本發(fā)明涉及Ca²⁺在提高CELI家族酶活性中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

CELI酶是一種單鏈、雙鏈都特異識別的特異性核酸酶，等電點(diǎn)為6.0-6.5，分子量大小為43kDa(Yang et al,1999)；CEL I酶和CEL II酶都具有識別堿基錯配的能力，其同源性為49％(見圖5)(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為該酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以識別八種錯配形式的堿基(mismatches)分別為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被廣泛應(yīng)用于突變檢測領(lǐng)域，如植物TILLING技術(shù)平臺中(Till et al,2006)。該酶可以特異性切割錯配堿基(Bing Yang et al,1999)。通過酶切擴(kuò)增的目標(biāo)檢測片段并經(jīng)瓊脂糖或毛細(xì)管電泳分離檢測，一般可方便獲得突變位置和大小。因此，它是一種比較方便和經(jīng)濟(jì)的檢測未知和已知突變位點(diǎn)的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途徑是從芹菜中提取，主要提取方法是通過硫酸銨沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到純度更高的酶，需要經(jīng)過刀豆體蛋白A-瓊脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脫，但是得率較低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突變體檢測實驗是用粗提酶來檢測的，該粗提酶的主要成分即為CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供Ca²⁺的新用途。

本發(fā)明提供了Ca²⁺在促進(jìn)CELI酶活性中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述CELI酶活性為切割錯配位點(diǎn)。

本發(fā)明還提供了Ca²⁺在制備CELI酶酶切緩沖液或CELI酶酶切緩沖體系中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個目的是提供含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液。

本發(fā)明提供的含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液中，所述Ca²⁺在所述CELI酶酶切緩沖液中的濃度為0.5-50mM。

上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液中，所述Ca²⁺在所述CELI酶酶切緩沖液中的濃度具體為0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM或50mM；

上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液中，所述含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液由Ca²⁺、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES緩沖液組成；所述HEPES緩沖液為濃度為 0.1M、pH值為7.5的HEPES緩沖液。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種酶切反應(yīng)體系。

本發(fā)明提供的酶切反應(yīng)體系包括上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切緩沖液和CELI酶。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種CELI酶試劑盒。

本發(fā)明提供的CELI酶試劑盒為如下(1)或(2)：

(1)上述酶切緩沖液；

(2)上述酶切緩沖液和CELI酶。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒在促進(jìn)CELI酶切割含有錯配位點(diǎn)DNA中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒在檢測待測DNA分子是否含有錯配位點(diǎn)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的應(yīng)用。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種用CELI酶酶切含有錯配位點(diǎn)DNA的方法。

本發(fā)明提供的用CELI酶酶切含有錯配位點(diǎn)DNA的方法包括如下步驟：將含有錯配位點(diǎn)DNA和野生型DNA在上述酶切反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切反應(yīng)，實現(xiàn)酶切；

所述含有錯配位點(diǎn)DNA和野生型DNA的質(zhì)量比為1：(1-24)。

上述方法中，所述含有錯配位點(diǎn)DNA和野生型DNA的質(zhì)量比為1:(12-24)。

上述應(yīng)用或方法中，所述錯配位點(diǎn)的錯配形式為AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述酶切緩沖液或上述酶切反應(yīng)體系或上述試劑盒或上述方法在低豐度未知突變體檢測中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的催化活性物質(zhì)Ca²⁺，通過實驗證明：Ca²⁺可以進(jìn)一步提高CELI酶活，特別是對低豐度突變的檢測。比傳統(tǒng)的酶切方法相比，本發(fā)明的方法更為靈敏，Ca²⁺的終濃度在0.5-50mM范圍內(nèi)都可以提高CELI酶的檢測靈敏度，對低豐度未知突變體的檢測，如某癌癥基因都有很好的檢測效果，特別是TILLING技術(shù)平臺檢測誘變?nèi)后w時，有明顯優(yōu)勢，不僅僅簡化了PCR純化步驟，同時相應(yīng)地提高了檢測分辨率。

附圖說明

圖1為Ca²⁺對CELI酶切效果。

圖2為Ca²⁺對CELI酶切效果。

圖3為Ca²⁺對CELI酶切效果。

圖4為Ca²⁺和Mg²⁺對CELI酶切效果。

圖5為CELI與CELII同源關(guān)系比較圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

Mutation Detection Kit-S100試劑盒是美國環(huán)球基因公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為706025。

