本發(fā)明屬于生物食品領(lǐng)域，涉及一種鑒定隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)的脂肪酸去飽和酶基因的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：dha即二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,dha)是人腦發(fā)育、成長(zhǎng)的重要物質(zhì)之一，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在人體大腦皮層中含量高達(dá)20％，在眼睛視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占50％。因此，它對(duì)胎兒和嬰幼兒的大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育，以及成年人腦功能的維修等方面有著重要的作用。此外，dha對(duì)冠心病、中風(fēng)、高血壓等心血管系統(tǒng)的疾病、神經(jīng)失常、老年癡呆癥和抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)的疾病也有積極的影響。dha作為一種必需脂肪酸，其增強(qiáng)記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)dha含量高的人的心理承受力較強(qiáng)，智力發(fā)育指數(shù)也高。dha還可用于癌癥治療，抑制發(fā)炎等。據(jù)荷蘭帝斯曼公司的估計(jì)，dha的全球市場(chǎng)價(jià)值約為25-26.2億美元，并且以每年15％以上的速度增長(zhǎng)。截止目前為止，深海魚油一直是市售的dha的主要來(lái)源。但這一主要來(lái)源存在諸多缺點(diǎn)，比如海洋污染造成的對(duì)魚油安全性的擔(dān)憂，魚油質(zhì)量會(huì)隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點(diǎn)的不同而不同，含epa、易受環(huán)境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來(lái)源的dha作為一種食品添加劑的應(yīng)用。尤其是考慮到dha的主要消費(fèi)者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔(dān)憂；此外，世界漁業(yè)資源的逐年萎縮對(duì)dha的可持續(xù)性供應(yīng)的影響也值得考慮。微藻中寇氏隱甲藻由于其快速的生長(zhǎng)速率及較高的dha含量、幾乎不含其它不飽和多脂肪酸等副產(chǎn)物、易于在實(shí)驗(yàn)室條件下大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，相關(guān)的研究也越來(lái)越深入，并逐漸可以替代傳統(tǒng)的從魚類產(chǎn)品中直接提取dha的方法。隱甲藻作為一種原始的真核單細(xì)胞微藻，其生長(zhǎng)周期可粗劃分為細(xì)胞生長(zhǎng)階段和穩(wěn)定時(shí)期，其中穩(wěn)定期是隱甲藻積累dha的主要階段。然而，目前隱甲藻的基因組信息尚未公布，其dha的合成途徑尚不明確，限制了工程改造寇氏隱甲藻的各種努力。在這種情況下，denovo轉(zhuǎn)錄組，又稱為從頭測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生。該方法不需要任何現(xiàn)有基因組信息，就可以對(duì)某個(gè)物種的全部轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼接，組裝，從而獲得該物種的全部轉(zhuǎn)錄本的序列信息以及不同條件下表達(dá)響應(yīng)過(guò)程。因此，利用denovo轉(zhuǎn)錄組來(lái)解析隱甲藻中dha的生物合成途徑，特別是脂肪酸去飽和催化機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步提高隱甲藻中dha含量具有重要指導(dǎo)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是利用二代測(cè)序技術(shù)illumina/solexa系統(tǒng)，對(duì)寇氏隱甲藻(crypthecodiniumcohnii)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行denovo深度測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，得到該物種轉(zhuǎn)錄組中全部與dha合成相關(guān)的基因序列(全長(zhǎng)或部分)。最終鑒定出dha積累期在轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)量顯著變化的、和dha生物合成相關(guān)的功能基因。其過(guò)程主要包括如下步驟：(1)對(duì)隱甲藻進(jìn)行dha合成的發(fā)酵培養(yǎng)：將隱甲藻在含有2.0g/l酵母提取物，9.0g/l葡萄糖，25.0g/l的海水鹽的培養(yǎng)基中25℃靜態(tài)培養(yǎng)生長(zhǎng)3-5天。