本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及cdhr3作為腫瘤診斷標志物的應(yīng)用，更具體的涉及cdhr3作為骨肉瘤診斷標志物、cdhr3激動劑在骨肉瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：cdhr3基因定位于染色體的7q22.3區(qū)域，是一種包含六個外鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，其可介導(dǎo)同源性細胞的黏附，參與細胞分化、細胞間相互作用等過程。研究表明其在極早期哮喘形成中起重要作用的基因，但還沒有報道表明其與骨肉瘤相關(guān)。骨肉瘤是一種起源于骨間葉細胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，發(fā)病年齡多為8-25歲，社會危害性極大，其血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早且發(fā)生率高，進展迅速，80％的患者在確診時己有微小轉(zhuǎn)移灶。隨著化學(xué)治療、手術(shù)技術(shù)、骨重建等治療方法的發(fā)展，5年總體生存率得到較大提高。但是，近年來骨肉瘤的治療遇到瓶頸，尤其是在骨肉瘤早期轉(zhuǎn)移上，即骨肉瘤的早期診斷成為臨床亟待解決的問題。腫瘤標志物的研究使得骨肉瘤的早期診斷成為可能。腫瘤標志物的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細胞分化、細胞功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。不過由于骨肉瘤發(fā)病率低，約為0.3/萬，導(dǎo)致樣本收集困難，沒有被深入研究，目前骨肉瘤的分子標志物并不多。本發(fā)明對骨肉瘤病例樣本進行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析和分子生物學(xué)實驗，挑選出與骨肉瘤密切相關(guān)的基因cdhr3，cdhr3有望成為骨肉瘤診斷標志物，為其臨床診斷提供參考，為骨肉瘤患者帶來希望。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種骨肉瘤診斷制劑，該制劑檢測cdhr3基因和/或cdhr3蛋白的表達。本發(fā)明的目的在于提供檢測cdhr3基因或蛋白的制劑在制備骨肉瘤診斷試劑中的應(yīng)用。進一步，骨肉瘤患病組中cdhr3基因或蛋白的表達水平與正常對照組織或者癌旁組織相比，表達水平低。進一步，檢測cdhr3基因或蛋白在生物學(xué)樣品中的表達水平是通過檢測cdhr3部分或全部mrna和/或檢測編碼cdhr3蛋白的部分或全部氨基酸序列進行。優(yōu)選的，生物學(xué)樣品為來源于患者的生物樣品，包括細胞、組織等，可以是血液或者尿液等，優(yōu)選為外周血。進一步，骨肉瘤診斷制劑采用熒光定量pcr試劑盒、基因芯片方法、測序方法檢測骨肉瘤生物學(xué)樣品中cdhr3基因的表達。優(yōu)選的，所述的熒光定量pcr試劑盒中含有一對特異性擴增cdhr3基因的引物；所述的基因芯片中包括與cdhr3基因的核酸序列雜交的探針。更優(yōu)選的，熒光定量pcr試劑盒內(nèi)含有特異性檢測cdhr3基因的上游引物和下游引物，上游引物序列為seqidno.1，下游引物序列為seqidno.2。熒光定量pcr法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對pcr產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度?；蛐酒址Q為dna微陣列(dnamicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cdna片段，通常用同位素標記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的dna探針陣列，通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列，與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。進一步，骨肉瘤診斷制劑采用免疫方法檢測生物學(xué)樣品中cdhr3蛋白的表達。優(yōu)選的，免疫方法為elisa檢測和/或膠體金檢測。進一步，檢測cdhr3蛋白的elisa法為使用elisa檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市售的cdhr3單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，elisa檢測試劑盒包括：包被cdhr3抗體的固相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。進一步，膠體金檢測采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(t)噴點有抗cdhr3抗體、質(zhì)控區(qū)(c)噴點有免疫球蛋白igg。酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。elisa檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測igm抗體、應(yīng)用親和素和生物素的elisa。elisa檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶(hrp)或者堿性磷酸酶(ap)。免疫膠體金檢測技術(shù)：(1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強標記，使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。(2)免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。(3)斑點免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。(4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨肉瘤的制劑，所述制劑中含有促進cdhr3基因的轉(zhuǎn)錄或表達的試劑或化合物。進一步的，所述的cdhr3基因和/或基因的表達產(chǎn)物在骨肉瘤組織中低表達。本領(lǐng)域人員熟知促進基因及其表達產(chǎn)物的表達通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種：激活基因的啟動子、激活基因表達的蛋白或因子、導(dǎo)入促進基因轉(zhuǎn)錄或表達的載體。優(yōu)選的，治療骨肉瘤的制劑中含有促進cdhr3基因的轉(zhuǎn)錄或表達的載體和/或激活cdhr3基因的啟動子和/或激活cdhr3基因表達的蛋白或因子。本發(fā)明的目的在于提供上述治療骨肉瘤的制劑在制備骨肉瘤治療藥物或試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的藥劑學(xué)上可接受的載體為在制劑時通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearicacidmagnesium)及礦物油(mineraloil)等，但并非局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)可接受的載體除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細記載于雷明登氏藥學(xué)全書。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過口服或非口服進行給藥，作為非口服給藥時，能通過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮給藥等方式進行給藥。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可以進行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預(yù)防有效的給藥劑量。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以容易實施的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而能夠以單位用量形態(tài)制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來制備。