Binding Buffer是美國zymoresearch公司的產(chǎn)品；DNA Clean&Concentrator^TM-25。

實施例1、Ca²⁺在提高CELI酶活性中的應(yīng)用

一、待酶切DNA樣品的制備

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA a₀(濃度為1ng/ul)；序列2為將序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA a₁(濃度為1ng/ul)；序列4為將序列3的第503位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列5所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA a₂(濃度為1ng/ul)；序列5為將序列3的第389位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA a₃(濃度為1ng/ul)；序列6為將序列3的第563位核苷酸由C突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列7所示的DNA分子，將其按2:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的DNA a₄(濃度為1ng/ul)；序列7為將序列3的第495位核苷酸由T突變?yōu)镃后得到的DNA分子。

2、PCR擴(kuò)增

分別以上述待PCR擴(kuò)增的DNA a₀、待PCR擴(kuò)增的DNA a₁、待PCR擴(kuò)增的DNA a₂、待PCR擴(kuò)增的DNA a₃、待PCR擴(kuò)增的DNA a₄為模板，采用F和R引物對所述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增至45個熱循環(huán)，然后進(jìn)行99℃變性10min，降溫至70℃，每個循環(huán)降低0.3℃，69個循環(huán)結(jié)束，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₀即待酶切DNA樣品a₀、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₁即待酶切DNA樣品a₁、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₂即待酶切DNA樣品a₂、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₃即待酶切DNA樣品a₃、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₄即待酶切DNA樣品a₄。待擴(kuò)增完畢后，用1％瓊脂糖凝膠檢測，檢測條帶是否特異，條帶亮度是否達(dá)到要求。若條帶較暗或不特異，需要重新擴(kuò)增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR擴(kuò)增的DNA a₀為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₀，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₀進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₀含有如序列表中序列1所示的DNA分子和將序列表中序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子。

以待PCR擴(kuò)增的DNA a₁為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為1134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₁，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₁進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₁含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為1134bp的將序列表中序列2的第503位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品a₁)。

以待PCR擴(kuò)增的DNA a₂為模板，PCR擴(kuò)增得到的大小為1134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₂，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₂進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₂含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為1134bp的將序列表中序列2的第389位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品a₂)。

以待PCR擴(kuò)增的DNA a₃為模板，PCR擴(kuò)增得到的大小為1134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₃，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₃進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₃含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為1134bp的將序列表中序列2的第563位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品a₃)。

以待PCR擴(kuò)增的DNA a₄為模板，PCR擴(kuò)增得到的大小為1134bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₄，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₄進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a₄含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為1134bp的將序列表中序列2的第495位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品a₄)。

PCR擴(kuò)增體系(10ul)：10倍PCR緩沖液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂0 6.78ul；

PCR擴(kuò)增熱循環(huán)：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃hold。

異源錯配雙鏈形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR產(chǎn)物純化

(1)用在1倍體積的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2倍體積的Binding Buffer，翻轉(zhuǎn)充分混勻(對小于200bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5倍體積的Binding Buffer)得到混合液。

(2)將所述混合液加入DNA純化柱內(nèi)(如果溶液體積>700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液)；室溫放置1-2min或更長時間。

(3)13,000g離心1min，棄廢液(目的DNA長度≤500bp時，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入DNA純化柱中，離心)。

(4)在DNA純化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

(5)重復(fù)步驟(4)。

(6)13,000g離心3min，以去除柱中殘余乙醇。

(7)將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃預(yù)熱的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室溫放置1-2min或更長時間。

二、CELI酶的制備

1、取10kg芹菜，放入榨汁機(jī)中，緩慢榨汁后，避免溫度過熱，在汁液中加入預(yù)冷勻漿緩沖液(含100mM Tris-HCl(pH均為7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、將所述混合液4℃下14000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液；向上清液中緩慢加入硫酸銨(每100ml上清液加25g硫酸銨)，分10次加入(每100ml體積加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速攪拌30min；14000rpm離心45min，棄沉淀，取上清液。

3、向上清液中緩慢加入硫酸銨至(每100ml上清液加80g硫酸銨)，分十次加入(每100ml體積加入39.0g固體硫酸銨)。低速攪拌30min后，14000rpm離心3min。棄上清，收集沉淀。

4、用1/10體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)溶解步驟3中得到的沉淀，1000rpm離心20min，棄沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成適當(dāng)長度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中將透析袋煮沸5min。用超純水清洗透析袋。將透析袋放入10倍蛋白質(zhì)溶液以上體積的緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)中，透析過夜，透析4-5次至透析液無顏色為止。