然后以10％(v/v)的菌種接種量，接種到含50ml培養(yǎng)基(2.0g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽和9.0g/l葡萄糖)的250毫升錐形瓶中，并在搖床上培育2天(轉(zhuǎn)速為180rpm，25℃)。隨后放大接種到含100ml培養(yǎng)基(7.5g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽，27.0g/l葡萄糖)的500毫升錐形瓶中，并在搖床上培養(yǎng)三天后用于接種7.5升的生物反應(yīng)器。最終以20％(v/v)的菌種接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)(7.5g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽，27.0g/l葡萄糖)，并按照前60小時(shí)內(nèi)c：n質(zhì)量比2:1補(bǔ)料，之后改為10：1補(bǔ)料。并始終將葡萄糖含量控制在15-25g/l，溶氧控制在30％，溫度25℃。(2)rna提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：①細(xì)胞收集：在48h，72h和96h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得不同油脂積累階段在48h，72h和96h的od490值，按照od490＝5收集細(xì)胞；在4℃，7,500-8,000rpm條件下離心10min，棄去上清，之后迅速放入液氮中冷卻。②rna的提?。豪靡旱心シ▽?duì)步驟(2)①收集到的菌體細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，并保證在研磨過(guò)程中始終存在液氮。隨后將研磨好的菌體分別加入到1.5ml離心管中，利用rneasyplantminikit試劑盒和dnasei對(duì)隱甲藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行純化提取。③測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建：利用nanodrop和1％的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟(2)②獲得的各樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并利用ribo-zerotmrrnaremovalkit(plantleaf)對(duì)質(zhì)量檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行核糖體rna的去除。隨后利用protoscriptii反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及actinomycind對(duì)第一條cdna鏈進(jìn)行合成，利用secondstrandsynthesisenzymemix對(duì)第二條cdna鏈進(jìn)行合成。隨后將axyprepmagpcrclean-up(axygen)純化后的雙鏈cdna進(jìn)行末端修復(fù)與a尾的連接，并收集長(zhǎng)度至360bp之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。③文庫(kù)測(cè)序：根據(jù)測(cè)序儀illuminahiseq2500的說(shuō)明，步驟(2)③獲得的各樣品進(jìn)行2*150bp的paired-end(pe)測(cè)序，其中圖像分析與堿基判斷根據(jù)hiseqcontrolsoftware(hcs)+olb+gapipeline-1.6(illumina)完成，共計(jì)產(chǎn)生214,142,690條原始的reads。(3)數(shù)據(jù)分析與處理：①測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：利用ngsqctoolkit軟件對(duì)步驟(2)獲得的各個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾：1：去除引物序列；2：去除read5’端前5bp的堿基；3：去除read3’端質(zhì)量值低于30的堿基。②數(shù)據(jù)拼接：利用trinity軟件對(duì)步驟(3)①獲得的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行合并進(jìn)行denovo拼接，其中min_cov參數(shù)設(shè)置為2，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。③定量分析與過(guò)濾：利用rsem軟件分別將步驟(3)①獲得的樣品數(shù)據(jù)比對(duì)到步驟(3)②得到的拼接結(jié)果中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析。隨后將潛在的噪音序列(在三個(gè)樣本中最大fpkm值小于1，或最大比對(duì)reads數(shù)小于10的轉(zhuǎn)錄本剔除)，最終得到87,911個(gè)轉(zhuǎn)錄本和82,106個(gè)unigenes。隨后利用transdecoder軟件對(duì)潛在的編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。