)揮在血管生成水平。為了特異地評(píng)價(jià)腫瘤生長(zhǎng)血管生成的唯一抑制，我們研究了腺病毒介導(dǎo)的小鼠uPA/uPAR拮抗劑向植入無(wú)胸腺小鼠中的人來(lái)源MDA-MB-231乳腺癌模型中的投送。由于小鼠uPA結(jié)合人uPAR比對(duì)小鼠uPAR效率低200倍，因此在此模型中小鼠ATF在腫瘤細(xì)胞上的直接作用應(yīng)很小。皮下腫瘤細(xì)胞接種后11天，動(dòng)物接受單次109PFU的AdmATF、109PFU的AdCO1或PBS的腫瘤內(nèi)注射，并監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)直至注射后52天。雖然直至注射后32天未出現(xiàn)顯著效應(yīng)，此后在AdmATF注射組而非AdCO1注射組中出現(xiàn)明顯腫瘤生長(zhǎng)停滯(圖5)。在注射后第52天處死小鼠，并通過(guò)馮威利布蘭德因子(vWF)免疫反應(yīng)性血管的可視化評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管生成(圖6A)。同來(lái)自AdCO1注射腫瘤的切片中的18到20個(gè)相比，在來(lái)自AdmATF處理腫瘤的切片中檢測(cè)到平均4到6個(gè)血管。同對(duì)應(yīng)的AdCO1處理組相比，AdmATF注射腫瘤還幾乎未表現(xiàn)出周圍新血管化(圖6B)。當(dāng)在有Matrigel存在下于皮下接種前首先體外感染MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，AdCO1處理組中早在植入后7天腫瘤變明顯。同在來(lái)自AdCO1處理組的5只動(dòng)物中的4只中存在大的腫瘤鮮明對(duì)照，在AdmATF處理組(n＝5)中僅一個(gè)動(dòng)物中出現(xiàn)一有限大小的腫瘤。而且，AdmATF感染的腫瘤細(xì)胞接種后所發(fā)展的腫瘤比那些AdCO1感染細(xì)胞接種后發(fā)展的腫瘤較低血管化(資料未示)。
討論我們已研究了同尿激酶氨基末端非催化性片段(ATF)(一種結(jié)合至其在腫瘤(19，20)和內(nèi)皮細(xì)胞(22，23)表面上的受體(uPAR)的尿激酶有效拮抗劑)的局部投送相關(guān)的抗腫瘤效應(yīng)。通過(guò)一種由CMV啟動(dòng)子表達(dá)小鼠來(lái)源的分泌性ATF分子的缺陷型腺病毒(AdmATF)的腫瘤內(nèi)施予實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)ATF的投送。為排除繼病毒感染后的非特異性細(xì)胞毒效應(yīng)(29)，在本研究中一“空的”其它同基因腺病毒(AdCO1)用作對(duì)照病毒。這是一重要的對(duì)照也因?yàn)橹亟M腺病毒可以利用aVb3整聯(lián)蛋白來(lái)感染(30)，其為一種以某種方式參與腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的細(xì)胞表面受體(31)。
AdmATF的單次腫瘤內(nèi)注射在減少腫瘤生長(zhǎng)(圖3)和在侵襲性LLC-C57BL/6同系小鼠模型中推遲肺轉(zhuǎn)移上是有效的。小鼠ATF明顯通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞本身的侵入部分發(fā)揮這些效應(yīng)(圖2B)，這一結(jié)果同AdmATF感染后細(xì)胞相關(guān)蛋白水解的抑制相一致(圖2A)。ATF為基礎(chǔ)的拮抗劑也是有效的內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)抑制劑(22，23)，表明腫瘤血管生成的抑制可能也對(duì)在此模型中觀察到的效應(yīng)起作用。事實(shí)上，同AdCO1注射的對(duì)照腫瘤相比，AdmATF注射的LLC腫瘤表現(xiàn)出極小的血管化(圖4)。特異性的AdmATF介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制在注射后晚些時(shí)候變明顯，但在早些時(shí)候卻并非如此，這可能是小腫瘤(典型地小于300mm3，見圖3和圖5)對(duì)新血管化來(lái)提供生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)的要求較小的結(jié)果(綜述見24)。
由于同AdCO1處理組的存活率(低于25天)相比AdmATF處理組的存活率僅有稍微延長(zhǎng)(腫瘤移植后低于30天)，所以LLC細(xì)胞向肺播散的抑制僅僅是短暫的。AdmATF注射對(duì)腫瘤細(xì)胞播散的效應(yīng)可以解釋為由于在AdmATF感染后腫瘤細(xì)胞凍結(jié)，和/或由于很少血管可以提供用于進(jìn)入血管系。播散最終出現(xiàn)表明一些腫瘤細(xì)胞在AdmATF注射時(shí)可能已經(jīng)到達(dá)血管系。另外，E1缺失腺病毒的感染也典型地同在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物免疫耐受的C57BL/6小鼠中被感染細(xì)胞的快速清除相關(guān)(29)，而且ATF是一種在體內(nèi)表現(xiàn)出很短半衰期的小分子。