此時，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包括分散劑或者穩(wěn)定劑。本發(fā)明的目的在于提供一種檢測骨肉瘤的基因檢測試劑盒，所述試劑盒檢測基因cdhr3，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為seqidno.1，下游引物序列為seqidno.2。進一步，該pcr試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。進一步，上述熒光定量pcr試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量pcr反應(yīng)液。所述內(nèi)參為gapdh。所述的試劑盒還包含rna抽提試劑。本發(fā)明目的是提供了一種骨肉瘤蛋白檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒檢測cdhr3蛋白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。本發(fā)明目的是提供了一種檢測骨肉瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括與cdhr3基因的核酸序列雜交的探針。附圖說明圖1是rt-pcr擴增曲線圖圖2是rt-pcr溶解曲線圖圖3是在組織樣本中cdhr3相對表達量圖圖4是在血液樣本中cdhr3相對表達量圖具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。實施例1高通量測序及分析分別收集10例骨肉瘤病例樣本及5例正常對照組織，其中10例骨肉瘤病例樣本中5例原發(fā)樣本、5例轉(zhuǎn)移樣本。進行rna提取，rna提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的rna樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進而通過nanodrop1000分光光度計檢測rna樣品的提取情況，rna-seq測序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。測序平臺為illumina公司的hiseq2500高通量測序平臺，進行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運用fast-qc軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，gc含量，pcrduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據(jù)得到的fpkm值，采用國際公認算法ebseq進行差異篩選。其中，篩選時，log2fc>1或<-1,fdr<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了geneonlogy和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻我們篩選了在骨肉瘤組下調(diào)表達明顯基因cdhr3。實施例2骨肉瘤組及正常組cdhr3基因表達情況一材料和方法1、材料收集17例骨肉瘤組織樣本、28例骨肉瘤血液樣本，6例正常骨組織對照、20例正常血液樣本對照，對其進行分組及編號。組織提取：患者初次手術(shù)時，在無菌操作下術(shù)中提取組織樣本，每塊切成黃豆大小，取出后迅速放入凍存管中，并盡快置于液氮中。血液提?。夯颊叽_認后及時采集病例的外周血標本3-5毫升，迅速放入edta抗凝管中，盡快置于-80℃冰箱。2、方法2.1骨肉瘤及正常對照總rna的提取采用reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本rna提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。提取后，用nanodrop2000紫外分光光度計測量rna純度及濃度,凍存于-70℃。rna質(zhì)量判定標準：rna樣本的od260/od280值為1.7-2.2之間；總rna電泳圖譜有清晰的28s、18s條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cdna采用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)(貨號：rr047b)進行cdna反轉(zhuǎn)錄，首先去除基因組dna反應(yīng)，在試管中加入5×gdnaeraserbuffer2.0ul，gdnaeraser1.0ul，totalrna1ug，加rnasefreeh20使總體積至10ul，水浴鍋中加熱2min，再將primescriptrtenzymemixi1.0ul，rtprimermix1.0ul，5×primescriptbuffer2(forrealtime)4.0ul，rnasefreedh204.0ul，混合后加入上述試管中一起混合共20ul，水浴鍋中37℃加熱15min，85℃加熱5sec，合成的cdna需要長期保存時，請于-20℃或更低溫度保存。2.3real-timepcr2.3.1儀器及分析方法用abi7300型熒光定量pcr儀，采用法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。2.3.2引物設(shè)計采用在線引物設(shè)計軟件，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1操作過程如下：(一)反應(yīng)體系：表2試劑使用量2×superrealpremixplus10μl上游引物(10um)0.6μl下游引物(10um)0.6μl50×roxreferencedye△2μldna模板2ul滅菌蒸餾水4.8ul擴增程序為：95°15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40個循環(huán)，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。(二)引物篩選將各樣本cdna混合后，以此為模板進行3倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增(見表3)，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。表3(三)樣品realtimepcr檢測將各樣品cdna3倍稀釋后取2μl作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。二實驗結(jié)果實時定量pcr擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高(見圖1)；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增(見圖2)；根據(jù)qrt-pcr的相對定量公式：2-δδct，比較cdhr3基因在骨肉瘤組織和正常組織、骨肉瘤血液樣本和正常對照血液樣本中的表達水平。結(jié)果顯示：qrt-pcr擴增結(jié)果穩(wěn)定，在組織樣本中，cdhr3在骨肉瘤組的表達水平是正常對照組的0.15倍(具體見圖3)，在血液樣本中，cdhr3在骨肉瘤組的表達水平是正常對照組的0.53倍(具體見圖4)，以上結(jié)果驗證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)的整合分析cdhr3在骨肉瘤組中低表達的結(jié)果。本發(fā)明采用高通量測序篩選出骨肉瘤相關(guān)基因cdhr3，結(jié)合分子生物學(xué)實驗證實了cdhr3是骨肉瘤診治標志物。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>cdhr3作為腫瘤診斷標志物的應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1gcagaaggtctacacctctaca22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2ggaatgtttcggcttgtgtctt22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3ggagcgagatccctccaaaat21<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4ggctgttgtcatacttctcatgg23當(dāng)前第1頁12