(4)基因功能注釋與統(tǒng)計(jì)分析：①功能注釋：利用blast軟件對(duì)對(duì)步驟(3)③獲得的轉(zhuǎn)錄本在nr,nt,kegg,swissport和go等數(shù)據(jù)庫(kù)中以e-value<1e-5為閾值進(jìn)行功能注釋。根據(jù)注釋信息，篩選到大量的脂肪酸去飽和酶的序列信息及相對(duì)表達(dá)量。②相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析：用r軟件對(duì)步驟(4)①獲得的各樣本中的脂肪酸去飽和酶相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，找到各樣本和脂肪酸去飽和酶表達(dá)的關(guān)系；在對(duì)應(yīng)分析圖中，樣品點(diǎn)相互之間距離越近，說(shuō)明樣本的相似度越大，距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣本差異越大；同時(shí)，圖中各個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本用黑色三角表示，距離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄本，其在不同樣本中的表達(dá)差異就越大；通過(guò)將得分圖與載荷圖疊加，得到一個(gè)二維散點(diǎn)圖，其中分布在樣本周圍的轉(zhuǎn)錄本，為該樣本中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，可被認(rèn)為是與dha生物合成相關(guān)的重要候選脂肪酸去飽和酶基因。從圖3可以看出分布在樣品周圍為該樣品中較其他樣品表達(dá)差異明顯的轉(zhuǎn)錄本，分布在48h(生長(zhǎng)階段)，72h(飽和脂肪酸積累階段)和96h(不飽和脂肪酸積累階段)樣品周圍的轉(zhuǎn)錄本可視為與dha生物合成密切相關(guān)的基因。因此，編碼delta-5fattyaciddesaturase(delta-5位脂肪酸去飽和酶)的tr16340|c2_g1_i2，編碼delta-9fattyaciddesaturase(delta-9位脂肪酸去飽和酶)的轉(zhuǎn)錄本tr63320|c0_g2_i1和編碼acyl-coadesaturase(乙酰輔酶a去飽和酶)的tr20109|c0_g1_i1的轉(zhuǎn)錄本可能與隱甲藻脂肪酸積累以及dha合成有關(guān)；同時(shí)，編碼delta-6fattyaciddesaturase(delta-6位脂肪酸去飽和酶)的轉(zhuǎn)錄本tr9998|c0_g1_i1和隱甲藻不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)換階段具有重要作用，該基因可被認(rèn)為是隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)的重要候選脂肪酸去飽和酶基因。(5)qrt-pcr驗(yàn)證以轉(zhuǎn)錄組樣本測(cè)序的cdna為模板，利用primerexpress軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行qrt-pcr驗(yàn)證。qrt-pcr反應(yīng)體系配置如下：設(shè)置qrt-pcr反應(yīng)程序:溶解曲線程序:程序完成之后，采用steponeplus分析軟件對(duì)qrt-pcr數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用18srrna內(nèi)參基因和目標(biāo)基因之間的△ct差值，計(jì)算基因直接的相對(duì)表達(dá)量。從圖5的結(jié)果顯示，qrt-pcr與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果相關(guān)系數(shù)均大于0.65，其中tr9998|c0_g1_i1在96h上調(diào)3倍，證實(shí)tr9998|c0_g1_i1是隱甲藻中dha生物合成的一個(gè)重要標(biāo)記基因。本發(fā)明的實(shí)施方案是選用來(lái)自美國(guó)菌株保藏中心atcc的寇氏隱甲藻(菌株代碼atcc30556)為試材，運(yùn)用illumina/solexa轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序獲得隱甲藻dha合成相關(guān)基因，并進(jìn)而驗(yàn)證該基因的變動(dòng)以及與dha生物合成的關(guān)系。該方法除通量大、速度快、成本低的優(yōu)點(diǎn)外，還可應(yīng)用于無(wú)全基因組背景的物種的研究上；此外，該方法產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)經(jīng)qrt-pcr驗(yàn)證可靠，可以為后續(xù)深入研究隱甲藻的其他特定代謝提供信息依據(jù)。針對(duì)本發(fā)明中鑒定的寇氏隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)脂肪酸去飽和酶基因tr9998|c0_g1_i1(delta-6fattyaciddesaturase)，可利用基因工程的原理，將其在寇氏隱甲藻中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，從而達(dá)到改善提高寇氏隱甲藻中油脂及dha含量的效果。