臨床前資料表明uPA/uPAR復(fù)合物密切參與控制細(xì)胞遷移，包括內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。例如，一種具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的ATF-IgG融合蛋白在一富含bFGF的Matrigel小鼠模型中已經(jīng)表現(xiàn)出抑制新血管和腫瘤的生長(zhǎng)(23)。本研究提供uPA/uPAR拮抗劑基本上通過(guò)控制腫瘤內(nèi)和周圍血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用的證據(jù)由于在同系腫瘤模型中腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞均是潛在的靶，所以AdmATF介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的抗瘤效應(yīng)可能是多因素的，而由于mATF是在包括MDA-MB-231的人細(xì)胞表面uPA/uPAR復(fù)合物形成的弱拮抗劑，所以在MDA-MB-231/無(wú)胸腺小鼠模型中卻并非如此(32)。在MDA-MB-231模型中表現(xiàn)出的顯著特征是AdmATF在阻止腫瘤生長(zhǎng)以及在腫瘤內(nèi)和附近的新血管化中的效率(圖6)。相反，對(duì)照腺病毒感染的腫瘤仍然能夠“吸引”鄰近的血管。在此模型中通過(guò)感染后腫瘤建立效率的降低進(jìn)一步證實(shí)了AdmATF的抗腫瘤特性。
惡性腫瘤由于它們侵入并破壞遠(yuǎn)處位點(diǎn)上致命器官的功能因而是威脅生命的，這強(qiáng)調(diào)了針對(duì)新血管化來(lái)對(duì)抗腫瘤的重要性(33；還見34)。首先，原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新血管化來(lái)提供所需的營(yíng)養(yǎng)。第二，據(jù)報(bào)道缺少新血管化時(shí)轉(zhuǎn)移癌發(fā)生凋亡(35)。此外，在腫瘤內(nèi)生長(zhǎng)中的毛細(xì)血管是“漏的”它們表現(xiàn)出分段的基底膜(36)，這是腫瘤細(xì)胞有效穿透進(jìn)入血管系的前提條件(37)。本研究的總的結(jié)果證明通過(guò)單次腫瘤內(nèi)給予一種表達(dá)細(xì)胞表面uPA/uPAR功能強(qiáng)拮抗劑的重組腺病毒可以實(shí)現(xiàn)顯著的抗腫瘤作用，并且這些效應(yīng)大部分是血管生成抑制的結(jié)果。由于在抑制腫瘤血管生成后預(yù)期的多效性臨床效應(yīng)，所以侵入性實(shí)體瘤應(yīng)用此方法對(duì)于腫瘤基因治療當(dāng)然是吸引人的。
實(shí)施例2體內(nèi)制管張素基因治療抑制腫瘤實(shí)施例2證明人纖溶酶原氨基末端片段(制管張素K3)的表達(dá)在體內(nèi)通過(guò)同有絲分裂阻滯相關(guān)的阻斷內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。已經(jīng)在2個(gè)異種移植小鼠模型中研究了人纖溶酶原N末端片段(制管張素K3)局部投送后的抗腫瘤效應(yīng)。通過(guò)一種由CMV啟動(dòng)子表達(dá)可分泌制管張素K3分子的缺陷型腺病毒(AdK3)實(shí)現(xiàn)制管張素轉(zhuǎn)移。在體外研究中，AdK3選擇性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖并干擾M期啟動(dòng)因子誘導(dǎo)的G2/M轉(zhuǎn)換。AdK3感染的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的同M期磷酸蛋白的下調(diào)相關(guān)的有絲分裂阻滯。向生長(zhǎng)在無(wú)胸腺小鼠中預(yù)先建立的大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤或人MDA-MB-231乳腺癌中單次腫瘤內(nèi)注射AdK3后出現(xiàn)顯著的腫瘤生長(zhǎng)阻滯，其同腫瘤內(nèi)和其鄰近處新血管化的抑制有關(guān)。同對(duì)照腺病毒相比，AdK3治療還誘導(dǎo)凋亡腫瘤細(xì)胞增加10倍。資料支持這樣一個(gè)概念由于抗血管生成蛋白的大丸注射仍存在未解決的藥理學(xué)問(wèn)題，所以利用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行靶向性抗血管生成代表一種投送血管生成因子的有希望的策略。