6、取40ml透析過的酶液經(jīng)ConA-Sapharose-4B柱，用緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)沖洗，經(jīng)alpha-甘露糖苷洗脫后，經(jīng)緩沖液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH為7.7)透析過夜，得到純化后的CELI酶(約50mg)，分裝-80度保存。

三、酶切反應(yīng)及其效果

1、酶切緩沖液的配置

酶切緩沖液配置分成如下5組：

組1：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺緩沖液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同濃度的CaCl₂(0mM、0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM、60mM)；

組2：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺緩沖液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

組3：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺緩沖液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl₂；

2、酶切反應(yīng)

分別取2ul的待酶切DNA樣品a₀、待酶切DNA樣品a₁、待酶切DNA樣品a₂、待酶切DNA樣品a₃、待酶切DNA樣品a₄作為酶切反應(yīng)底物，用上述各組酶切緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物a₀、酶切產(chǎn)物a₁、酶切產(chǎn)物a₂、酶切產(chǎn)物a₃、酶切產(chǎn)物a₄。

CELI酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0ul、純水3.2ul。

若酶切產(chǎn)物a₀含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有791bp的酶切片段，說明CELI酶無法檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；

若酶切產(chǎn)物a₁含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有1134bp的酶切片段，說明CELI酶無法檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；

若酶切產(chǎn)物a₂含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有1134bp的酶切片段，說明CELI酶無法檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；

若酶切產(chǎn)物a₃含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有1134bp的酶切片段，說明CELI酶無法檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；

若酶切產(chǎn)物a₄含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有1134bp的酶切片段，說明CELI酶無法檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品。

3、毛細(xì)管電泳

酶切反應(yīng)結(jié)束后立即加入2ul的0.225M的EDTA終止反應(yīng)(15ul體系應(yīng)加入3ul EDTA)，再補(bǔ)入91ul超純水稀釋樣品，可直接上機(jī)(FS 96，美國AATI公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳條件如表1所示。

表1、毛細(xì)管電泳條件

4、Ca²⁺對CELI酶酶切效果的影響

酶切產(chǎn)物a₀經(jīng)用毛細(xì)管分離的結(jié)果如圖1所示(其中泳道1和泳道2的酶切緩沖液為組2；其余泳道的酶切緩沖液為組1)。從圖1可以看出：酶切產(chǎn)物分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，與目的酶切片段中錯配位點(diǎn)一致，且濃度范圍在0.5-30mM的Ca²⁺的酶切效果好于Mg²⁺的酶切效果，說明濃度范圍在0.5-30mM的Ca²⁺的酶切效果均可提高CELI酶切活性。

PCR產(chǎn)物未純化和純化的酶切產(chǎn)物a₁、酶切產(chǎn)物a₂、酶切產(chǎn)物a₃、酶切產(chǎn)物a₄經(jīng)用毛細(xì)管分離的結(jié)果分別如圖2和圖3所示：其中圖2和圖3的1-8泳道的酶切緩沖液為組2；圖2和圖3的9-12泳道的酶切緩沖液為組3。從圖2和圖3可以看出：酶切產(chǎn)物a₁含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，酶切產(chǎn)物a₂含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，酶切產(chǎn)物a₃含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，酶切產(chǎn)物a₄含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，與目的酶切片段中錯配位點(diǎn)一致，說明在PCR產(chǎn)物未純化時Ca²⁺酶切效果要明顯高于PCR產(chǎn)物純化時Mg²⁺酶切效果，說明產(chǎn)物無需純化，添加Ca²⁺即可得到很好的酶切效果，節(jié)約了純化成本和時間。

實施例2、Ca²⁺在提高CELI酶活性中的應(yīng)用

一、待酶切DNA樣品的制備

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子(野生型DNA分子)和序列表中序列2所示的DNA分子(突變型DNA分子)，序列2為將序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳后得到的DNA分子。

將序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:1比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的模板1(待PCR擴(kuò)增的模板1的濃度，150ng/ul)。

將序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:12比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的模板2(待PCR擴(kuò)增的模板2的濃度，150ng/ul)。

將序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:24比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的模板3(待PCR擴(kuò)增的模板3的濃度，150ng/ul)。

將序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:48比例(質(zhì)量比)混合，得到待PCR擴(kuò)增的模板4(待PCR擴(kuò)增的模板4的濃度，150ng/ul)。