本發(fā)明從蔻氏隱甲藻成功地分離獲得了在dha積累階段下表達(dá)量明顯上升的基因tr9998|c0_g1_i1(delta-6fattyaciddesaturase)，這給利用基因工程手段進(jìn)一步提高隱甲藻dha合成能力提供了方向和靶點(diǎn)。以上概括地描述了本發(fā)明，可通過(guò)參照本文提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。附圖說(shuō)明圖1為隱甲藻在dha發(fā)酵培養(yǎng)中的生長(zhǎng)曲線與葡萄糖消耗曲線。圖2為隱甲藻不同發(fā)酵階段的總油脂和dha的含量和百分比變化。圖中總油脂和dha百分比含量與48小時(shí)樣本具有顯著差別時(shí)，我們用“*”進(jìn)行了標(biāo)記。圖3為隱甲藻中脂肪酸去飽和酶的對(duì)應(yīng)分析得分圖與載荷圖的重疊二維圖。各樣本名稱分別用不同顏色進(jìn)行了標(biāo)記，每個(gè)灰色字體表示轉(zhuǎn)錄組拼接后的自動(dòng)獲得的id號(hào)。x軸和y軸分別表示了對(duì)應(yīng)分析的第一維和第二維。圖4為隱甲藻中脂肪酸去飽和酶催化反應(yīng)的機(jī)制。紅色箭頭表示在發(fā)酵后期發(fā)生差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。圖5為qrt-pcr與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的表達(dá)相關(guān)性。a)72小時(shí)與48小時(shí)樣本比較；b)96小時(shí)與48小時(shí)樣本的比較。橫軸表示rna測(cè)序結(jié)果差異倍數(shù)的log2轉(zhuǎn)換值，縱軸表示qrt-pcr結(jié)果差異表達(dá)倍數(shù)的log2轉(zhuǎn)換值，兩者之間的相關(guān)系數(shù)在圖的右下角展示。誤差線表示重復(fù)樣之間的標(biāo)準(zhǔn)差。圖6、圖7和圖8為序列表。具體實(shí)施方式表1為隱甲藻中鑒定到的脂肪酸去飽和酶基因在不同樣本中的表達(dá)情況。表2為驗(yàn)證基因表達(dá)所使用的qrt-pcr的引物。下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。本發(fā)明各實(shí)施例使用的寇氏隱甲藻(crypthecodiniumcohnii)，該菌購(gòu)自美國(guó)菌株保藏中心atcc，菌株代碼atcc30556。選擇寇氏隱甲藻(crypthecodiniumcohnii)為實(shí)驗(yàn)材料僅是作為例證，證明此方法可以成功地應(yīng)用于寇氏隱甲藻脂肪酸去飽和酶的發(fā)現(xiàn)和鑒定，但本發(fā)明同樣可以應(yīng)用于其他微生物應(yīng)用于其他相關(guān)生物產(chǎn)物關(guān)鍵基因的尋找。實(shí)施例1鑒定隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)脂肪酸去飽和酶基因的方法，包括如下步驟：(1)對(duì)隱甲藻進(jìn)行dha合成的發(fā)酵培養(yǎng)：將隱甲藻在含有2.0g/l酵母提取物，9.0g/l葡萄糖，25.0g/l的海水鹽的培養(yǎng)基中25℃靜態(tài)培養(yǎng)生長(zhǎng)3-5天。然后以10％(v/v)的菌種接種量，接種到含50ml培養(yǎng)基(2.0g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽和9.0g/l葡萄糖)的250毫升錐形瓶中，并在搖床上培育2天(轉(zhuǎn)速為180rpm，25℃)。隨后放大接種到含100ml培養(yǎng)基(7.5g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽，27.0g/l葡萄糖)的500毫升錐形瓶中，并在搖床上培養(yǎng)三天后用于接種7.5升的生物反應(yīng)器。最終以20％(v/v)的菌種接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐培養(yǎng)(7.5g/l酵母提取物，25.0g/l海鹽，27.0g/l葡萄糖)，并按照前60小時(shí)內(nèi)c：n質(zhì)量比2:1補(bǔ)料，之后改為10：1補(bǔ)料。并始終將葡萄糖含量控制在15-25g/l，溶氧控制在30％，溫度25℃。(2)rna提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：①細(xì)胞收集：在48h，72h和96h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得不同油脂積累階段在48h，72h和96h的od490值，按照od490＝5收集細(xì)胞；在4℃，7,500-8,000rpm條件下離心10min，棄去上清，之后迅速放入液氮中冷卻。②rna的提?。豪靡旱心シ▽?duì)步驟(2)①收集到的菌體細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，并保證在研磨過(guò)程中始終存在液氮。隨后將研磨好的菌體分別加入到1.5ml離心管中，利用rneasyplantminikit試劑盒和dnasei對(duì)隱甲藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行純化提取。