方法AdK3的構(gòu)建。AdK3為一種E1缺陷的重組腺病毒，其由CMV啟動(dòng)子表達(dá)人纖溶酶原的N末端片段(直到殘基333)。人Plg cDNA獲自質(zhì)粒PG5NM119。首先將編碼Plg的18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和其后的成熟Plg的前326個(gè)殘基的片段亞克隆至質(zhì)粒pXL2675的BamHI和ScaI位點(diǎn)之間。然后在插入CMV啟動(dòng)子和SV40晚期多聚腺苷酸信號(hào)間之前，加入一其后帶有終止密碼子的編碼殘基327至333的合成寡脫氧核苷酸。然后將該表達(dá)盒插入到質(zhì)粒pCO5的EcoRV和BamHI位點(diǎn)之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pCO5-K3。在293細(xì)胞中通過(guò)pCO5-K3和ClaI酶切的AdRSVβGal DNA之間的同源重組構(gòu)建AdK3〔25〕。按照所描述的方法在293來(lái)源的單細(xì)胞層上分離各噬斑，在新鮮293細(xì)胞上擴(kuò)增并制備病毒原種〔25〕。AdCO1為一種除不攜帶任何表達(dá)盒外同AdK3相同的對(duì)照病毒。
細(xì)胞維持和感染。將C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(ATCC CCL-107)和MDA-MB-231細(xì)胞(ATCC HTB 26)培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FCS)的DMEM中。含5％FCS下進(jìn)行病毒感染。在補(bǔ)充有20％FCS、1mM L-谷胺酰胺、1ug/ml氫化可的松、10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子的MCDB 131中培養(yǎng)人微毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)〔49〕，并在含有10％FCS和3ng/ml重組人bFGF(R&D系統(tǒng))的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行感染。選擇感染復(fù)數(shù)(MOI)以獲得80％至100％的感染細(xì)胞，其通過(guò)病毒AdRSVβGal感染后X-GAL染色判斷。
蛋白質(zhì)印跡分析。用AdK3或AdCO1以300噬斑形成單位(PFU)/細(xì)胞的MOI感染亞匯合細(xì)胞。感染后(p.i.)48至96hr，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。為了體內(nèi)K3制管張素分子的免疫學(xué)分析，在感染后10天收集腫瘤，液氮中凍結(jié)，研磨成粉，用裂解緩沖液(10mM NEM、1％TritonX100、1mM PMSF、0.1M NH4OH)抽提并在4℃以12000rpm離心。在轉(zhuǎn)移至一硝酸纖維素膜(Schleicher&Schuell)上前，將含300ug蛋白質(zhì)的樣品在一10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電泳100ng人Plg(Stago)作為對(duì)照。在封閉緩沖液(TBS-5％牛奶-0.05％Tween20)中孵育2hr后，將膜同抗人Plg Mab A1D12孵育1hr〔50〕。同辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠血清(Biosys)孵育1hr。洗滌后，將膜用ECL生物發(fā)光試劑盒(Amersham，UK)檢測(cè)。為檢測(cè)MPM-2磷酸表位，感染后96hr從HMEC-1細(xì)胞制備抽提物并用特定的有絲分裂MPM-2 MAb(DAKO)檢測(cè)。
增殖試驗(yàn)。用AdK3或AdCO1以所示的MOI感染腫瘤或HMEC-1細(xì)胞12br。用1mMEDTA收集細(xì)胞，以PBS洗2次并重懸。將它們接種于96孔培養(yǎng)板(500細(xì)胞/孔)中，并培養(yǎng)72hr。另外，將HMEC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有40、20或10％AdK3或AdCO1轉(zhuǎn)導(dǎo)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清的MCDB131培養(yǎng)基中。在感染后96hr收集病毒感染C6細(xì)胞的上清，于56℃加熱30分鐘以滅活病毒，濃縮10倍并以PBS透析。以一種利用MTS四唑鎓復(fù)合物的細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Promega)定量細(xì)胞。
在一纖維蛋白基質(zhì)模型中毛細(xì)血管的形成。根據(jù)Pepper等〔51〕的方法利用AdK3或AdCO1以600的MOI感染12hr的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(CPAE)(ATCC CCL209)制備此模型。
全血裂解試驗(yàn)。通過(guò)混合80U/ml組織纖溶酶原激活物、250ul AdK3或AdCO1感染后4天所獲的培養(yǎng)上清、以及500ul取自健康供者的經(jīng)枸櫞酸鹽抗凝的全血進(jìn)行全血凝塊裂解。通過(guò)加入1U/ml的凝血酶和12mM Ca2+引發(fā)凝結(jié)。按照所述的方法，通過(guò)裂解時(shí)間以及可溶性D-二聚體的動(dòng)力學(xué)判定凝塊的裂解程度〔52〕。