2、PCR擴(kuò)增

分別以上述待PCR擴(kuò)增的模板1、待PCR擴(kuò)增的模板2、待PCR擴(kuò)增的模板3、 待PCR擴(kuò)增的模板4為模板，采用F和R引物對上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增至45個熱循環(huán)，然后進(jìn)行99℃變性10min，降溫至70℃，每個循環(huán)降低0.3℃，69個循環(huán)結(jié)束，分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1即待酶切DNA樣品1、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2即待酶切DNA樣品2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3即待酶切DNA樣品3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4即待酶切DNA樣品4。待擴(kuò)增完畢后，用1％瓊脂糖凝膠檢測，檢測條帶是否特異，條帶亮度是否達(dá)到要求。若條帶較暗或不特異，需要重新擴(kuò)增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR擴(kuò)增的模板1為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和將序列表中序列1的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品1)。

以待PCR擴(kuò)增的模板2為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為791bp的將序列表中序列1第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品2)。

以待PCR擴(kuò)增的模板3為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和將序列表中序列3的第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品3)。

以待PCR擴(kuò)增的模板4為模板，PCR擴(kuò)增得到大小為791bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型樣品的DNA)和大小為791bp的將序列表中序列1第544位核苷酸由G突變?yōu)锳的異源雙鏈DNA分子(點(diǎn)突DNA樣品4)。

PCR擴(kuò)增體系(10ul)：10倍PCR緩沖液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂0 6.78ul；

PCR擴(kuò)增熱循環(huán)：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃ hold。

異源錯配雙鏈形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化的步驟同實施例1中的步驟3。

二、酶切反應(yīng)及其效果

1、酶切緩沖液的配置

酶切緩沖液配置分成如下2組：

組1：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺緩沖液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

組2：10倍digestion buffer(含有Ca²⁺緩沖液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl₂。

2、酶切反應(yīng)

分別取2ul的待酶切DNA樣品1、待酶切DNA樣品2、待酶切DNA樣品3、待酶切DNA樣品4作為酶切反應(yīng)底物，分別用上述各組酶切緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，分別得到酶切產(chǎn)物1、酶切產(chǎn)物2、酶切產(chǎn)物3、酶切產(chǎn)物4。

CELI酶切反應(yīng)體系(6ul)：10倍酶切緩沖液0.6ul、實施例1中的步驟二制備的CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、待酶切DNA樣品2.0ul、純水3.2ul。

若酶切產(chǎn)物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，說明CELI酶可以有效的檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品；若酶切產(chǎn)物僅含有791bp的酶切片段，說明CELI酶未檢測出待酶切DNA樣品中的點(diǎn)突DNA樣品。

3、毛細(xì)管電泳

酶切反應(yīng)結(jié)束后立即向酶切反應(yīng)體系中加入2ul的0.225M的EDTA終止反應(yīng)(15ul體系應(yīng)加入3ul EDTA)，再補(bǔ)入91ul超純水稀釋樣品，可直接上機(jī)(FS 96，美國AATI公司)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳條件如表1所示。

表1、毛細(xì)管電泳條件

4、不同濃度的突變DNA分子的CELI酶酶切效果

用組1的酶切緩沖液進(jìn)行酶切得到的酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖4的泳道1-4所示，用組2的酶切緩沖液進(jìn)行酶切得到的酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖4的泳道5-8所示：從圖中可以看出，用含有Mg²⁺緩沖液的對含有不同濃度的突變DNA分子的待酶切DNA樣品進(jìn)行酶切，只有泳道1(突變DNA分子濃度為1ng/ul)中的酶切產(chǎn)物分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，說明用含有Mg²⁺緩沖液的進(jìn)行酶切，僅可以檢測出濃度為1ng/ul的突變DNA分子；用含有Ca²⁺緩沖液的對含有不同濃度的突變DNA分子的待酶切DNA樣品進(jìn)行酶切，泳道1(突變DNA分子濃度為1ng/ul)、泳 道1(突變DNA分子濃度為0.08ng/ul)和泳道1(突變DNA分子濃度為0.04ng/ul)中的酶切產(chǎn)物均分離得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，說明用含有Ca²⁺緩沖液的進(jìn)行酶切，可以檢測出濃度為0.04ng/ul的突變DNA分子。上述實驗結(jié)果表明：和Mg²⁺相比，含有Ca²⁺的酶切緩沖液可以檢測較低濃度的突變DNA分子，說明Ca²⁺可以促進(jìn)CELI酶的活性。