③測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建：利用nanodrop和1％的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟(2)②獲得的各樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并利用ribo-zerotmrrnaremovalkit(plantleaf)對(duì)質(zhì)量檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行核糖體rna的去除。隨后利用protoscriptii反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及actinomycind對(duì)第一條cdna鏈進(jìn)行合成，利用secondstrandsynthesisenzymemix對(duì)第二條cdna鏈進(jìn)行合成。隨后將axyprepmagpcrclean-up(axygen)純化后的雙鏈cdna進(jìn)行末端修復(fù)與a尾的連接，并收集長(zhǎng)度至360bp之內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。③文庫(kù)測(cè)序：根據(jù)測(cè)序儀illuminahiseq2500的說(shuō)明，步驟(2)③獲得的各樣品進(jìn)行2*150bp的paired-end(pe)測(cè)序，其中圖像分析與堿基判斷根據(jù)hiseqcontrolsoftware(hcs)+olb+gapipeline-1.6(illumina)完成，共計(jì)產(chǎn)生214,142,690條原始的reads。(3)數(shù)據(jù)分析與處理：①測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：利用ngsqctoolkit軟件對(duì)步驟(2)獲得的各個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾：1：去除引物序列；2：去除read5’端前5bp的堿基；3：去除read3’端質(zhì)量值低于30的堿基。②數(shù)據(jù)拼接：利用trinity軟件對(duì)步驟(3)①獲得的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行合并進(jìn)行denovo拼接，其中min_cov參數(shù)設(shè)置為2，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。③定量分析與過(guò)濾：利用rsem軟件分別將步驟(3)①獲得的樣品數(shù)據(jù)比對(duì)到步驟(3)②得到的拼接結(jié)果中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析。隨后將潛在的噪音序列(在三個(gè)樣本中最大fpkm值小于1，或最大比對(duì)reads數(shù)小于10的轉(zhuǎn)錄本剔除)，最終得到87,911個(gè)轉(zhuǎn)錄本和82,106個(gè)unigenes。隨后利用transdecoder軟件對(duì)潛在的編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。(4)基因功能注釋與統(tǒng)計(jì)分析：①功能注釋：利用blast軟件對(duì)對(duì)步驟(3)③獲得的轉(zhuǎn)錄本在nr,nt,kegg,swissport和go等數(shù)據(jù)庫(kù)中以e-value<1e-5為閾值進(jìn)行功能注釋。根據(jù)注釋信息，篩選到大量的脂肪酸去飽和酶的序列信息及相對(duì)表達(dá)量。②相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析：用r軟件對(duì)步驟(4)①獲得的各樣本中的脂肪酸去飽和酶相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，找到各樣本和脂肪酸去飽和酶表達(dá)的關(guān)系；在對(duì)應(yīng)分析圖中，樣品點(diǎn)相互之間距離越近，說(shuō)明樣本的相似度越大，距離越遠(yuǎn)，說(shuō)明樣本差異越大；同時(shí)，圖中各個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本用黑色三角表示，距離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄本，其在不同樣本中的表達(dá)差異就越大；通過(guò)將得分圖與載荷圖疊加，得到一個(gè)二維散點(diǎn)圖，其中分布在樣本周圍的轉(zhuǎn)錄本，為該樣本中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，可被認(rèn)為是與dha生物合成相關(guān)的重要脂肪酸去飽和酶基因。從圖3可以看出分布在樣品周圍為該樣品中較其他樣品表達(dá)差異明顯的轉(zhuǎn)錄本，分布在48h(生長(zhǎng)階段)，72h(飽和脂肪酸積累階段)和96h(不飽和脂肪酸積累階段)樣品周圍的轉(zhuǎn)錄本可視為與dha生物合成密切相關(guān)的基因。