免疫流式細(xì)胞術(shù)。將HMEC-1用AdK3或AdCO1以300PFU/細(xì)胞的MOI感染96hr。按照所描述的方法〔53〕在同有絲分裂MPM-2抗體孵育前，收集細(xì)胞，用triton X100通透，在室溫同碘化丙錠(20ug/ml)和核糖核酸酶A(100ug/ml)孵育30min來(lái)標(biāo)記DNA。將FITC聯(lián)接的抗小鼠IgG抗體用于檢測(cè)MPM-2磷酸表位。在一Coulter EPICS Profile II流式細(xì)胞儀中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并通過(guò)Multicycle軟件(Phoenix FlowSystems，圣迭哥，美國(guó))分析資料。
無(wú)胸腺小鼠模型。將培養(yǎng)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和MDA-MB0231細(xì)胞收獲、洗滌、分別以1.5×107和0.25×107細(xì)胞/ml重懸于PBS中并將200ul皮下注射于6-7周齡裸鼠的背部。當(dāng)腫瘤達(dá)到20mm3時(shí)，動(dòng)物接受一次腫瘤內(nèi)注射109PFU的AdK3(n＝6)、或AdCO1(n＝6)、或者PBS(n＝6)。對(duì)于C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型監(jiān)測(cè)腫瘤大小直至注射后第10天，而對(duì)于MDA-MB-231模型則至注射后第42天。
為評(píng)價(jià)AdK3感染在腫瘤建立和進(jìn)展上的效應(yīng)，將MDA-MB-231和C6細(xì)胞在皮下接種于裸鼠背部(n＝6)前分別以50和100PFU/細(xì)胞的MOI感染24hr。感染的MDA-MB-231細(xì)胞的致腫瘤性弱于感染的C6細(xì)胞，所以在皮下植入前(106MDA-MB-231或0.25×106C6細(xì)胞)必需將80ul冰冷的Matrigel(Becton Dickinson)加入到120ul PBS中。跟蹤腫瘤建立和生長(zhǎng)直到感染后第25天(MDA-MB-231)或第22天(C6)。學(xué)生t檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
免疫組織化學(xué)。將腫瘤組織固定在乙醇福爾馬林乙酸中，石蠟包埋并制備5um的切片。甲苯處理和再水化后，于一微波爐中將切片在10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)中預(yù)處理3次5分鐘，3％H2O2淬滅5分鐘來(lái)清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS中洗滌，然后同兔抗人馮威利布蘭得因子(vWF；Dako，1∶200稀釋)多克隆抗血清孵育60分鐘。洗滌3次后，在加入3-氨基-9-乙基-咔唑前，將切片同生物素化的山羊抗兔IgG抗體孵育30分鐘，洗滌，并同鏈親和素-過(guò)氧化物酶孵育30分鐘。Meyer蘇木素用于復(fù)染。通過(guò)利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記方法(TUNEL)的試劑盒(BoehringerMannheim)檢測(cè)切片中的凋亡細(xì)胞。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色步驟包括一種生物素化的小鼠抗PCNA抗體(Pharmingen，1∶100稀釋)隨后鏈親和素過(guò)氧化物酶和底物顯色。
結(jié)果AdK3的分子特征。重組AdK3載有一CMV驅(qū)動(dòng)的人Plg的N末端片段，其包括制管張素分子的前3個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域〔47〕，而AdCO1是一種不含任何表達(dá)盒的“同基因”對(duì)照腺病毒(圖7A)。通過(guò)Mab A1D12免疫印跡證實(shí)了HMEC-1、C6和MDA-MB-231細(xì)胞AdK3感染后2-3天在培養(yǎng)基中K3分子的分泌，而在AdCO1感染后卻未檢測(cè)到信號(hào)(圖7B)。分泌的免疫反應(yīng)肽表現(xiàn)為具有36和38kDa分子量的一種二聯(lián)體，最可能反映如對(duì)Plg所描述的在Asn289處不同程度N糖基化〔54，55〕。
AdK3的功能鑒定。同AdCO1感染細(xì)胞構(gòu)成鮮明對(duì)比，AdK3轉(zhuǎn)導(dǎo)HMEC-1導(dǎo)致在感染后第3天以一種劑量依賴方式抑制bFGF刺激的增殖反應(yīng)在50的MOI時(shí)抑制30％，在150的MOI時(shí)74％，以及在300的MOI時(shí)97％(P＜0.005)。AdK3并不影響MDA-MB-231和C6細(xì)胞的增殖(圖8A)。為評(píng)價(jià)K3分子引起此效應(yīng)的旁分泌潛能，將來(lái)自病毒感染C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的無(wú)病毒培養(yǎng)基加至HMEC-1細(xì)胞中。如在圖8A中所示，我們的確觀察到了一劑量依賴性的C6細(xì)胞分泌的制管張素對(duì)HMEC-1細(xì)胞增殖的抑制(P＜0.001)。AdK3的加入還以平均降低55％的水平顯著抑制CPAE細(xì)胞在纖維蛋白凝膠中毛細(xì)血管的形成(未示)。此外，tPA誘導(dǎo)的全血凝塊溶解未被來(lái)自AdK3感染C6細(xì)胞培養(yǎng)上清的加入所抑制，D-二聚體的產(chǎn)生在頭3個(gè)小時(shí)內(nèi)基本上無(wú)變化(1200ng/ml對(duì)1150ng/ml)。
AdK3抑制內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分開。為確定制管張素是否能夠阻斷HMEC-1的有絲分裂，用標(biāo)記了Mab MPM-2-其結(jié)合至特異性在M期存在的磷酸化蛋白-的細(xì)胞同并行的DNA染色一起進(jìn)行流式免疫細(xì)胞術(shù)。結(jié)果表明AdK3感染的HMEC-1細(xì)胞的有絲分裂相對(duì)AdCO1的感染降低82％同AdCO1對(duì)照感染后的27％相比，AdK3感染后僅有5％在G2/M中的HMEC-1細(xì)胞MPM-2計(jì)數(shù)陽(yáng)性(圖8C)。由于MPM-2通常揭示至少16種表觀分子量從40至大于200kDa的有絲分裂磷酸蛋白，所以為了檢測(cè)MPM-2陽(yáng)性蛋白，由HEMC-1抽提物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。同來(lái)自未感染或AdCO1感染的HMEC-1細(xì)胞的對(duì)照抽提物相比，來(lái)自AdK3感染細(xì)胞的抽提物表現(xiàn)出一種顯著降低水平的MPM-2反應(yīng)性磷酸蛋白(圖8B)。
AdK3抑制腫瘤生長(zhǎng)。為誘導(dǎo)制管張素的局部分泌，將單劑109PFU的AdK3注射至生長(zhǎng)在無(wú)胸腺小鼠中的20mm3預(yù)建立的人MDA-MB-231乳腺癌和大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，并監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。如在圖9A中所示，來(lái)自AdK3注射組的C6腫瘤顯著小于那些來(lái)自AdCO1或PBS對(duì)照組中的腫瘤在注射后第10天，AdK3注射腫瘤已達(dá)到了278±14mm3的平均體積，而AdCO1和PBS注射的腫瘤分別為1403±142mm3或1583±259mm3(P＜0.05)。這種80％的抑制同制管張素免疫反應(yīng)物質(zhì)的檢測(cè)相關(guān)(圖7C)。如在圖9B中所示，在MDA-MB-231腫瘤模型中在感染后第42天腫瘤生長(zhǎng)有相似的抑制(85％)AdK3處理的腫瘤為80±4mm3，而AdCO1注射的腫瘤為563±137mm3和PBS注射腫瘤為530±69mm3(P＜0.05)。
體內(nèi)AdK3抑制血管生成并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。AdCO1感染的C6腫瘤出現(xiàn)比它們AdK3感染的對(duì)應(yīng)腫瘤多得多的血管化(圖10，圖案A-B)。因而按照所描述的方法通過(guò)腫瘤切片的vWF免疫染色評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)血管生成〔28〕。首先在低放大下定位vWF陽(yáng)性熱區(qū)，然后在200×放大下計(jì)數(shù)vWF陽(yáng)性血管(圖10，圖案E-F)。結(jié)果顯示同AdCO1注射的對(duì)照相比(14±4個(gè)；n＝5，p＜0.005)，在AdK3注射腫瘤中腫瘤內(nèi)血管化顯著降低(每個(gè)視野5±2個(gè)vWF陽(yáng)性血管)。在PBS注射組中的腫瘤展現(xiàn)出相同數(shù)量的血管(14±3)，表明所用的感染條件并不干擾腫瘤血管生成。在放大鏡水平，同AdCO1處理的對(duì)照相比，AdK3注射的C6腫瘤表現(xiàn)很少的周圍新血管生成(圖10，圖案C-D)。在MDA-MB-231腫瘤切片中獲得了相似的結(jié)果(對(duì)于AdK3為4.8±1.2個(gè)vWF免疫反應(yīng)血管/視野，而AdCO1為15.6±3，p＝0.02)。
然后通過(guò)TUNEL方法用C6腫瘤標(biāo)本原位定量腫瘤細(xì)胞凋亡(見方法)。結(jié)果表明感染后10天在AdK3注射的C6腫瘤中凋亡細(xì)胞顯著增加(每個(gè)視野20±9個(gè)，而對(duì)照腫瘤為1-2個(gè)凋亡細(xì)胞，p＜0.001)(圖10，圖案G-H)。相反，如通過(guò)PCNA免疫染色所評(píng)價(jià)的，腫瘤細(xì)胞增殖率在三個(gè)動(dòng)物組中沒有不同(未示)。Ad-制管張素治療誘導(dǎo)凋亡腫瘤細(xì)胞10倍的增加而不影響這些細(xì)胞的增殖，這同通過(guò)每日注射純化的制管張素獲得的結(jié)果相似。
AdK3抑制腫瘤發(fā)生。為確定是否腫瘤血管生成的抑制削弱腫瘤發(fā)生，在注射入裸鼠的背部前首先將MDA-MB-231和C6細(xì)胞感染24小時(shí)。5天后，AdCO1注射組的所有老鼠發(fā)展為平均大小為27.4±3.41mm3的高度血管化的C6腫瘤，而20％的AdK3感染組動(dòng)物12天后仍然無(wú)腫瘤(圖11)。其余的動(dòng)物表現(xiàn)出幾乎未血管化的很小的腫瘤(平均大小0.42±0.05mm3)。22天后，在AdK3組中觀察到的腫瘤至少比AdCO1組的小5倍(n＝5，p＜0.005；圖11)。用MDA-MB-231腫瘤模型獲得了相似的觀察(未示)。