因此，編碼delta-5fattyaciddesaturase的tr16340|c2_g1_i2,編碼delta-9fattyaciddesaturase的轉(zhuǎn)錄本tr63320|c0_g2_i1和編碼acyl-coadesaturase的tr20109|c0_g1_i1的轉(zhuǎn)錄本可能與隱甲藻脂肪酸積累以及dha合成有關(guān)；同時(shí)，編碼delta-6fattyaciddesaturase的轉(zhuǎn)錄本tr9998|c0_g1_i1和隱甲藻不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)換階段具有重要作用，該基因可被認(rèn)為是隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)的重要脂肪酸去飽和酶基因。(5)qrt-pcr驗(yàn)證以轉(zhuǎn)錄組樣本測(cè)序的cdna為模板，利用primerexpress軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，進(jìn)行qrt-pcr驗(yàn)證。qrt-pcr反應(yīng)體系配置如下：設(shè)置qrt-pcr反應(yīng)程序:溶解曲線程序:程序完成之后，采用steponeplus分析軟件對(duì)qrt-pcr數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用18srrna內(nèi)參基因和目標(biāo)基因之間的△ct差值，計(jì)算基因直接的相對(duì)表達(dá)量。從圖5的結(jié)果顯示，qrt-pcr與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果相關(guān)系數(shù)均大于0.65，其中tr9998|c0_g1_i1在96h上調(diào)3倍，證實(shí)tr9998|c0_g1_i1是隱甲藻中dha生物合成的一個(gè)重要標(biāo)記基因。綜上所述，本發(fā)明為今后進(jìn)一步鑒定與dha的生物合成相關(guān)的標(biāo)記基因，提供了可行的技術(shù)路線和關(guān)鍵的理論基礎(chǔ)。表1：實(shí)施例1隱甲藻中脂肪酸去飽和酶基因的種類及表達(dá)量表2:驗(yàn)證基因表達(dá)使用的qrt-pcr引物primernameprimer18srrna-fgccttcgctggtcgtgtag18srrna-rcatgcctgcttgaaacactctaatr9998|c0_g1_i1-ftgaagcccatcggaggaatr9998|c0_g1_i1-rattgaatcggtcttctgcctcttsequencelisting<110>昆明藻能生物科技有限公司<120>采用denovo轉(zhuǎn)錄組分析鑒定隱甲藻中與dha生物合成相關(guān)的脂肪酸去飽和酶基因的方法<130>2017.02.24<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>1983<212>dna<213>蔻氏隱甲藻<400>1caagtgcagctgctcttccaatcggctcagacaaggatctgcagtcgatttcgtatcttc60ccgcccttgttcttggctatcctcctccctgccttgcttgggaaggggcaaatactttgc120cttgtatcgagatgattcttcaacgatggtccgacaggtttccggcaatgaagttgcact180gtaaccttccgtcgttcttggggcttcaggctctttgtggaggagtcgccttggcttgcg240aattgaatcggtcttctgcctcttcggagccagcgcatgtgcgcttcctccgatgggctt300caatcgcctccggttcatcgctcgcccttcagttggcgatcagctacatgggcttggaag360ctccatttcacaaagagtgggaggagaacaaagatccaaacatgactttccgggaggagc420agggcaagacgaaattagtgcctctgatccccaagcccaaggtcggcgagctcccctcca480ctccgtacaccaaagaggaggtggccaagcacgacagtcgagaggacgcttgggttgtca540tcaatggctacgtctatgacgtcagccgttttgtcgagaagcatccaggtggctggttgc600ctattgtcaacatggccggcaaagattgtaccgatgcgtttgaaaactaccacccagcaa660aggtgacaacacacatgttgccttgctattgcgtgggcaagttgacggactacacggtgg720ctcctcatgtggccgaattcagagcagtgcgacaggaattgttgaggagaggttggttcg780aaactgatatgcgtttttattggaagatcggtacgtcgctcttcttcgaattcgtctctg840ctttgtacctcagccttgggggcacgaatgtgcctacacgcttggctggtggttttttga900tgggaattttctggcagcagctggccggtatcggccacgacttcggccacgccgagggca960cccatgtcatgatggtcgatcacgccatcagctctttctgctcttcattgatgggcctct1020ccacgtgctggtggaagcgtaaccacaattgtcatcacgtgacttgcaattcggtggaac1080acgaccctgacatccagcacatgcccatccttgctgtgacaccgaagattttcgcaaagc1140ctttttggtcgacgtactacaagaagtgggtctccatggacgctctcgcgaggctcctgg1200tgagctaccagcacctcgtcttctatcccatgatgtgtctggccaggttcaacctgtacc1260aattatcgtggaggcagttgctctcctcggagccaatccactaccgaaaaactgagatct1320gtggcatgctcatttacctcggctgggtggcgaaagtggccttgtcaatgtcgtctcctg1380cggagagcattggctggctctttatctcccatgcctctgcgggactgctgcatgtgcaga1440ttgtcgtgtcgcattgggcaatggctacatatcatggtcatgcctataatgatgataagg1500acgagtggtatacaacccagatcaagacgaccatgaacgtcttgactcccgagtggttgg1560actgggttcacatcggcttgcagtatcagatcgaacatcacttgatgccacgcttgcctc1620ggcagaagttccggaaggtcacggagatggtgcagcctatctgtgaaaagtacgacattc1680cctaccactatgttgatttctaccaggccaacaaagaaaccattctcgcgctcaaagaaa1740cagcccaacacgctcggcactcgaagcgtggatcgcacggtttctatgagagtgcattat1800gggatggaatgcagttggtcggctgagagggctgccttttctgttcgtcatcatcatctt1860tggtggtgcatattggaattcatgcgaagtgcaccgacacttgcataggaacaaatcatg1920tactttttgctcatgtcgccctccgcacagtttagaatcagcagaacgctgaacagccag1980tcg1983<210>2<211>658<212>prt<213>寇氏隱甲藻<400>2seralaalaalaleuproileglyserasplysaspleuglnserile151015sertyrleuproalaleuvalleuglytyrproproprocysleuala202530trpgluglyalaasnthrleuprocysileglumetileleuglnarg354045trpseraspargpheproalametlysleuhiscysasnleuproser505560pheleuglyleuglnalaleucysglyglyvalalaleualacysglu65707580leuasnargserseralasersergluproalahisvalargpheleu859095argtrpalaserilealaserglyserserleualaleuglnleuala100105110ilesertyrmetglyleuglualaprophehislysglutrpgluglu115120125asnlysaspproasnmetthrpheargglugluglnglylysthrlys130135140leuvalproleuileprolysprolysvalglygluleuproserthr145150155160protyrthrlysglugluvalalalyshisaspserarggluaspala165170175trpvalvalileasnglytyrvaltyraspvalserargphevalglu180185190lyshisproglyglytrpleuproilevalasnmetalaglylysasp195200205cysthraspalaphegluasntyrhisproalalysvalthrthrhis210215220metleuprocystyrcysvalglylysleuthrasptyrthrvalala225230235240prohisvalalaglupheargalavalargglngluleuleuargarg245250255glytrpphegluthraspmetargphetyrtrplysileglythrser260265270leuphephegluphevalseralaleutyrleuserleuglyglythr275280285asnvalprothrargleualaglyglypheleumetglyilephetrp290295300glnglnleualaglyileglyhisasppheglyhisalagluglythr305310315320hisvalmetmetvalasphisalaileserserphecysserserleu325330335metglyleuserthrcystrptrplysargasnhisasncyshishis340345350valthrcysasnservalgluhisaspproaspileglnhismetpro355360365ileleualavalthrprolysilephealalysprophetrpserthr370375380tyrtyrlyslystrpvalsermetaspalaleualaargleuleuval385390395400sertyrglnhisleuvalphetyrprometmetcysleualaargphe405410415asnleutyrglnleusertrpargglnleuleusersergluproile420425430histyrarglysthrgluilecysglymetleuiletyrleuglytrp435440445valalalysvalalaleu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