討論制管張素已被表明是一種由原發(fā)腫瘤分泌的血管生成的病理生理抑制劑，其驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移癌進(jìn)入一種休眠狀態(tài)。因而評(píng)價(jià)制管張素在原發(fā)腫瘤上的治療潛能是吸引人的。然而，因?yàn)橹乒軓埶貜难h(huán)中被快速清除〔46〕，所以人制管張素的系統(tǒng)性和腹膜內(nèi)大丸注射具有困難的藥理學(xué)問(wèn)題。的確需要純化的制管張素以高劑量延長(zhǎng)暴露來(lái)維持制管張素的細(xì)胞抑制性腫瘤內(nèi)濃度〔46〕。還不清楚利用編碼制管張素cDNA的重組病毒直接轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤和周圍組織可能代表一種更有效的實(shí)現(xiàn)恒定的腫瘤內(nèi)制管張素濃度的方法。腺病毒因?yàn)樗鼈冊(cè)谠鲋澈头窃鲋臣?xì)胞中均可以在治療水平有效表達(dá)其轉(zhuǎn)基因(綜述見〔37〕)，所以在這樣一種策略中是合適的載體，這允許靶向廣大的范圍產(chǎn)生制管張素。因此，構(gòu)建了一種表達(dá)人Plg的N末端片段(氨基酸1-333)-包括其預(yù)活化肽和鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3-的缺陷型腺病毒(AdK3)。
特異性針對(duì)人Plg的Mab A1D12〔50〕的應(yīng)用，首先證明了制管張素在AdK3感染細(xì)胞培養(yǎng)基中的有效分泌。在制管張素分子中包括N末端預(yù)活化肽并不影響其抗血管生成活性，因?yàn)锳dK3而非AdCO1感染的內(nèi)皮細(xì)胞體外表現(xiàn)出顯著的、劑量依賴的增殖阻滯(圖8A)。另外，MDA-MB-231或C6腫瘤細(xì)胞的增殖并未被AdK3感染所影響，這表明制管張素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的有限作用。AdK3感染腫瘤細(xì)胞的無(wú)病毒上清也抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，證明由轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞分泌的制管張素的旁分泌效應(yīng)。
由于鉸鏈結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑lg結(jié)合至纖維蛋白和纖維蛋白降解是重要的，所以分析該療法在血栓溶解、體內(nèi)抗血栓形成的生理保護(hù)中的效應(yīng)是關(guān)鍵的。分泌于培養(yǎng)基中的制管張素不能抑制tPA誘導(dǎo)的體外全血凝塊溶解。雖然該實(shí)驗(yàn)還未排除體內(nèi)在血栓溶解期間制管張素同Plg結(jié)合至纖維蛋白時(shí)的有害的競(jìng)爭(zhēng)，但其表明可以以一遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于廢止體內(nèi)纖溶酶原依賴的血栓溶解所需的濃度實(shí)現(xiàn)一種血管抑制效應(yīng)。這可能也表明內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)一種識(shí)別制管張素而非完整Plg的受體。
AdK3感染的內(nèi)皮細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析表明了MPM-2 MAb陽(yáng)性有絲分裂群的完全消失〔56〕。免疫印跡分析揭示了同對(duì)照內(nèi)皮細(xì)胞明顯相反，與MPM-2 MAb有反應(yīng)的M期磷酸蛋白在制管張素處理的內(nèi)皮細(xì)胞中實(shí)際上下調(diào)了。這個(gè)觀察結(jié)果對(duì)于確定制管張素廢止內(nèi)皮細(xì)胞增殖機(jī)制可能是有幫助的。我們還表明制管張素打亂由cdc2和其相關(guān)調(diào)節(jié)亞單位細(xì)胞周期蛋白B組成的M期啟動(dòng)因子(MPF)〔57〕誘導(dǎo)的G2/M轉(zhuǎn)換。同MPM-2 MAb有反應(yīng)的MPF磷酸化蛋白參與用于有效進(jìn)展為有絲分裂所需細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及活性的主要改變。必需進(jìn)一步研究在AdK3轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏有活性MPF的原因。
在兩個(gè)預(yù)建立的異種移植小鼠模型中表明AdK3而非AdC01的單次腫瘤內(nèi)注射顯著抑制原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。這種對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)同腫瘤內(nèi)和其鄰近的血管化明顯降低(圖10)以及在腫瘤抽提物中制管張素免疫反應(yīng)物質(zhì)的檢出(圖7C)密切相關(guān)。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤因其VEGF的過(guò)表達(dá)而是一種高度血管化的腫瘤〔58〕。有趣的是，AdK3轉(zhuǎn)導(dǎo)的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤明顯難以在腫瘤塊內(nèi)建立血管網(wǎng)絡(luò)來(lái)支持快速和廣泛的生長(zhǎng)(圖10)，而且這種障礙轉(zhuǎn)化為高于80％的腫瘤生長(zhǎng)抑制。腫瘤切片的vWF免疫染色也揭示了在AdK3處理的腫瘤中血管生成的顯著減少在對(duì)照C6腫瘤中經(jīng)常觀察到具有成熟內(nèi)腔的形成較好的血管，而在AdK3處理的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤中則沒有(圖10)。這種在血管密度上的降低伴有腫瘤細(xì)胞凋亡10倍的增加，而腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)無(wú)明顯改變，可能是因?yàn)?i)缺乏內(nèi)皮細(xì)胞衍生的旁分泌因子，(ii)營(yíng)養(yǎng)支持的減少，以及(iii)缺氧引發(fā)的腫瘤細(xì)胞p53依賴的凋亡〔59，60〕。在MDA-MB-231乳腺癌模型中，單次腫瘤內(nèi)AdK3注射類似地誘導(dǎo)腫瘤血管生成和生長(zhǎng)的顯著抑制。
在本研究的過(guò)程中，如由AdK3感染細(xì)胞在植入后延遲發(fā)展為可見的腫瘤所反映的，AdK3轉(zhuǎn)導(dǎo)的C6和MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)出較低的致腫瘤潛能。
已經(jīng)表明利用重組腺病毒的制管張素治療實(shí)驗(yàn)上為合理而有效的。投送一種以上血管抑制因子的可能性也可能協(xié)同阻滯腫瘤生長(zhǎng)。還預(yù)期其同細(xì)胞毒方法聯(lián)用可能對(duì)于改善惡性疾病的臨床后果特別有效。
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進(jìn)一步應(yīng)該理解所提供核酸或多肽的所有堿基大小和氨基酸大小，以及所有的分子量或分子質(zhì)量均是大約的，并且僅供用于描述。
此中引用的各種出版物，它們的公開內(nèi)容以其整體并入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其包括向腫瘤中引入一種缺陷型腺病毒載體，其含有編碼一種抗血管生成因子的基因，該基因有效地同支持該抗血管生成因子在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤為一種肺癌或乳腺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗血管生成因子包括一個(gè)具有一EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶的氨基末端片段的序列，條件是該因子不是尿激酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中抗血管生成因子為一個(gè)尿激酶氨基末端片段，其具有尿激酶從大約氨基酸殘基1至殘基135的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中尿激酶為鼠的尿激酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中尿激酶為人的尿激酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗血管生成因子為制管張素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中制管張素包括鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中制管張素為纖溶酶原(Plg)的氨基末端片段，其具有纖溶酶原從大約氨基酸殘基1至大約殘基333的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中纖溶酶原為人纖溶酶原。
11.一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、或者兩者均抑制的方法，其包括向腫瘤中引入一種載體，其包括一種編碼具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶的氨基末端片段的基因，條件是基因不編碼尿激酶，其中該基因有效地同支持該基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)控制序列相連。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中尿激酶的氨基末端片段具有尿激酶從大約氨基酸殘基1至殘基135的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中尿激酶為鼠尿激酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中尿激酶為人尿激酶。
15.一種缺陷型腺病毒載體，其包括編碼一種抗血管生成因子的基因，該基因有效地同表達(dá)控制序列相連。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的病毒載體，其中抗血管生成因子包含具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶氨基末端片段的核酸序列，條件是該因子不是尿激酶。
17.一種缺陷型腺病毒載體，其包含編碼具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶的氨基末端片段的基因，條件是該基因不編碼尿激酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的病毒載體，其中尿激酶的氨基末端片段具有尿激酶從氨基酸殘基1至大約殘基135的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的病毒載體，其中尿激酶為鼠尿激酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的病毒載體，其中尿激酶為人尿激酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的病毒載體，其中抗血管生成因子為制管張素。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的病毒載體，其中制管張素包括鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的病毒載體，其中制管張素包含具有纖溶酶原從氨基酸殘基1至大約殘基333的氨基酸序列的纖溶酶原氨基末端片段的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的病毒載體，其中纖溶酶原為人纖溶酶原。
25.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求15-24中任何一項(xiàng)中的病毒載體和一種藥學(xué)可用載體。
26.權(quán)利要求15-24中任何一項(xiàng)的病毒載體在制造一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的應(yīng)用。
27.權(quán)利要求16-20中任何一項(xiàng)的病毒載體在制造一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，或者抑制兩者的藥物中的應(yīng)用。
28.權(quán)利要求21-24中任何一項(xiàng)的病毒載體在制造一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的藥物中的應(yīng)用。
29.一種載體在制造一種用于抑制腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，或者抑制兩者的藥物中的應(yīng)用，該載體包括編碼一種具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的尿激酶的氨基末端片段的基因，條件是該基因不編碼尿激酶，該基因有效地同支持該抗血管生成因子表達(dá)的表達(dá)控制序列相連。
30.根據(jù)權(quán)利要求26-29中任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中腫瘤為肺癌或乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于腫瘤治療的基因療法。本發(fā)明更特別涉及向腫瘤的細(xì)胞內(nèi)引入編碼一種抗血管生成因子的基因,例如利用一種腺病毒載體,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移,或者兩者均有。在一特定的實(shí)施方案中,一種表達(dá)尿激酶氨基末端片段(ATF)的缺陷型腺病毒的轉(zhuǎn)移抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。這些效應(yīng)同在注射部位內(nèi)和其緊密鄰近處血管生成化的顯著抑制相關(guān)。一種表達(dá)制管張素的鉸鏈結(jié)構(gòu)區(qū)1至3的缺陷型腺病毒載體的轉(zhuǎn)移抑制腫瘤生長(zhǎng)和致腫瘤性,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于本發(fā)明方法中的病毒載體。
文檔編號(hào)A61P35/04GK1254378SQ98804621
公開日2000年5月24日 申請(qǐng)日期1998年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月28日
發(fā)明者李紅, 陸核, F·格里塞利, P·歐波隆, C·索利亞, T·拉格特, Y·萊格蘭德, J·索利亞, C·瑪比拉特, M·帕里考德特, P·耶 申請(qǐng)人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司